この研究は、キング・アブドゥッラー科学技術大学(King Abdullah University of Science and Technology)が中核資金とS.M.H.へのNational Term Grand Challenge(NTGC)を通じて支援しました。

1. Taqポリメラーゼの発現と精製
<ol><li>酵素のC末端に切断可能なヘキサ-ヒスチジンタグを有するプラスミドを構築します。</li>
	<li>発現ベクター50ngを標準プロトコル38に従って大腸菌BL21-(DE3)株に形質転換する。</li>
	<li>37°Cでそれぞれ2Lの2YT培地ブロスが入った4つの6Lフラスコに、OD 600が0.8または細胞番号6.4 x 108 に達するまで170rpmで振とうしながら、形質転換細胞を接種します。</li>
	<li>0.5 mM のイソプロピル-β-d-チオガラクトピラノシド(IPTG)で Taq ポリメラーゼ発現を誘導し、さらに 16 °C で 18 時間振とうしながらインキュベートします。</li>
	<li>細胞を4°C、7808 x g で10分間スピンダウンして回収します。ペレットを200 mLの氷冷Taqポリメラーゼ溶解バッファー(表1)に再懸濁し、5 mL/gの細胞ペレットに再懸濁します。</li>
	<li>細胞をリゾチーム(2 mg/mLの溶解緩衝液)およびプロテアーゼ阻害剤で45分間インキュベートした後、ライセートを30 kPsiの細胞破壊剤に通し、22,040 x g で4°Cで30分間遠心分離して細胞破片を分離します。</li>
	<li>上清を85°Cで15分間加熱します。 95,834 x g で 4 °C で 1 時間スピンダウンします。 上澄み液を回収し、0.45μmフィルターで氷上でろ過します。</li>
	<li>まず、Taq ポリメラーゼバッファー A を使用して Ni-NTA HP 5 mL カラムに 4 mL/分の流速でサンプルを通し、高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)を使用してタンパク質精製を行います(表 2;図1A)。</li>
	<li>10カラム容量(CV)のTaqポリメラーゼバッファーAと4%のTaqポリメラーゼバッファーBで洗浄します(表2)。100 mLボトルに20 CVを超えるTaqポリメラーゼバッファーBを使用して、線形グラジエントで結合タンパク質を溶出します。</li>
	<li>100 mL ボトル内の溶離液を、Taq ポリメラーゼバッファー C を使用して、陽イオン交換 5 mL カラムに 4 mL/分で通します(表 2;図1A)。</li>
	<li>20 CV の 100% Taq ポリメラーゼバッファー C と 5% Taq ポリメラーゼバッファー D で洗浄します(表 2)。</li>
	<li>TaqポリメラーゼバッファーD(表2)を用いて、5%から100%までの直線状グラジエントで溶出します。</li>
	<li>前述したように、SDS-PAGEゲル電気泳動 39 と続いてゲル染色 40 を行うことにより、溶出画分を確認します。簡単に説明すると、各フラクションを10 μL取り、等量の2x SDSローディング色素を加えます。サンプルを90°Cで10分間変性させます。サンプルを10% SDS-PAGEゲルにロードし、200 Vで25分間ゲルを泳動させ、クマシーブリリアントブルーを使用してゲルを染色し、脱色します。</li>
	<li>精製したTaqポリメラーゼを含むすべてのフラクションを回収し、Taqポリメラーゼ保存バッファー(表3)に対して4°Cで透析します。 簡単に説明すると、2Lの保存バッファーを調製し、透析カセットをバッファーに2分間浸して水和させます。採取したフラクションをニードルを使用して透析カセットに注入し、攪拌機で200rpmの透析バッファーに一晩放置します。</li>
	<li>透析後、分光光度計を用いてタンパク質濃度を測定し、10μLの分注を行い、液体窒素中で急速凍結し、-80°Cで保存する。 注:FPLCシステムにロードする前に、0.45 μmフィルターを使用して精製用のすべてのバッファーをろ過してください。</li>
</ol>2. 昆虫細胞発現系におけるMMLV-RT発現と精製
<ol><li>バクミドDNAの生成と単離<ol><li>前述のように、C末端切断可能なTEV-8xHis-StrepタグでMMLV-RTの配列をクローニングする41。</li>
		<li>100 ng の発現ベクターを 50 μL の DH10Bac 細胞に混合し、チューブを軽くたたいて穏やかに混合します。</li>
		<li>細胞を氷上で15分間インキュベートします。セルを42°Cで1分間ヒートショックします。</li>
		<li>直ちに氷上に移し、400 μLのS.O.C培地を添加します。37°Cで4時間振とうしながらインキュベートします。</li>
		<li>10μLおよび15μLの混合物を、3つの抗生物質を含むLB寒天プレートにプレートします。50 μg/mL のカナマイシン、10 μg/mL のテトラサイクリン、7 μg/mL のゲンタマイシン、40 μg/mL の IPTG および 100 μg/mL の X-Gal を青白選択用。</li>
		<li>プレートを37°Cで48時間インキュベートします。いくつかの白いコロニーと1つの青いコロニーをコントロールとして選び、上記の抗生物質を含む新鮮なLB寒天プレートにそれらを再ストリークします。プレートを37°Cで一晩インキュベートします。</li>
		<li>白色の表現型を確認したら、いくつかのコロニーを選び、50 mLチューブに50 μg/mLのカナマイシン、10 μg/mLのテトラサイクリン、および7 μg/mLのゲンタマイシンを含む10 mLのLB培地に接種します。</li>
		<li>培養液を37°Cでインキュベートし、170rpmで一晩振とうします。細胞を22,040 x g で10分間スピンダウンしてペレット化します。</li>
		<li>上清をデカントし、ミニプレップキットから250 μLの再懸濁液にペレットを再懸濁し(この溶液はメーカーの指示に従って取り扱う必要があります)、溶液を1.5 mLの微量遠心チューブに移します。</li>
		<li>250 μLの溶解溶液を加え、穏やかに混合し、3分間インキュベートします。350 μLの中和液を加え、2x-3xを反転させ、22,040 x g で10分間遠心分離します。</li>
		<li>上清を新しいチューブに移し、等量の氷冷イソプロパノールを加え、-20°Cで30分間インキュベートします。</li>
		<li>沈殿したDNAを22,040 x g で10分間スピンしてペレット化します。上清を捨て、700μLの70%氷冷エタノールでペレットを2回洗浄します。</li>
		<li>ペレットに触れずにピペットで上清を取り除きます。ペレットを層流フードで5〜10分間、またはチューブ内に液体が見えなくなるまで風乾させます。ペレットを100μLのEBバッファーに溶解します。</li>
	</ol></li>
	<li>バクミドトランスフェクションとウイルス増幅<ol><li>P1ウイルス調製<ol><li>6ウェル組織培養プレートで、2mLの昆虫細胞培養培地にシード~9 x 105 細胞/ウェルをシードします。</li>
			<li>プレートを室温で~30分間インキュベートし、細胞を接着させます。</li>
			<li>バクミド/フジーンミックスを次のように調製します:1本のチューブに1μgのバクミドDNAと300μLの昆虫細胞培地を混合します。別のチューブで、8 μLのトランスフェクション試薬と300 μLの昆虫細胞培地を混合します。穏やかなピペッティングで両方の混合物を混合し、バクミド/トランスフェクション試薬複合体を形成するまで室温で~30分間放置します。</li>
			<li>バクミド錯体混合物(~210 μL)を各ウェルに滴下し、プレートを透明フィルムで密封します。</li>
			<li>プレートを27°Cで3〜4日間インキュベートします。</li>
			<li>ウイルスを含む培地を採取し、FBS(最終濃度2%)を添加し、0.45μmフィルターでろ過し、P1ウイルスストックとして暗所で4°Cで保存します。</li>
		</ol></li>
		<li>P2ウイルス製剤<ol><li>培養フラスコに50 mLの昆虫細胞を2 x 106 細胞/mLで3 mLのP1ウイルスをトランスフェクションします。</li>
			<li>死細胞の割合が25%〜30%に達するまで、100rpmで4〜6日間振とうしながら27°Cでインキュベートします。</li>
			<li>300 x g で10分間遠心分離し、ウイルスを含む上清を回収します。</li>
			<li>FBSを最終濃度2%になるように添加し、0.45 μmフィルターでろ過し、それぞれ1 mLを分注し、P2ウイルスストックとして-80°Cで保存します。</li>
		</ol></li>
		<li>P3ウイルス調製<ol><li>100 mLの昆虫細胞を2 x 106 細胞/mLで培養フラスコに2 mLのP2ウイルスをトランスフェクションします。</li>
			<li>死細胞の割合が15%〜20%に達するまで、100rpmで3〜4日間振とうしながら27°Cでインキュベートします。</li>
			<li>細胞を300 x g で10分間遠心分離し、ウイルスを含む上清を回収します。</li>
			<li>FBSを最終濃度2%に添加します。0.45μmのフィルターでろ過します。4°Cの暗所で1ヶ月間保存できます。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>昆虫細胞におけるMMLV-RTの発現と精製<ol><li>5 mLのP3ウイルスを、合計6フラスコに2 x 106 細胞/mL(700 mL/2Lフラスコ)の密度で新鮮な昆虫細胞に加えます。</li>
		<li>トランスフェクション後55〜60時間、7808 x gで10分間回転させて細胞を回収します。</li>
		<li>細胞ペレットを200 mLのMMLV-RT溶解バッファーに再懸濁します(表4)。ライセートを 15 kPsi の細胞破壊物質に通し、22,040 x g で 4 °C で 30 分間遠心分離します。</li>
		<li>上清を新しいチューブに移し、95,834 x g 、4°C、1時間スピンダウンします。上澄み液を回収し、0.45μmフィルターで氷上でろ過します。</li>
		<li>まず、MMLV-RTバッファーA(表5)を使用して、サンプルをNi-NTA Excel 5 mLカラム(図1B)に4 mL/minの流速で通すことにより、FPLCを使用したタンパク質精製を開始します。</li>
		<li>10 CV の MMLV-RT バッファー A と 4% の MMLV-RT バッファー B でカラムを洗浄し(表 5)、100 mL ボトルに MMLV-RT バッファー B の直線グラジエントで 20 CV 以上タンパク質を溶出します。</li>
		<li>溶出したサンプルを、MMLV-RTバッファーC(表5)で平衡化したStrep 5 mLカラム(図1B)に通します。</li>
		<li>10 CV の 100% MMLV-RT バッファー C でカラムを洗浄し、20 CV のバッファー D で線形グラジエントでタンパク質を溶出します(表 5)。</li>
		<li>ステップ1.13-1.14と同様にSDS-PAGEを実行して、溶出画分を確認します。精製されたMMLV-RTを含む画分を回収し、4°CでMMLV-RT保存バッファー(表6)に対して透析します。</li>
		<li>ナノドロップ、アリコート、液体窒素中での急速凍結を使用してタンパク質濃度を測定し、-80°Cで保存します。 注:FPLCシステムにロードする前に、0.45 μmフィルターを使用して精製用のすべてのバッファーをろ過してください。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 社内マルチプレックスR3TワンステップRT-qPCRキットコンポーネントの準備
<ol><li>バッファーミックスの調製<ol><li>RT-qPCR反応用の2倍バッファーを調製し、その中に37で示した試薬を含みます。すべての試薬をDNase/RNase-Free水で調製し、バッファーミックスを-20°Cの冷凍庫で保存します。</li>
	</ol></li>
	<li>プライマーおよびプローブセットおよびプライマー混合物の調製 注:使用したプローブとプライマーを 表7に示します。インフルエンザおよびSARS-CoV-2マルチプレックスキットには、3つのプローブと4つのフォワードおよびリバースプライマーセットが含まれています。プローブは、InfAにはレポーター6-カルボキシフルオレセイン(FAM)、SARS-CoV-2(N遺伝子)にはTexas Red-XN、InfBにはYakima Yellowを使用して5'末端で標識されています。MERS-CoVおよびSARS-CoV-2マルチプレックスキットには、3つのプローブと3つのフォワードおよびリバースプライマーセットが含まれています。また、MERS-CoV(ORF1a遺伝子)にはレポーターTexas Red-XN、MERS-CoV(UpE遺伝子)にはVIC、SARS-CoV-2(N遺伝子)には6-カルボキシフルオレセイン(FAM)のレポーターを使用して、5'末端でプローブを標識します。<ol><li>表7にリストされているすべてのプライマーとプローブを含むプライマーミックスを調製し、最終濃度はフォワードプライマーとリバースプライマーごとに6.7 μM、各プローブに1.25 μMです。プライマーミックスは-20°Cの冷凍庫で保管してください。溶出バッファーを使用して、必要な容量を構成します。</li>
	</ol></li>
	<li>酵素ミックス調製<ol><li>Taqポリメラーゼ(30 U/μL)およびMMLV-RT(60 ng/μL)酵素ミックスを表3に示すようにTaqポリメラーゼ保存バッファーに調製し、必要な容量を調製します。このステップを氷上で行い、酵素ミックスを-20°Cで保存します。</li>
	</ol></li>
	<li>RNAテンプレート<ol><li>SARS-CoV-2、インフルエンザA H1N1、インフルエンザA H3N2、インフルエンザB、MERS-CoVの合成RNAを1x Tris-EDTAバッファー100 μL(10 mM Tri-Clおよび1 mM EDTA(pH 8.0))に別々に再懸濁し、1 x 106 RNAコピー/μLのストックを作成します。</li>
		<li>1)SARS-CoV-2、インフルエンザA、インフルエンザBを50 μLの容量に各ウイルスストック5 μLを添加し、1 x 105 RNA コピー/μLを作製します。2)SARS-CoV-2、MERS-CoVは、各ウイルスストック5 μLを50 μLの体積に添加して、1 x 105 RNAコピー/μLを1 x 105 RNAコピー /μLから10 RNAコピー/μLの範囲で10倍段階希釈します。 注:テンプレートの段階希釈液を調製するには、必ず氷冷したDNase/RNaseフリーの水を使用してください。</li>
	</ol></li>
</ol>4.社内マルチプレックスSARS-CoV-2、インフルエンザA、インフルエンザB、SARS-CoV-2、MERS-CoVワンステップRT-qPCRテスト
注:ワークステーションの表面を消毒し、96ウェルプレートテンプレートを使用してPCRプレートのレイアウトを計画します。
<ol><li>96ウェルプレートの調製<ol><li>2xバッファーとプライマーミックスを解凍します。酵素ミックスを氷上に保管してください。</li>
		<li>各ウェルに、2x バッファーミックス 10 μL、プライマーミックス 1.5 μL、酵素ミックス 1 μL、DNase/RNase-Free Water 6.5 μL、および試験が必要な対応する RNA 混合物 1 μL を加えます。各ウェルの最終容量は20μLです。このステップのヘルプについては、準備されたレイアウトを参照してください。 注:ピペッティングの偏りを避けるために、RNAサンプルを除くすべての試薬を含む反応数に基づいてマスターミックスを作成することをお勧めします。さらに、技術的なエラーを避けるために、反応を二重または三重に実行してください。</li>
		<li>プレートを接着剤PCRプレートシールで密封し、1分間短時間遠心分離して、プレートの底にすべての液体を回収します。サンプルをqPCRマシンに移す前に、各ウェルに同じ量の液体があり、気泡がないことを確認してください。 注:すべてのPCR反応は氷上でセットアップする必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>PCRプログラム<ol><li>リアルタイム qPCR マシンプログラムを開き、以下の実験プロパティを選択します。 ブロックタイプ:Fast 96 ウェル(0.1 mL) 実験のセットアップ:検量線 試薬:TaqMan 試薬 実行プロパティ: 標準。</li>
		<li>すべての遺伝子ターゲットとそのレポーター色素を 表7に示されているように定義します。さらに、増幅曲線の分析を容易にするために、テストする各反応のサンプル名を定義します。</li>
		<li>ターゲットとサンプルを、96ウェルプレートに基づくプログラムのプレートレイアウトに割り当てます。</li>
		<li>PCR装置で以下のサイクルプログラムを以下のように設定します。 55°Cで10分間 40サイクル:94°Cで1分間 94°Cで10秒 68°Cで10秒 68°Cで20秒。ここで蛍光を取得します。</li>
		<li>プレートをリアルタイムqPCRマシンに移し、プレートの正しい向きを確保してホルダーに入れ、分析を開始します。</li>
		<li>実験データを保存するファイルの場所を選択します。</li>
	</ol></li>
	<li>データ解析<ol><li>まず、qPCRプログラムによって生成された増幅プロットを調べることが不可欠です。検出限界を分析して、検出可能な最小 RNA 濃度を評価します。</li>
		<li>RNAコピー数の対数をx軸にプロットし、対応する平均Ct値をy軸にプロットして、アッセイの感度を評価します。傾きとR2 は、反応の信頼性と効率を示します。</li>
	</ol></li>
</ol>

呼吸器ウイルス検出のためのマルチプレックスRT-qPCRアッセイ

著者らは、競合する金銭的利害関係はないと宣言しています。

SARS-CoV-2、インフルエンザA/B、MERS-CoV変異株などの一般的な呼吸器系ウイルスの蔓延による高い感染率と死亡率により、世界中の医療システムに大きな経済的負担がかかっています12,19,20。この負担を軽減する責任感に突き動かされ、1回の検査でこれらの一般的なウイルスを区別するためのRT-qPCRなどの迅速で正確でアクセ?...

現在進行中の新型コロナウイルス感染症2019(COVID-19)のパンデミックは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)1として知られる新型コロナウイルスによって引き起こされています。SAR-CoV-2の強い伝染性と急速な感染力により、COVID-19のパンデミックは中国の武漢市で発生し、世界中に急速に広がりました。これは最終的に呼吸困難の徴候の始まりにつながり、死にさえつながりました2,3,4。COVID-19は213カ国以上でパンデミックと宣言されており、さまざまな調査研究で発表された論文からも明らかなように、確認された症例数の急激な増加が予想されています3,5。COVID-19は、主に感染者が環境中に放出する小さな呼吸器飛沫によって感染し、吸入や汚染された表面との密接な接触によって脆弱な個人に曝露します。これらの飛沫が目、口、鼻の粘膜に接触すると、人は感染する可能性があります6。世界保健機関(WHO)が発表した統計によると、世界中で7,600万人以上の感染が確認され、700万人という驚異的な死者が出ています7。このように、国連は、COVID-19によるパンデミックは、世界中の何十億もの人々の生活に直接影響を与え、経済的、環境的、社会的に広範囲に影響を及ぼしたため、災害に分類しました。
徹底的な検査、早期発見、接触者追跡、症例隔離などの公衆衛生イニシアチブはすべて、このパンデミックを制御下に置く上で重要であることが示されています8,9,10,11。冬季は、COVID-19に似た症状を持つインフルエンザAやBなどの他の呼吸器系ウイルスの循環が増加し、COVID-19の症例を早期に特定、追跡、隔離することが困難になります。毎年、インフルエンザAおよびBの流行は晩秋または1月上旬に始まり、季節性は予測可能です12。SARS-CoV-2ウイルスとインフルエンザウイルスには多くの疫学的特徴が共通しています。さらに、子供、高齢者、免疫不全、喘息、慢性閉塞性肺疾患、心不全および腎不全、糖尿病などの慢性併存疾患を持つ個人を含む感受性集団の類似性を共有しています12,13。これらのウイルスは、脆弱な集団だけでなく、接触経路や呼吸器飛沫の感染経路も共有しています14。インフルエンザの季節が近づくにつれて、患者はこれらの呼吸器系ウイルスの1つ以上に感染する可能性が高いと予想されます14。そのためには、SARS-CoV-2とインフルエンザウイルスのスクリーニングを、症状のある患者を隔離する前に行う必要があります。3つのウイルス(SARS-CoV-2、インフルエンザA、インフルエンザB)について個別に検査を行うことは、核酸の抽出と診断のためのリソースが世界的に不足しているため、不可能です。1回の反応でそれらをすべてスクリーニングするには、メソッドまたはテストを開発する必要があります。
中東呼吸器症候群(MERS)-CoVは、ヒトコロナウイルス(CoV)ファミリーのメンバーです。最初のMERS-CoVウイルス分離株は、2012年9月に急性呼吸器疾患により死亡したサウジアラビアの入院患者から採取された15。MERS-CoVの顕著なリザーバー宿主がヒトコブラクダであることを示唆する証拠があります。感染したヒトコブラクダ由来のウイルスは人畜共通感染症であり、したがって人間に感染する可能性があることが証明されています16,17。このウイルスに感染した人間は、密接な接触によって他の人に感染させる可能性があります18。2018年1月26日現在、MERS-CoVの検査で確認された症例は2143例で、そのうち750人が死亡しています19。最も典型的なMERS-CoVの症状は、咳、発熱、息切れです。MERS-CoV感染症は、肺炎、下痢、胃腸病の症状を示すことも報告されています20。現在、MERS-CoVの市販のワクチンや特異的な治療法はありません。したがって、MERS-CoVの蔓延を予防し、MERS-CoVとSARS-CoV-2疾患を区別するためには、迅速かつ正確な診断が不可欠です。
現在までに、マルチプレックスRT-PCR 21,22,23,24,25、CRISPR/Cas1226,27、CRISPR/Cas928、CRISPR/Cas329、ラテラルフロー免疫測定法30、紙ベースの生体分子センサー31、ワンポットでのシャーロック検査32、DNAアプタマー33、ループ媒介等温など、これらのウイルスを検出するための多くのアプローチが提案されている増幅(LAMP)19,34など前述の各方法には、感度と特異性の点で独自の利点と欠点があります。これらの方法の中で、核酸増幅ベースの検査であるマルチプレックスqRT-PCRが最も一般的であり、SARS-CoV-2、インフルエンザA、インフルエンザB、およびMERS-CoVの診断のゴールドスタンダードであると考えられています。
本研究では、SARS-CoV-2、インフルエンザA、インフルエンザB、SARS-CoV-2、MERS-CoVを標準ツイスト合成ウイルスRNAを用いて効果的かつ正確かつ同時に検出するための様々なプライマーの組み合わせとプローブを設計・評価しました。MERS-CoVまたはSARS-CoV-2の標的遺伝子に対して開発されたマルチプレックスアッセイは、世界保健機関(WHO)によって推奨されています。これらの遺伝子は一般に、MERS−CoVアッセイに使用されるオープンリーディングフレーム1a(ORF1a)内の領域など、複製/転写複合体(RTC)35の形成に寄与するタンパク質および複合体をコードする。さらに、構造タンパク質は、MERS-CoVおよびSARS-Cov-2アッセイにそれぞれ使用されるエンベロープ遺伝子の上流領域(upE)およびヌクレオカプシド遺伝子(N)などの診断アッセイに利用される遺伝子によってコードされています35,36。社内のR3TワンステップRT-qPCRキットを使用して、ウイルス検出用のRT-qPCRを確立しました37。R3T ワンステップ RT-qPCR キットおよびプライマーセットのウイルス検出、感度、特異性、およびダイナミックレンジは、標準 Twist 合成 RNA の 10 倍段階希釈を使用して試験および評価されました。実用的検出の最低限界は、1反応あたり約10個の転写産物コピーでした。その結果、SARS-CoV-2、インフルエンザA、インフルエンザB、およびSARS-CoV-2、MERS-CoVのルーチン同時診断に、社内のR3TワンステップRT-qPCRキットとプライマー/プローブセットを正常に使用および実装できます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m filter cups</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>291-4545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Tris-Glycine SDS running buffer</td>
			<td>Novex</td>
			<td>LC2675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culturing plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A701-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-238-RH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-1152-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Biotin, 98+%</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A14207.60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH10Bac competent cells</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10361012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>68100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase/Rnase Free Distilled Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21(DE3) competent cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media)</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>96-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A38400-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene (transfection reagent)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I8896-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>56750-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A (H1N1) synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A (H3N2)&#160; synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza B synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I3481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11815-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth media</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L6876-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>13152-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MERS-CoV synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>10310855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini- PROTEAN TGX Precast Gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-1093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-3712-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-5248-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers and Probes</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein marker</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>102024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 insect cells</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A35243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StrepTrap XT 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29401323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB02200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base Molecular Biology Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>22676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Gal</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B1690</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of multiplex real-time rt-qpcr assays for the detection of sars-cov-2, influenza a/b, and mers-cov

コロナウイルス病2019(COVID-19)を引き起こす重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)は、一般市民の健康に対する深刻な脅威です。インフルエンザの季節には、SARS-CoV-2やその他の呼吸器系ウイルスの蔓延により、管理が困難な呼吸器疾患の集団的負担を引き起こす可能性があります。そのためには、呼吸器系ウイルスであるSARS-CoV-2、インフルエンザA、インフルエンザB、中東呼吸器症候群(MERS-CoV)を、特にSARS-CoV-2、インフルエンザA、B型インフルエンザの場合、感受性集団、感染様式、臨床症候群などの同様の疫学的要因を共有するため、今後の秋から冬にかけて注意深く監視する必要があります。標的特異的なアッセイを行わないと、これらのウイルスの類似性から症例を区別することが困難になる可能性があります。したがって、これらのウイルス標的を容易に区別できる高感度で標的を絞ったマルチプレックスアッセイは、医療従事者にとって有用である。本研究では、SARS-CoV-2、インフルエンザA、インフルエンザB、SARS-CoV-2、MERS-CoVを同時に検出するために、自社開発のR3TワンステップRT-qPCRキットを利用したリアルタイム逆転写酵素PCRベースのアッセイを開発しました。わずか10コピーの合成RNAで、SARS-CoV-2、インフルエンザA、インフルエンザB、MERS-CoVのターゲットを100%の特異性で同時に同定することに成功しました。このアッセイは、正確で信頼性が高く、シンプルで、高感度で、特異的であることがわかっています。開発された分析法は、病院、医療センター、診断ラボ、および研究目的で、最適化されたSARS-CoV-2、インフルエンザA、インフルエンザB、およびSARS-CoV-2、MERS-CoV診断アッセイとして使用できます。

The pandemic of the ongoing coronavirus disease 2019 (COVID-19) is caused by the novel coronavirus known as the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1. Due to SAR-CoV-2&#39;s strong contagiousness and capacity for rapid transmission, the COVID-19 pandemic emerged in Wuhan City, China, and spread quickly throughout the world. This eventually led to the start of respiratory distress signs and even death2,3,4. COVID-19 has been declared a pandemic in more than 213 countries, expecting a steep increase in the number of confirmed cases, as evidenced by the papers published by different research studies3,5. COVID-19 is transmitted primarily by small respiratory droplets that infected individuals release into the environment and then get exposed to vulnerable individuals through inhalation or close contact with contaminated surfaces. When these droplets come into contact with the mucosa of the eyes, mouth, or nose, a person may become infected6. Statistics released by the World Health Organization (WHO) show that there have been more than 76 million confirmed cases of the pandemic worldwide, with a staggering 7 million deaths7. Thus, the United Nations classified the pandemic caused by COVID-19 disease as a disaster because of its direct impact on the lives of billions of people around the globe and had far-reaching economic, environmental, and social effects.
Public health initiatives including thorough testing, early detection, contact tracing, and case isolation have all been shown to be crucial in keeping this pandemic under control8,9,10,11. The winter months will increase the circulation of other respiratory viruses like Influenza A and B with COVID-19-like symptoms making it difficult to identify, track down, and isolate COVID-19 instances early on. Every year, Influenza A and B outbreak starts in the late fall or early January with a predictable seasonality12. Numerous epidemiological traits are shared by SARS-CoV-2 and Influenza viruses. Besides, sharing similarities in the susceptible populations which include children, the elderly, immunocompromised, and individuals with chronic comorbidities such as asthma, chronic obstructive pulmonary disease, cardiac and renal failure, or diabetes12,13. These viruses not only share vulnerable populations but also transmission routes of contact and respiratory droplets14. It is anticipated that patients may likely contract more than one of these respiratory viruses as flu season approaches14. For that, the screening of SARS-CoV-2 and the Influenza viruses needs to be done on symptomatic patients before they are isolated. Running separate tests for the three viruses (SARS-CoV-2, Influenza A, and Influenza B) is not possible due to the global lack of resources for nucleic acid extraction and diagnostics. In order to screen them all in one reaction, a method or test needs to be developed.
Middle East respiratory syndrome (MERS)-CoV is a human coronavirus (CoV) family member. The first MERS-CoV virus isolates came from a hospitalized patient in Saudi Arabia who had died in September 2012 due to acute respiratory issues15. There is evidence that suggests that a prominent reservoir host for MERS-CoV is dromedary camels. It has been proven that viruses from infected dromedary camels are zoonotic and thus can infect humans16,17. Humans infected with this virus can spread it to others through close contact18. As of January 26th,&#160;2018, there had been 2143 laboratory-confirmed cases of MERS-CoV infection including 750 deaths globally19. The most typical MERS-CoV symptoms are coughing, fever, and shortness of breath. MERS-CoV infections have also been reported to exhibit pneumonia, diarrhea and gastrointestinal sickness symptoms20. Currently, no commercial vaccine or specific treatment for MERS-CoV is available. Therefore, prompt and precise diagnosis is essential for preventing the widespread MERS-CoV outbreaks and differentiating MERS-CoV from SARS-CoV-2 disease.
To date, many approaches have been proposed to detect these viruses such as multiplex RT-PCR21,22,23,24,25, CRISPR/Cas1226,27, CRISPR/Cas928, and CRISPR/Cas329, lateral flow immunoassay30, paper-based biomolecular sensors31, SHERLOCK testing in one pot32, DNA aptamer33, loop-mediated isothermal amplification (LAMP)19,34, etc. Each of the aforementioned methods has unique benefits and drawbacks in terms of sensitivity and specificity. Among these methods, the nucleic acid amplification-based test: multiplex qRT-PCR, is the most common and is considered to be the gold standard for the diagnosis of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and MERS-CoV.
In this study, we designed and assessed various primer combinations and probes for the effective, accurate, and simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV utilizing standard twist synthetic viral RNAs. The multiplexed assays developed for either MERS-CoV or SARS-CoV-2 target genes are recommended by the World Health Organization (WHO). These genes generally encode proteins and complexes that contribute to the formation of a replication/transcription complex (RTC)35 such as the region within the open reading frame 1a (ORF1a) that is used for MERS-CoV assay. In addition, structural proteins are encoded by the genes utilized in diagnostic assays such as the upstream region of envelope gene (upE) and nucleocapsid gene (N) which are used for MERS-CoV and SARS-Cov-2 assays, respectively35,36. We used in-house R3T one-step RT-qPCR kit to establish the RT-qPCR for the detection of viruses37. Virus detection, sensitivity, specificity, and dynamic range of our R3T one-step RT-qPCR kit and primer sets were tested and evaluated using 10-fold serial dilutions of the standard twist synthetic RNAs. The lowest practical detection limit was approximately 10 transcripts copies per reaction. As a result, the in-house R3T one-step RT-qPCR kit and primer/probe sets can be successfully used and implemented for routine simultaneous diagnosis of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV.

著者スポットライト:呼吸器系ウイルスのマルチプレックス検出の進歩 

SARS-CoV-2、インフルエンザA/B、MERS-CoVを検出するためのマルチプレックスリアルタイムRT-qPCRアッセイの開発

近年、PCRアプローチ21、22、23、24、25を使用して一般的な呼吸器ウイルスを検出するための診断アプローチに大きな進歩がありました。しかし、これらの進歩にもかかわらず、1回の検査で複数のウイルスを検出できるマルチプレックスアプローチは、特にRT-qPCRプラット?...

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一般的な呼吸器系ウイルス用の2つのプローブベースのワンステップRT-qPCRキットを紹介します。最初のアッセイは、SARS-CoV-2(N)、インフルエンザA(H1N1およびH3N2)、およびインフルエンザBに対するものです。2つ目は、SARS-Cov-2(N)とMERS(UpEとORF1a)です。これらのアッセイは、あらゆる専門ラボでうまく実施できます。

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) that causes Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is a serious threat to the general ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Development of Multiplex Real-Time RT-qPCR Assays for the Detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and MERS-CoV

691 ビュー.  King Abdullah University of Science and Technology (KAUST). 一般的な呼吸器系ウイルス用の2つのプローブベースのワンステップRT-qPCRキットを紹介します。最初のアッセイは、SARS-CoV-2(N)、インフルエンザA(H1N1およびH3N2)、およびインフルエンザBに対するものです。2つ目は、SARS-Cov-2(N)とMERS(UpEとORF1a)です。これらのアッセイは、あらゆる専門ラボでうまく実施できます。 