Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Ciencia y Tecnología Rey Abdullah a través de fondos básicos y el National Term Grand Challenge (NTGC) a S.M.H.

1. Expresión y purificación de la polimerasa Taq
<ol><li>Construya un plásmido con una etiqueta de hexa-histidina escindible en el extremo C de la enzima.</li>
	<li>Transformar 50 ng del vector de expresión en cepa BL21-(DE3) de E. coli siguiendo el protocolo estándar38.</li>
	<li>Inocular las células transformadas en cuatro matraces de 6 L, cada uno de los cuales contiene 2 L de caldo de 2YT a 37 °C con agitación a 170 rpm hasta alcanzar el OD 600 de 0,8 o el número de celda 6,4 x 108 .</li>
	<li>Inducir la expresión de la polimerasa Taq con 0,5 mM de isopropil-β-d-tiogalactopiranósido (IPTG) e incubar a 16 °C durante 18 h con agitación.</li>
	<li>Coseche las células girándolas a 4 °C a 7808 x g durante 10 min. Resuspender los gránulos en 200 ml de un tampón de lisis de polimerasa Taq helado (Tabla 1) en 5 ml/g de gránulos celulares.</li>
	<li>Incubar las células con lisozima (2 mg/ml de tampón de lisis) e inhibidores de la proteasa durante 45 min y luego pasar el lisado a través de un disruptor celular a 30 kPsi y centrifugar a 22.040 x g durante 30 min a 4 °C para separar los restos celulares.</li>
	<li>Calentar el sobrenadante durante 15 min a 85 °C. Centrifugar a 95.834 x g durante 1 h a 4 °C. Recoja el sobrenadante y fíltrelo en hielo con un filtro de 0,45 μm.</li>
	<li>Realice la purificación de proteínas mediante cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) pasando primero la muestra a través de una columna de Ni-NTA HP de 5 ml a un caudal de 4 ml/min utilizando el tampón de polimerasa Taq A (Tabla 2; Figura 1A).</li>
	<li>Lavar con 10 volúmenes de columna (CV) de tampón de polimerasa Taq A y 4% de tampón de polimerasa B de Taq (Tabla 2). Eluir la proteína unida con un gradiente lineal utilizando el tampón B de la polimerasa Taq durante 20 CV en un frasco de 100 ml.</li>
	<li>Pasar el eluyente en el frasco de 100 mL a través de una columna de intercambio catiónico de 5 mL a 4 mL/min utilizando el tampón de polimerasa Taq C (Tabla 2; Figura 1A).</li>
	<li>Lavar con 20 CV de tampón de polimerasa Taq C al 100% y tampón polimerasa D de Taq al 5% (Tabla 2).</li>
	<li>Eluir con un gradiente lineal utilizando el tampón de polimerasa Taq D (Tabla 2) a partir del 5% al 100%.</li>
	<li>Compruebe las fracciones eluidas realizando la electroforesis en gel SDS-PAGE 39 seguida de la tinción en gel 40 como se ha descrito anteriormente. Brevemente, tome 10 μL de cada fracción y agregue un volumen igual de 2x SDS de tinte de carga. Desnaturalizar la muestra a 90°C durante 10 min. Cargue las muestras en un gel SDS-PAGE al 10% y deje pasar el gel durante 25 minutos a 200 V. Tiña el gel con Coomassie Brilliant Blue y luego quita las manchas.</li>
	<li>Recoger todas las fracciones que contienen la polimerasa Taq purificada y dializarlas contra el tampón de almacenamiento de la polimerasa taq (Tabla 3) a 4 °C. Brevemente, prepare 2 L del tampón de almacenamiento y sumerja el casete de diálisis en el tampón durante 2 minutos para hidratarse. Inyecte las fracciones recogidas con una aguja en el casete de diálisis y déjelo toda la noche en el tampón de diálisis a 200 rpm en el agitador.</li>
	<li>Después de la diálisis, medir la concentración de proteínas con un espectrofotómetro, hacer alícuotas de 10 μL, congelar rápidamente en nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C. NOTA: Filtre todos los tampones para la purificación utilizando un filtro de 0,45 μm antes de cargarlos en el sistema FPLC.</li>
</ol>2. Expresión de MMLV-RT en el sistema de expresión y purificación de células de insectos
<ol><li>Generación y aislamiento de ADN de Bacmid<ol><li>Clone la secuencia de MMLV-RT con una etiqueta TEV-8xHis-Strep escindible en el extremo C-terminal como se describió anteriormente41.</li>
		<li>Mezcle 100 ng del vector de expresión en 50 μL de células DH10Bac y mezcle suavemente golpeando el tubo.</li>
		<li>Incubar las células en hielo durante 15 min. Realice un choque térmico en las celdas durante 1 minuto a 42 °C.</li>
		<li>Transfiera inmediatamente a hielo y agregue 400 μL de medio S.O.C. Incubar a 37 °C con agitación durante 4 h.</li>
		<li>Placa de 10 μL y 15 μL de la mezcla en placas de agar LB que contienen tres antibióticos; 50 μg/mL de Kanamicina, 10 μg/mL de Tetraciclina y 7 μg/mL de Gentamicina junto con 40 μg/mL de IPTG y 100 μg/mL de X-Gal para la selección azul-blanca.</li>
		<li>Incubar las placas a 37 °C durante 48 h. Escoja varias colonias blancas y una colonia azul como control, y vuelva a colocarlas en placas frescas de agar LB que contengan los antibióticos anteriores. Incubar las placas durante la noche a 37 °C.</li>
		<li>Después de confirmar el fenotipo blanco, elija un par de colonias e inocule en 10 ml de medio LB que contenga 50 μg/ml de kanamicina, 10 μg/ml de tetraciclina y 7 μg/ml de gentamicina en tubos de 50 ml.</li>
		<li>Incubar el cultivo a 37 °C agitando a 170 rpm durante la noche. Pulveriza las células haciéndolas girar a 22.040 x g durante 10 min.</li>
		<li>Decantar el sobrenadante y volver a suspender el gránulo en 250 μL de solución de resuspensión del kit de minipreparación (esta solución debe manipularse de acuerdo con las instrucciones del fabricante), luego transferir la solución a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
		<li>Añadir 250 μL de solución de lisis, mezclar suavemente e incubar durante 3 min. Añadir 350 μL de solución neutralizante, invertir 2x-3x y centrifugar a 22.040 x g durante 10 min.</li>
		<li>Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo y añadir un volumen igual de isopropanol helado e incubar durante 30 min a -20 °C.</li>
		<li>Pulverizar el ADN precipitado girando a 22.040 x g durante 10 min. Deseche el sobrenadante y lave el pellet con 700 μL de etanol helado al 70%, 2x.</li>
		<li>Retire el sobrenadante con una pipeta sin tocar el gránulo. Deje que el pellet se seque al aire en la campana de flujo laminar durante 5-10 minutos o hasta que no se vea líquido en el tubo. Disolver el gránulo en 100 μL de tampón EB.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfección de Bacmid y amplificación del virus<ol><li>Preparación del virus P1<ol><li>En una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos, siembre ~ 9 x 105 células/pocillo en 2 mL de medio de cultivo de células de insectos.</li>
			<li>Incube la placa durante ~ 30 minutos a temperatura ambiente para permitir que las células se adhieran.</li>
			<li>Prepare la mezcla de Bacmid/Fugene de la siguiente manera: mezcle 1 μg de ADN de Bacmid y 300 μL de medios de células de insectos en un tubo. En otro tubo, mezcle 8 μL de reactivo de transfección y 300 μL de medios de células de insecto. Mezclar ambas mezclas mediante un pipeteo suave y dejar reposar ~30 min a temperatura ambiente para que se forme el complejo de reactivos de bacmid/transfección.</li>
			<li>Agregue la mezcla de complejo de bacmid (~ 210 μL) a cada pocillo gota a gota y selle la placa con una película transparente.</li>
			<li>Incubar la placa a 27 °C durante 3-4 días.</li>
			<li>Tome el medio que contiene el virus, agregue FBS (concentración final 2%), filtre con un filtro de 0,45 μm y almacene a 4 ° C en la oscuridad como stock de virus P1.</li>
		</ol></li>
		<li>Preparación del virus P2<ol><li>Transfectar 50 mL de células de insecto a 2 x 106 células/mL con 3 mL de virus P1 en un matraz de cultivo.</li>
			<li>Incubar a 27 °C con agitación a 100 rpm durante 4-6 días hasta que el porcentaje de células muertas alcance el 25%-30%.</li>
			<li>Centrifugar a 300 x g durante 10 min y recoger el sobrenadante que contiene el virus.</li>
			<li>Añadir FBS hasta una concentración final del 2%, filtrar a través de un filtro de 0,45 μm y alícuotas de 1 ml cada uno y almacenar a -80 °C como caldo de virus P2.</li>
		</ol></li>
		<li>Preparación del virus P3<ol><li>Transfectar 100 mL de células de insecto a 2 x 106 células/mL con los 2 mL de virus P2 en un matraz de cultivo.</li>
			<li>Incubar a 27 °C con agitación a 100 rpm durante 3-4 días hasta que el porcentaje de células muertas alcance el 15%-20%.</li>
			<li>Centrifugar las células a 300 x g durante 10 min y recoger el sobrenadante que contiene el virus.</li>
			<li>Agregue FBS a una concentración final del 2%. Filtrar a través de un filtro de 0,45 μm. Se puede almacenar en la oscuridad a 4 °C durante 1 mes.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Expresión y purificación de MMLV-RT en células de insectos<ol><li>Añadir 5 ml de virus P3 a las células frescas de insectos a una densidad de 2 x 106 células/ml (matraz de 700 ml/2 litros) en un total de 6 frascos.</li>
		<li>Cosechar las células después de 55-60 h de post-transfección girando a 7808 x g durante 10 min.</li>
		<li>Resuspender los gránulos celulares en 200 mL de tampón de lisis MMLV-RT (Tabla 4). Pasar el lisado a través de un disruptor celular a 15 kPsi y centrifugar a 22.040 x g durante 30 min a 4 °C.</li>
		<li>Trasvasar el sobrenadante a nuevos tubos y volver a centrifugar a 95,834 x g a 4 °C durante 1 h. Recoja el sobrenadante y fíltrelo en hielo con un filtro de 0,45 μm.</li>
		<li>Comience la purificación de proteínas mediante FPLC pasando primero la muestra a través de la columna de 5 ml de Ni-NTA Excel (Figura 1B) a un caudal de 4 ml/min utilizando el tampón A de MMLV-RT (Tabla 5).</li>
		<li>Lavar la columna con 10 CV de tampón MMLV-RT A y 4% de tampón MMLV-RT B (Tabla 5) y eluir la proteína con el gradiente lineal de tampón MMLV-RT B durante 20 CV en un frasco de 100 mL.</li>
		<li>Pasar la muestra eluida a través de la columna de estreptococo 5 mL (Figura 1B) equilibrada con el tampón MMLV-RT C (Tabla 5).</li>
		<li>Lavar la columna con 10 CV de tampón C MMLV-RT al 100% y eluir la proteína con un gradiente lineal con 20 CV de tampón D (Tabla 5).</li>
		<li>Verifique las fracciones eluidas realizando SDS-PAGE como se hace en los pasos 1.13.-1.14. y recoger las fracciones que contienen MMLV-RT purificado para dializarlas con el tampón de almacenamiento de MMLV-RT (Tabla 6) a 4 °C.</li>
		<li>Mida la concentración de proteínas con Nanodrop, alícuota, congele rápidamente en nitrógeno líquido y almacene a -80 °C. NOTA: Filtre todos los tampones para la purificación utilizando un filtro de 0,45 μm antes de cargarlos en el sistema FPLC.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Preparación de componentes internos del kit RT-qPCR de un solo paso R3T multiplex
<ol><li>Preparación de la mezcla tampón<ol><li>Prepare el tampón 2x para la reacción RT-qPCR que contiene los reactivos mostrados anteriormente en elpunto 37. Preparar todos los reactivos en agua sin DNasa/RNasa y la mezcla tampón almacenada en un congelador a -20 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de la mezcla de cebadores y sondas y cebadores NOTA: Las sondas y cebadores utilizados se enumeran en la Tabla 7. El kit multiplexado contra la influenza y el SARS-CoV-2 contiene 3 sondas y 4 juegos de cebadores hacia adelante y hacia atrás. Las sondas se marcan en los extremos 5′ utilizando reporteros 6-carboxifluoresceína (FAM) para InfA, Texas Red-XN para SARS-CoV-2 (gen N) y Yakima Yellow para InfB. El kit multiplexado para el MERS-CoV y el SARS-CoV-2 contiene 3 sondas y 3 juegos de cebadores directos e inversos. Las sondas también se marcan en los extremos 5′ utilizando reporteros Texas Red-XN para MERS-CoV (gen ORF1a), VIC para MERS-CoV (gen UpE) y 6-carboxifluoresceína (FAM) SARS-CoV-2 (gen N).<ol><li>Prepare una mezcla de cebadores que contenga todos los cebadores y sondas enumerados en la Tabla 7 con una concentración final de 6,7 μM para cada cebador directo e inverso y 1,25 μM para cada sonda en un tubo de 1,5 mL. Guarde la mezcla de imprimación en el congelador a -20 °C. Utilice el tampón de elución para compensar el volumen requerido.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de la mezcla de enzimas<ol><li>Prepare la mezcla de enzimas Taq polimerasa (30 U/μL) y MMLV-RT (60 ng/μL) en el tampón de almacenamiento de la polimerasa Taq como se muestra en la Tabla 3 para completar el volumen requerido. Realice este paso en hielo y almacene la mezcla de enzimas a -20 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Plantilla de ARN<ol><li>Resuspender los ARN sintéticos del SARS-CoV-2, la gripe A H1N1, la gripe A H3N2, la gripe B y el MERS-CoV por separado en 100 μl de 1 tampón Tris-EDTA (10 mM de Tri-Cl y 1 mM de EDTA (pH 8,0) para obtener un stock de 1 x 106 6 copias de ARN/μL.</li>
		<li>Mezclar ARN sintéticos para RT-qPCR en las siguientes configuraciones: 1) SARS-CoV-2, Influenza A e Influenza B agregando 5 μL de cada stock de virus a un volumen de 50 μL para hacer 1 x 105 copias de ARN/μL; 2) SARS-CoV-2, MERS-CoV añadiendo 5 μL de cada stock de virus a un volumen de 50 μL para hacer 1 x 105 copias de ARN/μL. Hacer diluciones seriadas 10 veces de cada mezcla de ARN sintético que van desde 1 x 105 copias de ARN/μL hasta 10 copias de ARN/μL. NOTA: Asegúrese de utilizar agua helada sin DNasa/RNasa para preparar la dilución en serie de las plantillas.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Prueba de RT-qPCR de un solo paso para SARS-CoV-2, influenza A, influenza B y SARS-CoV-2, MERS-CoV multiplexada internamente
NOTA: Desinfecte las superficies de la estación de trabajo y utilice una plantilla de placa de 96 pocillos para planificar el diseño de la placa de PCR.
<ol><li>Preparación de la placa de 96 pocillos<ol><li>Descongele 2 veces la mezcla de tampón e imprimación. Mantenga la mezcla de enzimas en hielo.</li>
		<li>A cada pocillo, agregue 10 μL de mezcla tampón 2x, 1,5 μL de la mezcla de cebadores, 1 μL de mezcla de enzimas, 6,5 μL de agua libre de DNasa/RNasa y 1 μL de la mezcla de ARN correspondiente que debe analizarse. El volumen final en cada pocillo es de 20 μL. Consulte el diseño preparado para obtener ayuda con este paso. NOTA: Se recomienda hacer una mezcla maestra basada en el número de reacciones que contienen todos los reactivos excepto la muestra de ARN para evitar el sesgo de pipeteo. Además, realiza las reacciones por duplicado o triplicado para evitar errores técnicos.</li>
		<li>Selle la placa con un sello adhesivo de placa PCR y centrifugue brevemente durante 1 minuto para recoger todo el líquido en el fondo de la placa. Asegúrese de que cada pocillo tenga el mismo volumen de líquido y esté libre de burbujas antes de transferir las muestras a la máquina de qPCR. NOTA: Todas las reacciones de PCR deben configurarse en hielo.</li>
	</ol></li>
	<li>Programa de PCR<ol><li>Abra el programa de máquina de qPCR en tiempo real y elija las siguientes propiedades experimentales: El tipo de bloque: Rápido de 96 pocillos (0,1 ml) Configuración del experimento: Curva estándar Reactivos: Reactivos TaqMan Propiedades de ejecución: Estándar.</li>
		<li>Defina todas las dianas génicas y su colorante reportero como se presenta en la Tabla 7. Además, defina los nombres de las muestras para cada reacción que se va a probar para facilitar el análisis de las curvas de amplificación.</li>
		<li>Asigne objetivos y muestras al diseño de la placa del programa en función de la placa de 96 pocillos.</li>
		<li>Configure el siguiente programa de ciclo en el instrumento de PCR de la siguiente manera: 55 °C durante 10 min 40 ciclos: 94 °C durante 1 min 94 °C durante 10 s 68 °C durante 10 s 68 °C durante 20 s; Aquí adquieren fluorescencia.</li>
		<li>Transfiera la placa a la máquina de qPCR en tiempo real y colóquela en el soporte asegurando la correcta orientación de la placa e inicie la corrida.</li>
		<li>Elija la ubicación del archivo para guardar los datos experimentales.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis de datos<ol><li>Es esencial examinar primero los gráficos de amplificación producidos por el programa qPCR. Analizar el límite de detección para evaluar la concentración mínima de ARN que se puede detectar.</li>
		<li>Grafique el logaritmo del número de copias de ARN en el eje x y el valor medio de Ct correspondiente en el eje y para evaluar la sensibilidad del ensayo. La pendiente y la R2 indican la fiabilidad y eficiencia de la reacción.</li>
	</ol></li>
</ol>

Ensayo RT-qPCR multiplex para la detección de virus respiratorios

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Existe una pesada carga económica para el sistema de salud en todo el mundo como resultado de las altas tasas de infección y mortalidad debido a la propagación de virus respiratorios comunes como el SARS-CoV-2, la influenza A/B y las variantes del MERS-CoV 12,19,20. Motivados por el sentido de responsabilidad para aliviar esta carga, nos dimos cuenta de la necesidad de un ensayo de diagnóstico rápido, preciso y accesible, c...

La pandemia de la actual enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) está causada por el nuevo coronavirus conocido como coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV-2)1. Debido a la fuerte contagiosidad del SAR-CoV-2 y a su capacidad de transmisión rápida, la pandemia de COVID-19 surgió en la ciudad de Wuhan, China, y se propagó rápidamente por todo el mundo. Con el tiempo, esto condujo al inicio de signos de dificultad respiratoria e incluso a la muerte 2,3,4. La COVID-19 ha sido declarada pandemia en más de 213 países, previéndose un fuerte aumento en el número de casos confirmados, como lo demuestran los trabajos publicados por diferentes estudios de investigación 3,5. El COVID-19 se transmite principalmente por pequeñas gotitas respiratorias que las personas infectadas liberan al medio ambiente y luego se exponen a las personas vulnerables a través de la inhalación o el contacto cercano con superficies contaminadas. Cuando estas gotitas entran en contacto con la mucosa de los ojos, la boca o la nariz, una persona puede infectarse6. Las estadísticas publicadas por la Organización Mundial de la Salud (OMS) muestran que ha habido más de 76 millones de casos confirmados de la pandemia en todo el mundo, con la asombrosa cifra de 7 millones de muertes7. Así, las Naciones Unidas clasificaron la pandemia causada por la enfermedad COVID-19 como un desastre debido a su impacto directo en la vida de miles de millones de personas en todo el mundo y tuvo efectos económicos, ambientales y sociales de gran alcance.
Se ha demostrado que las iniciativas de salud pública, incluidas las pruebas exhaustivas, la detección temprana, el rastreo de contactos y el aislamiento de casos, son cruciales para mantener esta pandemia bajo control 8,9,10,11. Los meses de invierno aumentarán la circulación de otros virus respiratorios como la influenza A y B con síntomas similares a los de COVID-19, lo que dificultará la identificación, el seguimiento y el aislamiento temprano de los casos de COVID-19. Cada año, el brote de influenza A y B comienza a fines del otoño o principios de enero con una estacionalidad predecible12. Numerosos rasgos epidemiológicos son compartidos por los virus SARS-CoV-2 y Influenza. Además, comparte similitudes en las poblaciones susceptibles, que incluyen niños, ancianos, inmunodeprimidos e individuos con comorbilidades crónicas como asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, insuficiencia cardíaca y renal o diabetes12,13. Estos virus no solo comparten poblaciones vulnerables, sino también vías de transmisión de contacto y gotitas respiratorias14. Se anticipa que es probable que los pacientes contraigan más de uno de estos virus respiratorios a medida que se acerca la temporada de influenza14. Para ello, es necesario realizar el cribado del SARS-CoV-2 y de los virus de la gripe en pacientes sintomáticos antes de aislarlos. No es posible realizar pruebas separadas para los tres virus (SARS-CoV-2, Influenza A e Influenza B) debido a la falta mundial de recursos para la extracción y el diagnóstico de ácidos nucleicos. Con el fin de examinarlos todos en una sola reacción, es necesario desarrollar un método o prueba.
El síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS)-CoV es un miembro de la familia del coronavirus humano (CoV). Las primeras cepas aisladas del virus MERS-CoV procedían de un paciente hospitalizado en Arabia Saudí que había fallecido en septiembre de 2012 debido a problemas respiratorios agudos15. Hay pruebas que sugieren que un huésped importante del MERS-CoV son los dromedarios. Se ha comprobado que los virus de dromedarios infectados son zoonóticos y, por lo tanto, pueden infectar a los humanos16,17. Los seres humanos infectados con este virus pueden transmitirlo a otras personas a través del contacto cercano18. Hasta el 26 de enero de 2018, se habían registrado 2143 casos de infección por MERS-CoV confirmados mediante pruebas de laboratorio, incluidas 750 muertes en todo elmundo. Los síntomas más típicos del MERS-CoV son tos, fiebre y dificultad para respirar. También se ha notificado que las infecciones por MERS-CoV presentan síntomas de neumonía, diarrea y enfermedades gastrointestinales20. En la actualidad, no se dispone de una vacuna comercial ni de un tratamiento específico para el MERS-CoV. Por lo tanto, el diagnóstico rápido y preciso es esencial para prevenir los brotes generalizados de MERS-CoV y diferenciar el MERS-CoV de la enfermedad por SARS-CoV-2.
Hasta la fecha, se han propuesto muchos enfoques para detectar estos virus, como la RT-PCRmultiplex 21,22,23,24,25, CRISPR/Cas1226,27, CRISPR/Cas928 y CRISPR/Cas329, inmunoensayo de flujo lateral30, sensores biomoleculares en papel31, pruebas SHERLOCK en un bote32, aptámero de ADN33, isoterma mediada por bucle amplificación (LAMP)19,34, etc. Cada uno de los métodos mencionados anteriormente tiene ventajas e inconvenientes únicos en términos de sensibilidad y especificidad. Entre estos métodos, la prueba basada en la amplificación de ácidos nucleicos: qRT-PCR multiplex, es la más común y se considera el estándar de oro para el diagnóstico de SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B y MERS-CoV.
En este estudio, diseñamos y evaluamos varias combinaciones de cebadores y sondas para la detección efectiva, precisa y simultánea de SARS-CoV-2, influenza A, influenza B y SARS-CoV-2, MERS-CoV utilizando ARN virales sintéticos de torsión estándar. La Organización Mundial de la Salud (OMS) recomienda los ensayos multiplexados desarrollados para los genes diana del MERS-CoV o del SARS-CoV-2. Por lo general, estos genes codifican proteínas y complejos que contribuyen a la formación de un complejo de replicación/transcripción (RTC)35, como la región dentro del marco de lectura abierto 1a (ORF1a) que se utiliza para el ensayo del MERS-CoV. Además, las proteínas estructurales están codificadas por los genes utilizados en los ensayos de diagnóstico, como la región ascendente del gen de la envoltura (upE) y el gen de la nucleocápside (N), que se utilizan para los ensayos de MERS-CoV y SARS-Cov-2, respectivamente35,36. Utilizamos el kit interno de RT-qPCR de un solo paso R3T para establecer la RT-qPCR para la detección de virus37. La detección de virus, la sensibilidad, la especificidad y el rango dinámico de nuestro kit de RT-qPCR de un solo paso R3T y los conjuntos de cebadores se probaron y evaluaron utilizando diluciones en serie de 10 veces de los ARN sintéticos de torsión estándar. El límite de detección práctico más bajo fue de aproximadamente 10 copias de transcripción por reacción. Como resultado, el kit interno de RT-qPCR de un solo paso R3T y los conjuntos de cebadores/sondas se pueden utilizar e implementar con éxito para el diagnóstico simultáneo rutinario de SARS-CoV-2, influenza A, influenza B y SARS-CoV-2, MERS-CoV.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m filter cups</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>291-4545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Tris-Glycine SDS running buffer</td>
			<td>Novex</td>
			<td>LC2675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culturing plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A701-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-238-RH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-1152-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Biotin, 98+%</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A14207.60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH10Bac competent cells</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10361012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>68100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase/Rnase Free Distilled Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21(DE3) competent cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media)</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>96-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A38400-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene (transfection reagent)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I8896-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>56750-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A (H1N1) synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A (H3N2)&#160; synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza B synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I3481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11815-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth media</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L6876-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>13152-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MERS-CoV synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>10310855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini- PROTEAN TGX Precast Gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-1093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-3712-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-5248-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers and Probes</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein marker</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>102024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 insect cells</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A35243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StrepTrap XT 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29401323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB02200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base Molecular Biology Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>22676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Gal</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B1690</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of multiplex real-time rt-qpcr assays for the detection of sars-cov-2, influenza a/b, and mers-cov

El coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2) que causa la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) es una grave amenaza para la salud pública en general. Durante las temporadas de influenza, la propagación del SARS-CoV-2 y otros virus respiratorios puede causar una carga de enfermedades respiratorias en toda la población que es difícil de manejar. Para ello, los virus respiratorios SARS-CoV-2, gripe A, gripe B y síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV) deberán vigilarse cuidadosamente en las próximas temporadas de otoño e invierno, especialmente en el caso del SARS-CoV-2, la gripe A y la gripe B, que comparten factores epidemiológicos similares como las poblaciones susceptibles, el modo de transmisión y los síndromes clínicos. Sin ensayos específicos de objetivos, puede ser difícil diferenciar entre los casos de estos virus debido a sus similitudes. En consecuencia, un ensayo múltiple sensible y dirigido que pueda diferenciar fácilmente entre estas dianas virales será útil para los profesionales sanitarios. En este estudio, desarrollamos un ensayo basado en PCR con transcriptasa inversa en tiempo real utilizando un kit de RT-qPCR de un solo paso R3T desarrollado internamente para la detección simultánea de SARS-CoV-2, influenza A, influenza B y SARS-CoV-2, MERS-CoV. Con tan solo 10 copias de sus ARN sintéticos, podemos identificar con éxito los objetivos del SARS-CoV-2, la gripe A, la gripe B y el MERS-CoV simultáneamente con un 100% de especificidad. Se ha comprobado que este ensayo es preciso, fiable, sencillo, sensible y específico. El método desarrollado se puede utilizar como un ensayo de diagnóstico optimizado para SARS-CoV-2, influenza A, influenza B y SARS-CoV-2, MERS-CoV en hospitales, centros médicos y laboratorios de diagnóstico, así como con fines de investigación.

The pandemic of the ongoing coronavirus disease 2019 (COVID-19) is caused by the novel coronavirus known as the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1. Due to SAR-CoV-2&#39;s strong contagiousness and capacity for rapid transmission, the COVID-19 pandemic emerged in Wuhan City, China, and spread quickly throughout the world. This eventually led to the start of respiratory distress signs and even death2,3,4. COVID-19 has been declared a pandemic in more than 213 countries, expecting a steep increase in the number of confirmed cases, as evidenced by the papers published by different research studies3,5. COVID-19 is transmitted primarily by small respiratory droplets that infected individuals release into the environment and then get exposed to vulnerable individuals through inhalation or close contact with contaminated surfaces. When these droplets come into contact with the mucosa of the eyes, mouth, or nose, a person may become infected6. Statistics released by the World Health Organization (WHO) show that there have been more than 76 million confirmed cases of the pandemic worldwide, with a staggering 7 million deaths7. Thus, the United Nations classified the pandemic caused by COVID-19 disease as a disaster because of its direct impact on the lives of billions of people around the globe and had far-reaching economic, environmental, and social effects.
Public health initiatives including thorough testing, early detection, contact tracing, and case isolation have all been shown to be crucial in keeping this pandemic under control8,9,10,11. The winter months will increase the circulation of other respiratory viruses like Influenza A and B with COVID-19-like symptoms making it difficult to identify, track down, and isolate COVID-19 instances early on. Every year, Influenza A and B outbreak starts in the late fall or early January with a predictable seasonality12. Numerous epidemiological traits are shared by SARS-CoV-2 and Influenza viruses. Besides, sharing similarities in the susceptible populations which include children, the elderly, immunocompromised, and individuals with chronic comorbidities such as asthma, chronic obstructive pulmonary disease, cardiac and renal failure, or diabetes12,13. These viruses not only share vulnerable populations but also transmission routes of contact and respiratory droplets14. It is anticipated that patients may likely contract more than one of these respiratory viruses as flu season approaches14. For that, the screening of SARS-CoV-2 and the Influenza viruses needs to be done on symptomatic patients before they are isolated. Running separate tests for the three viruses (SARS-CoV-2, Influenza A, and Influenza B) is not possible due to the global lack of resources for nucleic acid extraction and diagnostics. In order to screen them all in one reaction, a method or test needs to be developed.
Middle East respiratory syndrome (MERS)-CoV is a human coronavirus (CoV) family member. The first MERS-CoV virus isolates came from a hospitalized patient in Saudi Arabia who had died in September 2012 due to acute respiratory issues15. There is evidence that suggests that a prominent reservoir host for MERS-CoV is dromedary camels. It has been proven that viruses from infected dromedary camels are zoonotic and thus can infect humans16,17. Humans infected with this virus can spread it to others through close contact18. As of January 26th,&#160;2018, there had been 2143 laboratory-confirmed cases of MERS-CoV infection including 750 deaths globally19. The most typical MERS-CoV symptoms are coughing, fever, and shortness of breath. MERS-CoV infections have also been reported to exhibit pneumonia, diarrhea and gastrointestinal sickness symptoms20. Currently, no commercial vaccine or specific treatment for MERS-CoV is available. Therefore, prompt and precise diagnosis is essential for preventing the widespread MERS-CoV outbreaks and differentiating MERS-CoV from SARS-CoV-2 disease.
To date, many approaches have been proposed to detect these viruses such as multiplex RT-PCR21,22,23,24,25, CRISPR/Cas1226,27, CRISPR/Cas928, and CRISPR/Cas329, lateral flow immunoassay30, paper-based biomolecular sensors31, SHERLOCK testing in one pot32, DNA aptamer33, loop-mediated isothermal amplification (LAMP)19,34, etc. Each of the aforementioned methods has unique benefits and drawbacks in terms of sensitivity and specificity. Among these methods, the nucleic acid amplification-based test: multiplex qRT-PCR, is the most common and is considered to be the gold standard for the diagnosis of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and MERS-CoV.
In this study, we designed and assessed various primer combinations and probes for the effective, accurate, and simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV utilizing standard twist synthetic viral RNAs. The multiplexed assays developed for either MERS-CoV or SARS-CoV-2 target genes are recommended by the World Health Organization (WHO). These genes generally encode proteins and complexes that contribute to the formation of a replication/transcription complex (RTC)35 such as the region within the open reading frame 1a (ORF1a) that is used for MERS-CoV assay. In addition, structural proteins are encoded by the genes utilized in diagnostic assays such as the upstream region of envelope gene (upE) and nucleocapsid gene (N) which are used for MERS-CoV and SARS-Cov-2 assays, respectively35,36. We used in-house R3T one-step RT-qPCR kit to establish the RT-qPCR for the detection of viruses37. Virus detection, sensitivity, specificity, and dynamic range of our R3T one-step RT-qPCR kit and primer sets were tested and evaluated using 10-fold serial dilutions of the standard twist synthetic RNAs. The lowest practical detection limit was approximately 10 transcripts copies per reaction. As a result, the in-house R3T one-step RT-qPCR kit and primer/probe sets can be successfully used and implemented for routine simultaneous diagnosis of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV.

Autor destacado: Avances en la detección múltiple de virus respiratorios 

Desarrollo de ensayos multiplex de RT-qPCR en tiempo real para la detección de SARS-CoV-2, influenza A/B y MERS-CoV

En los últimos años, se han producido avances significativos en el abordaje diagnóstico para la detección de virus respiratorios comunes mediante abordajes de PCR 21,22,23,24,25. Sin embargo, a pesar de estos avances, el enfoque multiplexado, que permite detectar múltiples virus en una sola prueba, no se ha implementado ampliamente, particularmente en la ...

Watch this Scientific Journal Video about Advancements in Multiplex Detection of Respiratory Viruses at JoVE.com

Presentamos dos kits internos de RT-qPCR de un solo paso basados en sondas para virus respiratorios comunes. El primer ensayo es para SARS-CoV-2 (N), influenza A (H1N1 y H3N2) e influenza B. El segundo es para SARS-Cov-2 (N) y MERS (UpE y ORF1a). Estos ensayos se pueden implementar con éxito en cualquier laboratorio especializado.

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) that causes Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is a serious threat to the general ...

development-multiplex-real-time-rt-qpcr-assays-for-detection-sars-cov

Research

JoVE Journal

Biology

Development of Multiplex Real-Time RT-qPCR Assays for the Detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and MERS-CoV

742 vistas.  King Abdullah University of Science and Technology (KAUST). Presentamos dos kits internos de RT-qPCR de un solo paso basados en sondas para virus respiratorios comunes. El primer ensayo es para SARS-CoV-2 (N), influenza A (H1N1 y H3N2) e influenza B. El segundo es para SARS-Cov-2 (N) y MERS (UpE y ORF1a). Estos ensayos se pueden implementar con éxito en cualquier laboratorio especializado. 

Video: Autor destacado: Avances en la detección múltiple de virus respiratorios 

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) that causes Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is a serious threat to the general public&#39;s health. During influenza seasons, the spread of SARS-CoV-2 and other respiratory viruses may cause a population-wide burden of respiratory disease that is difficult to manage. For that, the respiratory viruses SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and Middle East respiratory syndrome (MERS-CoV) will need to be carefully watched over in the upcoming fall and winter seasons, particularly in the case of SARS-CoV-2, Influenza A, and Influenza B, which share similar epidemiological factors like susceptible populations, mode of transmission, and clinical syndromes. Without target-specific assays, it can be challenging to differentiate among cases of these viruses owing to their similarities. Accordingly, a sensitive and targeted multiplex assay that can easily differentiate between these viral targets will be useful for healthcare practitioners. In this study, we developed a real-time reverse transcriptase-PCR-based assay utilizing an in-house developed R3T one-step RT-qPCR kit for simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV. With as few as 10 copies of their synthetic RNAs, we can successfully identify SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and MERS-CoV targets simultaneously with 100% specificity. This assay is found to be accurate, reliable, simple, sensitive, and specific. The developed method can be used as an optimized SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV diagnostic assay in hospitals, medical centers, and diagnostic laboratories as well as for research purposes.

We present two probe-based in-house one-step RT-qPCR kits for common respiratory viruses. The first assay is for SARS-CoV-2 (N), Influenza A (H1N1 and H3N2), and Influenza B. The second is for SARS-Cov-2 (N) and MERS (UpE and ORF1a). These assays can be successfully implemented in any specialized laboratory.

Investigación

Biología

Preparation and Testing of Multiplex R3T One-Step RT-qPCR Kit Components

To begin, prepare the 2X buffer for RT-qPCR in DNase/RNase free water. Store the buffer at minus 20 degrees Celsius until further use. Next, mix the primers and the probes in a 1.5 milliliter tube.Make up the volume with elution buffer. Then store the tube at minus 20 degrees Celsius. Prepare an enzyme mix with Taq polymerase and M-MLV RT in a 1.5 milliliter tube on ice.Make up the volume with Taq polymerase storage buffer. Now re-suspend the viral synthetic RNAs in separate tubes with 100 microliters of Tris-EDTA buffer to make stocks of 10 to the sixth RNA copies per microliter. To mix the virus stocks, add five microliters each of SARS-CoV-2 influenza A and B to 50 microliters of Tris-EDTA buffer.Similarly, mix SARS-CoV-2 and MERS-CoV to obtain a second viral mix. Dilute both mixtures tenfold to obtain a final dilution of 10 RNA copies per microliter. To each well of a 96-well plate, pipette 2X buffer, primer, enzyme, DNase/RNase free water, and the corresponding RNA mixtures.Seal the plate with an adhesive plate seal. Then centrifuge the plate for one minute to collect the liquid at the well bottom. Next, program the PCR machine to accept the fast 96-well block type with the experimental type set to standard curve.Set the reagents to TaqMan reagents and select standard run properties. Define the gene targets and the reporter dye. Then define the sample names for each reaction to be tested and assign targets and samples to the plate layout.Now, input the cycle program into the instrument. Transfer the plate to the real-time qPCR machine in the correct orientation and press run to initiate the cycle. Choose the file location to save the experimental data.Then examine the amplification plots provided by the qPCR program. The two developed kits were able to successfully amplify all three target genes simultaneously with as low as 10 RNA copies per reaction. The amplification efficiencies for all viral titrations were above 99%