Разработка мультиплексных ОТ-кПЦР-анализов в режиме реального времени для выявления SARS-CoV-2, гриппа A/B и БВРС-КоВ

Общая цель этого анализа заключается в применении мультиплексного подхода для одновременного обнаружения широко циркулирующих респираторных вирусов, таких как SARS-CoV-2, MERS, грипп А и грипп B. Преобладающие технологии, способствующие прогрессу в нашей области, включают CRISPR, аминоанализы латерального потока, биомолекулярные сенсоры на бумажной основе, тестирование Шерлока в одном горшке, ДНК-аптамеры и мультиплексную ОТ-кПЦР, интегрированную с петлевой изотермической амплификацией. ЛАМПА. Тем не менее, мультиплексная ОТ-кПЦР является наиболее чувствительной, распространенной и является золотым стандартом для диагностики различных вирусов. В настоящее время экспериментальная задача состоит в том, чтобы создать протокол, который можно было бы использовать для обнаружения копий РНК в количестве всего 10 копий.

Для проведения анализа мы использовали собственный набор RT-qPCR, который является эффективным по времени и с минимальными затратами. Для начала приготовьте 2-кратный буфер для ОТ-кПЦР в воде без ДНК/РНК Храните буфер при температуре минус 20 градусов Цельсия до дальнейшего использования. Далее смешайте праймеры и щупы в тубе объемом 1,5 миллилитров.

Пополните объем элюирующим буфером, затем храните тюбик при температуре минус 20 градусов Цельсия. Приготовьте ферментную смесь с taq-полимеразой и MMLV-RT в тубе объемом 1,5 миллилитра на льду. Восполните объем с помощью буфера для хранения taq-полимеразы.

Теперь ресуспендируйте вирусные синтетические РНК в отдельных пробирках со 100 микролитрами буфера Tris-EDTA, чтобы получить запасы от 10 до шестой копии РНК на микролитр. Чтобы смешать вирусные запасы, добавьте по пять микролитров SARS-CoV-2, гриппа А и В к 50 микролитрам буфера Tris-EDTA. Аналогичным образом смешайте SARS-CoV-2 и MERS-CoV, чтобы получить вторую вирусную смесь.

Разведите обе смеси в десять раз, чтобы получить итоговое разведение 10 копий РНК на микролитр. В каждую лунку 96-луночного планшета пипетка 2x буфера, праймера, фермента, воды без ДНК/РНК и соответствующих смесей РНК. Запечатайте пластину клейкой пломбой.

Затем центрифугируйте пластину в течение одной минуты, чтобы собрать жидкость на дне скважины. Затем запрограммируйте ПЦР-машину на прием быстрого 96-луночного блочного типа с экспериментальным типом, установленным на стандартную кривую. Установите реагенты на реагенты TaqMan и выберите стандартные свойства прогона.

Определите гены-мишени и репортерный краситель. Затем определите имена образцов для каждой тестируемой реакции и назначьте цели и образцы на схеме расположения планшетов. Теперь введите программу цикла в прибор.

Перенесите пластину на станок QPCR в режиме реального времени в правильной ориентации и нажмите кнопку запуска, чтобы запустить цикл. Выберите расположение файла для сохранения экспериментальных данных. Затем изучите графики амплификации, предоставленные программой QPCR.

Два разработанных набора смогли успешно амплифицировать все три гена-мишени одновременно, с 10 копиями РНК за реакцию. Эффективность амплификации для всех вирусных титрований была выше 99%