SARS-CoV-2、インフルエンザA/B、MERS-CoVを検出するためのマルチプレックスリアルタイムRT-qPCRアッセイの開発

このアッセイの全体的な目標は、SARS-CoV-2、MERS、インフルエンザA、インフルエンザBなどの一般的に循環する呼吸器ウイルスの同時検出のためのマルチプレックスアプローチを管理することです.私たちの分野での進歩を推進する一般的な技術には、CRISPR、ラテラルフローアミノアッセイ、紙ベースの生体分子センサー、ワンポットでのシャーロックテスト、DNAアプタマー、ループ媒介等温増幅と統合されたマルチプレックスRT-qPCRが含まれます。 ランプ。しかし、マルチプレックスRT-qPCRは最も感度が高く、一般的であり、さまざまなウイルスを診断するためのゴールドスタンダードです。現在の実験上の課題は、わずか10コピーのRNAコピーを検出するために使用できるプロトコルを確立することです。

アッセイには社内のRT-qPCRキットを使用しましたが、これは時間と費用対効果が高いです。まず、DNA / RNAフリーの水でRT-qPCR用の2xバッファーを準備します バッファーは、さらに使用するまで摂氏マイナス20度で保存します。次に、プライマーとプローブを1.5ミリリットルのチューブで混合します。

溶出バッファーで容量を補い、チューブをマイナス20°Cで保存します。taqポリメラーゼとMMLV-RTを1.5ミリリットルのチューブに入れた氷上の酵素ミックスを調製します。taqポリメラーゼ保存バッファーで容量を補います。

次に、ウイルス合成RNAを100マイクロリットルのTris-EDTAバッファーを含む別々のチューブに再懸濁して、マイクロリットルあたり10〜6番目のRNAコピーのストックを作成します。ウイルスストックを混合するには、SARS-CoV-2、インフルエンザAおよびBのそれぞれ5マイクロリットルをTris-EDTAバッファー50マイクロリットルに追加します。同様に、SARS-CoV-2とMERS-CoVを混合して、2番目のウイルスミックスを得ます。

両方の混合物を10倍に希釈して、1マイクロリットルあたり10 RNAコピーの最終希釈を得ます。96ウェルプレートの各ウェルに、2xバッファー、プライマー、酵素、DNA/RNAフリー水、および対応するRNA混合物をピペットで取り付けます。プレートを粘着プレートシールでシールします。

次に、プレートを1分間遠心分離して、ウェル底に液体を収集します。次に、実験タイプを標準曲線に設定した高速96ウェルブロックタイプを受け入れるようにPCRマシンをプログラムします。試薬を TaqMan 試薬に設定し、標準分析プロパティを選択します。

遺伝子ターゲットとレポーター色素を定義します。次に、試験する各反応のサンプル名を定義し、ターゲットとサンプルをプレートレイアウトに割り当てます。次に、サイクルプログラムを機器に入力します。

プレートを正しい向きでリアルタイムQPCR装置に移し、ランを押してサイクルを開始します。実験データを保存するファイルの場所を選択します。次に、QPCR プログラムによって提供される増幅プロットを調べます。

開発した2つのキットは、3つの標的遺伝子すべてを同時に増幅することに成功し、1反応あたり10個のRNAコピーしか検出できませんでした。すべてのウイルス滴定の増幅効率は 99% を超えていました