Este trabalho foi apoiado pela Universidade de Ciência e Tecnologia Rei Abdullah através do financiamento principal e do National Term Grand Challenge (NTGC) para S.M.H.

1. Expressão e purificação da Taq polimerase
<ol><li>Construir um plasmídeo com uma etiqueta hexa-histidina clivável no término C da enzima.</li>
	<li>Transformar 50 ng do vetor de expressão em cepa de E. coli BL21-(DE3) seguindo o protocolo padrão38.</li>
	<li>Inocular as células transformadas em quatro frascos de 6 L cada um contendo 2 L de caldo de meio 2YT a 37 °C com agitação a 170 rpm até atingir o OD 600 de 0,8 ou o número de célula 6,4 x 108 .</li>
	<li>Induzir a expressão da Taq polimerase com 0,5 mM de isopropil-β-d-thiogalactopiranosídeo (IPTG) e incubar a 16 °C por 18 h com agitação.</li>
	<li>Colher as células girando-as a 4 °C a 7808 x g durante 10 minutos. Ressuspender os pellets em 200 mL de tampão de lise Taq polimerase gelado (Tabela 1) em 5 mL/g de pellet celular.</li>
	<li>Incubar as células com lisozima (2 mg/mL de tampão de lise) e inibidores de protease por 45 min e, em seguida, passar o lisado através de um disruptor celular a 30 kPsi e centrifugar a 22.040 x g por 30 min a 4 °C para separar os detritos celulares.</li>
	<li>Aquecer o sobrenadante durante 15 min a 85 °C. Gire para baixo a 95.834 x g por 1 h a 4 °C. Recolher o sobrenadante e filtrá-lo no gelo utilizando um filtro de 0,45 μm.</li>
	<li>Realizar a purificação de proteínas usando Cromatografia Líquida de Proteína Rápida (FPLC) passando primeiro a amostra através de uma coluna Ni-NTA HP de 5 mL a 4 mL/min de vazão usando tampão Taq polimerase A (Tabela 2; Figura 1A).</li>
	<li>Lavar com 10 volumes de coluna (CV) de tampão Taq polimerase A e 4% de tampão Taq polimerase B (Tabela 2). Eluir a proteína ligada com um gradiente linear usando Taq polimerase Buffer B acima de 20 CV em um frasco de 100 mL.</li>
	<li>Passar o eluente no frasco de 100 mL através de uma coluna de troca catiônica de 5 mL a 4 mL/min usando tampão Taq polimerase C (Tabela 2; Figura 1A).</li>
	<li>Lavar com 20 CV de tampão Taq polimerase C 100% e tampão D Taq polimerase 5% (Tabela 2).</li>
	<li>Eluir com gradiente linear utilizando tampão Taq polimerase D (Tabela 2) a partir de 5% a 100%.</li>
	<li>Verificar as frações eluídas realizando-se eletroforese em gel SDS-PAGE 39 seguida de coloração em gel 40 conforme descrito anteriormente. Resumidamente, pegue 10 μL de cada fração e adicione um volume igual de 2x corante de carregamento SDS. Desnaturar a amostra a 90oC durante 10 min. Coloque as amostras em gel SDS-PAGE a 10% e passe o gel por 25 min a 200 V. Manchar o gel usando Coomassie Brilliant Blue e depois desmanchar.</li>
	<li>Recolher todas as fracções que contêm Taq polimerase purificada e dialisar contra tampão de armazenamento da taq polimerase (Tabela 3) a 4 °C. Resumidamente, prepare 2 L do tampão de armazenamento e mergulhe o de diálise no tampão por 2 minutos para hidratar. Injete as frações coletadas usando uma agulha no de diálise e deixe-o durante a noite no tampão de diálise a 200 rpm no agitador.</li>
	<li>Após a diálise, medir a concentração de proteínas usando um espectrofotômetro, fazer alíquotas de 10 μL, congelar rapidamente em nitrogênio líquido e armazenar a -80 °C. NOTA: Filtre todos os buffers para purificação usando um filtro de 0,45 μm antes de carregá-los no sistema FPLC.</li>
</ol>2. Expressão de MMLV-RT no sistema de expressão e purificação de células de insetos
<ol><li>Geração e isolamento de DNA bacmid<ol><li>Clone a sequência de MMLV-RT com uma etiqueta TEV-8xHis-Strep clivável C-término conforme descrito anteriormente41.</li>
		<li>Misture 100 ng do vetor de expressão em 50 μL de células DH10Bac e misture suavemente batendo no tubo.</li>
		<li>Incubar as células no gelo por 15 min. Choque térmico das células durante 1 min a 42 °C.</li>
		<li>Transfira imediatamente no gelo e adicione 400 μL de meio S.O.C. Incubar a 37 °C com agitação durante 4 h.</li>
		<li>Placa de 10 μL e 15 μL da mistura em placas de Agar LB contendo três antibióticos; 50 μg/mL de canamicina, 10 μg/mL de tetraciclina e 7 μg/mL de gentamicina, juntamente com 40 μg/mL de IPTG e 100 μg/mL de X-Gal para seleção azul-branca.</li>
		<li>Incubar as placas a 37 °C durante 48 h. Escolha várias colônias brancas e uma colônia azul como controle e volte a colocá-las em placas de ágar LB frescas contendo os antibióticos acima. Incubar as placas durante a noite a 37 °C.</li>
		<li>Após a confirmação do fenótipo branco, escolher algumas colônias e inocular-as em 10 mL de LB contendo 50 μg/mL de canamicina, 10 μg/mL de tetraciclina e 7 μg/mL de gentamicina em tubos de 50 mL.</li>
		<li>Incubar a cultura a 37 °C com agitação a 170 rpm durante a noite. Pellet down as células girando-as para baixo a 22.040 x g por 10 min.</li>
		<li>Decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 250 μL de solução de ressuspensão do kit miniprep (esta solução precisa ser manuseada de acordo com as instruções do fabricante) e, em seguida, transferir a solução para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
		<li>Adicionar 250 μL de solução de lise, misturar suavemente e incubar durante 3 minutos. Adicionar 350 μL de solução neutralizante, inverter 2x-3x e centrifugar a 22.040 x g por 10 min.</li>
		<li>Transferir o sobrenadante para um tubo fresco e adicionar um volume igual de isopropanol gelado e incubar durante 30 minutos a -20 °C.</li>
		<li>Pellet down o DNA precipitado girando a 22.040 x g por 10 min. Descarte o sobrenadante e lave o pellet com 700 μL de etanol gelado a 70%, 2x.</li>
		<li>Retire o sobrenadante com uma pipeta sem tocar no pellet. Deixe o ar do pellet secar na capela de fluxo laminar por 5-10 min ou até que nenhum líquido seja visto no tubo. Dissolva o pellet em 100 μL de tampão EB.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfecção bacmid e amplificação viral<ol><li>Preparação do vírus P1<ol><li>Em uma placa de cultura de tecido de 6 poços, semente ~ 9 x 105 células/poço em 2 mL de meio de cultura de células de insetos.</li>
			<li>Incubar a placa por ~30 min à temperatura ambiente para permitir que as células se fixem.</li>
			<li>Preparar a mistura Bacmid/Fugene da seguinte forma: misturar 1 μg de ADN Bacmid e 300 μL de meios de células de insectos num tubo. Em outro tubo, misturar 8 μL de reagente de transfecção e 300 μL de meio de células de insetos. Misture ambas as misturas por pipetagem suave e deixe por ~30 min à temperatura ambiente para que o complexo reagente bacmid/transfecção se forme.</li>
			<li>Adicione a mistura de complexo bacmid (~210 μL) a cada poço gota a gota e sele a placa com um filme transparente.</li>
			<li>Incubar a placa a 27 °C durante 3-4 dias.</li>
			<li>Pegue o meio que contém o vírus, adicione FBS (concentração final de 2%), filtre usando filtro de 0,45 μm e armazene a 4°C no escuro como estoque de vírus P1.</li>
		</ol></li>
		<li>Preparação do vírus P2<ol><li>Transfectar 50 mL de células de insetos a 2 x 106 células/mL com 3 mL de vírus P1 em um frasco de cultura.</li>
			<li>Incubar a 27 °C com agitação a 100 rpm durante 4-6 dias até que a percentagem de células mortas atinja 25%-30%.</li>
			<li>Centrifugar a 300 x g por 10 min e coletar o sobrenadante que contém o vírus.</li>
			<li>Adicionar FBS a uma concentração final de 2%, filtrar através de filtro de 0,45 μm e alíquota de 1 mL cada e armazenar a -80 °C como estoque de vírus P2.</li>
		</ol></li>
		<li>Preparação do vírus P3<ol><li>Transfectar 100 mL de células de insetos a 2 x 106 células/mL com os 2 mL do vírus P2 em um frasco de cultura.</li>
			<li>Incubar a 27 °C com agitação a 100 rpm durante 3-4 dias até que a percentagem de células mortas atinja 15%-20%.</li>
			<li>Centrifugar as células a 300 x g por 10 min e coletar o sobrenadante que contém o vírus.</li>
			<li>Adicionar FBS a uma concentração final de 2%. Filtrar através de um filtro de 0,45 μm. Pode ser armazenado no escuro a 4 °C por 1 mês.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Expressão e purificação de MMLV-RT em células de insetos<ol><li>Adicionar 5 ml de vírus P3 a células frescas de insectos a uma densidade de 2 x 106 células/ml (frasco de 700 ml/2L) num total de 6 frascos.</li>
		<li>Colher as células após 55-60 h de pós-transfecção girando a 7808 x g por 10 min.</li>
		<li>Ressuspender os pellets celulares em 200 mL de tampão de lise MMLV-RT (Tabela 4). Passar o lisado através de um disruptor celular a 15 kPsi e centrifugar a 22.040 x g durante 30 minutos a 4 °C.</li>
		<li>Transfira o sobrenadante para novos tubos e gire novamente a 95.834 x g a 4 °C por 1 h. Recolher o sobrenadante e filtrá-lo no gelo utilizando um filtro de 0,45 μm.</li>
		<li>Iniciar a purificação da proteína usando FPLC passando primeiro a amostra através da coluna Ni-NTA Excel 5 mL (Figura 1B) a 4 mL/min de fluxo usando o tampão A do MMLV-RT (Tabela 5).</li>
		<li>Lavar a coluna com 10 CV de tampão A e 4% de tampão B MMLV-RT (Tabela 5) e eluir a proteína com gradiente linear de tampão B MMLV-RT acima de 20 CV em frasco de 100 mL.</li>
		<li>Passar a amostra eluída pela coluna Strep 5 mL (Figura 1B) balanceada com tampão C MMLV-RT (Tabela 5).</li>
		<li>Lavar a coluna com 10 CV de tampão C 100% MMLV-RT e eluir a proteína com gradiente linear com 20 CV de tampão D (Tabela 5).</li>
		<li>Verifique as frações eluídas realizando o SDS-PAGE como feito é os passos 1.13.-1.14. e coletar as frações que contêm MMLV-RT purificado para serem dialisadas contra o tampão de armazenamento MMLV-RT (Tabela 6) a 4 °C.</li>
		<li>Medir a concentração de proteínas usando Nanodrop, alíquota, congelamento instantâneo em nitrogênio líquido e armazenar a -80 °C. NOTA: Filtre todos os buffers para purificação usando um filtro de 0,45 μm antes de carregá-los no sistema FPLC.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Preparação interna de componentes do kit RT-qPCR multiplex R3T de uma etapa
<ol><li>Preparação da mistura tampão<ol><li>Prepare o buffer 2x para a reação RT-qPCR que contém os reagentes mostrados anteriormente em37. Preparar todos os reagentes em água DNase/RNase-Free e a mistura tampão armazenada num congelador de -20 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Primers e Sondas Conjuntos e primers preparação de misturas NOTA: Os testes e primers utilizados estão listados na Tabela 7. O kit multiplexado de Influenza e SARS-CoV-2 contém 3 sondas e 4 conjuntos de primers para frente e para trás. As sondas são rotuladas nas extremidades 5′ usando repórteres 6-carboxifluoresceína (FAM) para InfA, Texas Red-XN para SARS-CoV-2 (gene N) e Yakima Yellow para InfB. O kit multiplexado MERS-CoV e SARS-CoV-2 contém 3 sondas e 3 conjuntos de primers para frente e para trás. As sondas também são rotuladas nas extremidades 5′ usando repórteres Texas Red-XN para MERS-CoV (gene ORF1a), VIC para MERS-CoV (gene UpE) e 6-carboxifluoresceína (FAM) SARS-CoV-2 (gene N).<ol><li>Preparar uma mistura de primers contendo todos os primers e sondas listados na Tabela 7 com uma concentração final de 6,7 μM para cada primer forward e reverse e 1,25 μM para cada sonda em um tubo de 1,5 mL. Conservar a mistura de primers no congelador a -20 °C. Use o buffer de eluição para compor o volume necessário.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de misturas enzimáticas<ol><li>Preparar a mistura enzimática Taq polimerase (30 U/μL) e MMLV-RT (60 ng/μL) no tampão de armazenamento da Taq polimerase, conforme mostrado na Tabela 3 , para compor o volume necessário. Execute esta etapa no gelo e armazene a mistura de enzimas a -20 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Modelo de RNA<ol><li>Ressuspender RNAs sintéticos de SARS-CoV-2, Influenza A H1N1, Influenza A H3N2, Influenza B e MERS-CoV separadamente em 100 μL de 1x tampão Tris-EDTA (10 mM Tri-Cl e 1 mM EDTA (pH 8,0) para fazer um estoque de 1 x 106 cópias de RNA/μL.</li>
		<li>Misturar RNAs sintéticos para RT-qPCR nas seguintes configurações: 1) SARS-CoV-2, Influenza A e Influenza B, adicionando 5 μL de cada estoque de vírus a 50 μL de volume para fazer 1 x 105 cópias de RNA/μL; 2) SARS-CoV-2, MERS-CoV adicionando 5 μL de cada estoque de vírus a 50 μL de volume para fazer 1 x 105 cópias de RNA/μL. Faça diluições seriadas de 10 vezes de cada mistura de RNA sintético variando de 1 x 105 cópias de RNA/μL a 10 cópias de RNA/μL. NOTA: Certifique-se de usar água gelada DNase/RNase-Free para preparar a diluição em série dos modelos.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Teste interno multiplexado de SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e SARS-CoV-2, teste RT-qPCR de uma etapa de MERS-CoV
NOTA: Desinfete as superfícies da estação de trabalho e use um modelo de placa de 96 poços para planejar o layout da placa PCR.
<ol><li>Preparação da placa de 96 poços<ol><li>Descongelar 2x tampão e mistura de primers. Mantenha a mistura de enzimas no gelo.</li>
		<li>A cada poço, adicione 10 μL de mistura tampão 2x, 1,5 μL da mistura de primers, 1 μL de mistura enzimática, 6,5 μL de Água Livre de DNase/RNase e 1 μL da mistura de RNA correspondente que precisa ser testada. O volume final em cada poço é de 20 μL. Consulte o layout preparado para obter ajuda com esta etapa. NOTA: Recomenda-se fazer uma mistura mestre com base no número de reações que contêm todos os reagentes, exceto a amostra de RNA, para evitar viés de pipetagem. Além disso, realize as reações em duplicata ou triplicata para evitar erros técnicos.</li>
		<li>Sele a placa com um selo de placa de PCR adesivo e centrífuga brevemente por 1 min para coletar todo o líquido no fundo da placa. Certifique-se de que cada poço tenha o mesmo volume de líquido e esteja livre de bolhas antes de transferir as amostras para a máquina de qPCR. NOTA: Todas as reações de PCR precisam ser configuradas no gelo.</li>
	</ol></li>
	<li>Programa de PCR<ol><li>Abra o programa da máquina qPCR em tempo real e escolha as seguintes propriedades experimentais: O tipo de bloco: Fast 96 poços (0,1 mL) Configuração do experimento: curva padrão Reagentes: Reagentes TaqMan Executar propriedades: Padrão.</li>
		<li>Defina todos os alvos gênicos e seu corante repórter conforme apresentado na Tabela 7. Além disso, definir nomes de amostras para cada reação a ser testada para facilitar a análise das curvas de amplificação.</li>
		<li>Atribua alvos e amostras ao layout da placa do programa com base na placa de 96 poços.</li>
		<li>Defina o seguinte programa de ciclo no instrumento de PCR da seguinte maneira: 55 °C por 10 min 40 ciclos: 94 °C por 1 min 94 °C por 10 s 68 °C por 10 s 68 °C por 20 s; aqui adquirem fluorescência.</li>
		<li>Transfira a placa para a máquina qPCR em tempo real e coloque-a no suporte garantindo a orientação correta da placa e inicie a corrida.</li>
		<li>Escolha o local do arquivo para salvar os dados experimentais.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise de dados<ol><li>É essencial examinar primeiramente as parcelas de amplificação produzidas pelo programa qPCR. Analisar o limite de detecção para avaliar a concentração mínima de RNA que pode ser detectada.</li>
		<li>Plotar o log do número de cópias de RNA no eixo x e o valor Ct médio correspondente no eixo y para avaliar a sensibilidade do ensaio. A inclinação e o R2 indicam a confiabilidade e eficiência da reação.</li>
	</ol></li>
</ol>

Ensaio multiplex de RT-qPCR para detecção de vírus respiratórios

Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.

Há uma pesada carga econômica sobre o sistema de saúde em todo o mundo resultante das altas taxas de infecção e mortalidade devido à disseminação de vírus respiratórios comuns, como as variantes SARS-CoV-2, Influenza A/B e MERS-CoV 12,19,20. Motivados pelo senso de responsabilidade em aliviar essa carga, percebemos a necessidade de um ensaio diagnóstico rápido, preciso e acessível, como o RT-qPCR, para distinguir en...

A pandemia da doença 2019 do coronavirus em curso (COVID-19) é causada pelo novo coronavirus conhecido como coronavirus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2)1. Devido à forte contagiosidade do SAR-CoV-2 e à capacidade de transmissão rápida, a pandemia de COVID-19 surgiu na cidade de Wuhan, na China, e se espalhou rapidamente pelo mundo. Isso acabou levando ao aparecimento de sinais de desconforto respiratório e até mesmo à morte 2,3,4. A COVID-19 foi declarada pandemia em mais de 213 países, esperando-se um aumento acentuado no número de casos confirmados, como evidenciado pelos trabalhos publicados por diferentes estudos de pesquisa 3,5. A COVID-19 é transmitida principalmente por pequenas gotículas respiratórias que os indivíduos infectados liberam no ambiente e depois são expostos a indivíduos vulneráveis por inalação ou contato próximo com superfícies contaminadas. Quando essas gotículas entram em contato com a mucosa dos olhos, boca ou nariz, a pessoa pode se infectar6. Estatísticas divulgadas pela Organização Mundial da Saúde (OMS) mostram que houve mais de 76 milhões de casos confirmados da pandemia no mundo, com impressionantes 7 milhões demortes7. Assim, as Nações Unidas classificaram a pandemia causada pela doença COVID-19 como um desastre por causa de seu impacto direto na vida de bilhões de pessoas em todo o mundo e teve efeitos econômicos, ambientais e sociais de longo alcance.
Iniciativas de saúde pública, incluindo testes completos, detecção precoce, rastreamento de contatos e isolamento de casos, têm se mostrado cruciais para manter a pandemia sob controle 8,9,10,11. Os meses de inverno aumentarão a circulação de outros vírus respiratórios como Influenza A e B com sintomas semelhantes aos da COVID-19, dificultando a identificação, rastreamento e isolamento de casos de COVID-19 no início. Todos os anos, o surto de Influenza A e B inicia-se no final do outono ou início de janeiro, com uma sazonalidade previsível12. Numerosas características epidemiológicas são compartilhadas pelos vírus SARS-CoV-2 e Influenza. Além disso, compartilham semelhanças nas populações suscetíveis que incluem crianças, idosos, imunocomprometidos e indivíduos com comorbidades crônicas, como asma, doença pulmonar obstrutiva crônica, insuficiência cardíaca e renal ou diabetes 12,13. Esses vírus não apenas compartilham populações vulneráveis, mas também vias de transmissão de contato e gotículas respiratórias14. Prevê-se que os pacientes possam provavelmente contrair mais de um desses vírus respiratórios à medida que a temporada de gripe se aproxima14. Para isso, o rastreamento do SARS-CoV-2 e dos vírus Influenza precisa ser feito em pacientes sintomáticos antes de serem isolados. A realização de testes separados para os três vírus (SARS-CoV-2, Influenza A e Influenza B) não é possível devido à falta global de recursos para extração e diagnóstico de ácidos nucleicos. A fim de triá-los todos em uma reação, um método ou teste precisa ser desenvolvido.
A síndrome respiratória do Oriente Médio (MERS)-CoV é um membro da família do coronavírus humano (CoV). Os primeiros isolados do vírus MERS-CoV vieram de um paciente hospitalizado na Arábia Saudita que morreu em setembro de 2012 devido a problemas respiratórios agudos15. Há evidências que sugerem que um hospedeiro reservatório proeminente para o MERS-CoV são os camelos dromedários. Está comprovado que vírus de camelos dromedários infectados são zoonóticos e, portanto, podem infectar humanos16,17. Humanos infectados com esse vírus podem transmiti-lo a outras pessoas por meio de contato próximo18. Até 26 de janeiro de 2018, havia 2143 casos confirmados laboratorialmente de infecção por MERS-CoV, incluindo 750 mortes em todo o mundo19. Os sintomas mais típicos do MERS-CoV são tosse, febre e falta de ar. Também foram relatados que infecções por MERS-CoV apresentam sintomas de pneumonia, diarreia e doença gastrointestinal20. Atualmente, nenhuma vacina comercial ou tratamento específico para MERS-CoV está disponível. Portanto, o diagnóstico rápido e preciso é essencial para prevenir os surtos generalizados de MERS-CoV e diferenciar o MERS-CoV da doença SARS-CoV-2.
Até o momento, muitas abordagens têm sido propostas para detectar esses vírus, tais como RT-PCR multiplex 21,22,23,24,25, CRISPR/Cas12 26,27, CRISPR/Cas928 e CRISPR/Cas329, imunoensaio de fluxo lateral30, sensores biomoleculares baseados em papel31, teste de SHERLOCK em um pote32, DNA aptamer33, isotérmico mediado por loop amplificação (LAMP)19,34, etc. Cada um dos métodos acima mencionados tem benefícios e desvantagens únicas em termos de sensibilidade e especificidade. Entre esses métodos, o teste baseado em amplificação de ácido nucleico: multiplex qRT-PCR, é o mais comum e é considerado o padrão-ouro para o diagnóstico de SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e MERS-CoV.
Neste estudo, nós projectamos e avaliamos várias combinações do primer e sondas para a detecção eficaz, exacta, e simultânea de SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, e SARS-CoV-2, MERS-CoV utilizando RNAs virais sintéticos da torção padrão. Os ensaios multiplexados desenvolvidos para os genes-alvo do MERS-CoV ou do SARS-CoV-2 são recomendados pela Organização Mundial da Saúde (OMS). Esses genes geralmente codificam proteínas e complexos que contribuem para a formação de um complexo de replicação/transcrição (RTC)35, como a região dentro do open reading frame 1a (ORF1a) que é usada para o ensaio MERS-CoV. Além disso, as proteínas estruturais são codificadas pelos genes utilizados em ensaios diagnósticos, tais como a região a montante do gene do envelope (upE) e o gene do nucleocapsídeo (N), que são usados para ensaios MERS-CoV e SARS-Cov-2, respectivamente 35,36. Usamos o kit interno de RT-qPCR de uma etapa R3T para estabelecer o RT-qPCR para a detecção de vírus37. A detecção do vírus, a sensibilidade, a especificidade e a faixa dinâmica do nosso kit RT-qPCR de uma etapa R3T e dos conjuntos de primers foram testados e avaliados usando diluições seriadas de 10 vezes dos RNAs sintéticos de torção padrão. O menor limite prático de detecção foi de aproximadamente 10 cópias transcritas por reação. Como resultado, o kit RT-qPCR de uma etapa R3T interno e conjuntos de primer/sonda podem ser usados e implementados com sucesso para diagnóstico simultâneo de rotina de SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e SARS-CoV-2, MERS-CoV.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m filter cups</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>291-4545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Tris-Glycine SDS running buffer</td>
			<td>Novex</td>
			<td>LC2675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culturing plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A701-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-238-RH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-1152-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Biotin, 98+%</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A14207.60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH10Bac competent cells</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10361012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>68100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase/Rnase Free Distilled Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21(DE3) competent cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media)</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>96-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A38400-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene (transfection reagent)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I8896-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>56750-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A (H1N1) synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A (H3N2)&#160; synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza B synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I3481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11815-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth media</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L6876-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>13152-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MERS-CoV synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>10310855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini- PROTEAN TGX Precast Gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-1093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-3712-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-5248-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers and Probes</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein marker</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>102024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 insect cells</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A35243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StrepTrap XT 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29401323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB02200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base Molecular Biology Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>22676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Gal</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B1690</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of multiplex real-time rt-qpcr assays for the detection of sars-cov-2, influenza a/b, and mers-cov

O coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) que causa a doença 2019 do coronavirus (COVID-19) é uma séria ameaça à saúde pública em geral. Durante as temporadas de gripe, a disseminação do SARS-CoV-2 e de outros vírus respiratórios pode causar uma carga populacional de doença respiratória difícil de controlar. Para isso, os vírus respiratórios SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e Síndrome Respiratória do Oriente Médio (MERS-CoV) precisarão ser cuidadosamente observados nas próximas temporadas de outono e inverno, particularmente no caso do SARS-CoV-2, Influenza A e Influenza B, que compartilham fatores epidemiológicos semelhantes, como populações suscetíveis, modo de transmissão e síndromes clínicas. Sem ensaios alvo-específicos, pode ser difícil diferenciar entre os casos desses vírus devido às suas semelhanças. Assim, um ensaio multiplex sensível e direcionado que possa facilmente diferenciar entre esses alvos virais será útil para os profissionais de saúde. Neste estudo, nós desenvolvemos um ensaio baseado em transcriptase reversa em tempo real utilizando um kit RT-qPCR de uma etapa R3T desenvolvido internamente para detecção simultânea de SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, e SARS-CoV-2, MERS-CoV. Com apenas 10 cópias de seus RNAs sintéticos, podemos identificar com sucesso alvos SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e MERS-CoV simultaneamente com 100% de especificidade. Este ensaio é encontrado para ser preciso, confiável, simples, sensível e específico. O método desenvolvido pode ser usado como um ensaio de diagnóstico SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e SARS-CoV-2 otimizado em hospitais, centros médicos e laboratórios de diagnóstico, bem como para fins de pesquisa.

The pandemic of the ongoing coronavirus disease 2019 (COVID-19) is caused by the novel coronavirus known as the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1. Due to SAR-CoV-2&#39;s strong contagiousness and capacity for rapid transmission, the COVID-19 pandemic emerged in Wuhan City, China, and spread quickly throughout the world. This eventually led to the start of respiratory distress signs and even death2,3,4. COVID-19 has been declared a pandemic in more than 213 countries, expecting a steep increase in the number of confirmed cases, as evidenced by the papers published by different research studies3,5. COVID-19 is transmitted primarily by small respiratory droplets that infected individuals release into the environment and then get exposed to vulnerable individuals through inhalation or close contact with contaminated surfaces. When these droplets come into contact with the mucosa of the eyes, mouth, or nose, a person may become infected6. Statistics released by the World Health Organization (WHO) show that there have been more than 76 million confirmed cases of the pandemic worldwide, with a staggering 7 million deaths7. Thus, the United Nations classified the pandemic caused by COVID-19 disease as a disaster because of its direct impact on the lives of billions of people around the globe and had far-reaching economic, environmental, and social effects.
Public health initiatives including thorough testing, early detection, contact tracing, and case isolation have all been shown to be crucial in keeping this pandemic under control8,9,10,11. The winter months will increase the circulation of other respiratory viruses like Influenza A and B with COVID-19-like symptoms making it difficult to identify, track down, and isolate COVID-19 instances early on. Every year, Influenza A and B outbreak starts in the late fall or early January with a predictable seasonality12. Numerous epidemiological traits are shared by SARS-CoV-2 and Influenza viruses. Besides, sharing similarities in the susceptible populations which include children, the elderly, immunocompromised, and individuals with chronic comorbidities such as asthma, chronic obstructive pulmonary disease, cardiac and renal failure, or diabetes12,13. These viruses not only share vulnerable populations but also transmission routes of contact and respiratory droplets14. It is anticipated that patients may likely contract more than one of these respiratory viruses as flu season approaches14. For that, the screening of SARS-CoV-2 and the Influenza viruses needs to be done on symptomatic patients before they are isolated. Running separate tests for the three viruses (SARS-CoV-2, Influenza A, and Influenza B) is not possible due to the global lack of resources for nucleic acid extraction and diagnostics. In order to screen them all in one reaction, a method or test needs to be developed.
Middle East respiratory syndrome (MERS)-CoV is a human coronavirus (CoV) family member. The first MERS-CoV virus isolates came from a hospitalized patient in Saudi Arabia who had died in September 2012 due to acute respiratory issues15. There is evidence that suggests that a prominent reservoir host for MERS-CoV is dromedary camels. It has been proven that viruses from infected dromedary camels are zoonotic and thus can infect humans16,17. Humans infected with this virus can spread it to others through close contact18. As of January 26th,&#160;2018, there had been 2143 laboratory-confirmed cases of MERS-CoV infection including 750 deaths globally19. The most typical MERS-CoV symptoms are coughing, fever, and shortness of breath. MERS-CoV infections have also been reported to exhibit pneumonia, diarrhea and gastrointestinal sickness symptoms20. Currently, no commercial vaccine or specific treatment for MERS-CoV is available. Therefore, prompt and precise diagnosis is essential for preventing the widespread MERS-CoV outbreaks and differentiating MERS-CoV from SARS-CoV-2 disease.
To date, many approaches have been proposed to detect these viruses such as multiplex RT-PCR21,22,23,24,25, CRISPR/Cas1226,27, CRISPR/Cas928, and CRISPR/Cas329, lateral flow immunoassay30, paper-based biomolecular sensors31, SHERLOCK testing in one pot32, DNA aptamer33, loop-mediated isothermal amplification (LAMP)19,34, etc. Each of the aforementioned methods has unique benefits and drawbacks in terms of sensitivity and specificity. Among these methods, the nucleic acid amplification-based test: multiplex qRT-PCR, is the most common and is considered to be the gold standard for the diagnosis of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and MERS-CoV.
In this study, we designed and assessed various primer combinations and probes for the effective, accurate, and simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV utilizing standard twist synthetic viral RNAs. The multiplexed assays developed for either MERS-CoV or SARS-CoV-2 target genes are recommended by the World Health Organization (WHO). These genes generally encode proteins and complexes that contribute to the formation of a replication/transcription complex (RTC)35 such as the region within the open reading frame 1a (ORF1a) that is used for MERS-CoV assay. In addition, structural proteins are encoded by the genes utilized in diagnostic assays such as the upstream region of envelope gene (upE) and nucleocapsid gene (N) which are used for MERS-CoV and SARS-Cov-2 assays, respectively35,36. We used in-house R3T one-step RT-qPCR kit to establish the RT-qPCR for the detection of viruses37. Virus detection, sensitivity, specificity, and dynamic range of our R3T one-step RT-qPCR kit and primer sets were tested and evaluated using 10-fold serial dilutions of the standard twist synthetic RNAs. The lowest practical detection limit was approximately 10 transcripts copies per reaction. As a result, the in-house R3T one-step RT-qPCR kit and primer/probe sets can be successfully used and implemented for routine simultaneous diagnosis of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV.

Autor em destaque: Avanços na detecção multiplex de vírus respiratórios 

Desenvolvimento de ensaios RT-qPCR multiplex em tempo real para a detecção de SARS-CoV-2, Influenza A/B e MERS-CoV

Nos últimos anos, houve avanços significativos na abordagem diagnóstica para detecção de vírus respiratórios comuns por meio de PCR21,22,23,24,25. No entanto, apesar desses avanços, a abordagem multiplexada, que permite detectar vários vírus em um único teste, não foi amplamente implementada, particularmente na plataforma RT-qPCR. Este método foi ...

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Apresentamos dois kits internos de RT-qPCR de uma etapa baseados em sonda para vírus respiratórios comuns. O primeiro ensaio é para SARS-CoV-2 (N), Influenza A (H1N1 e H3N2) e Influenza B. O segundo é para SARS-Cov-2 (N) e MERS (UpE e ORF1a). Estes ensaios podem ser implementados com sucesso em qualquer laboratório especializado.

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) that causes Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is a serious threat to the general ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Development of Multiplex Real-Time RT-qPCR Assays for the Detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and MERS-CoV

674 visualizações.  King Abdullah University of Science and Technology (KAUST). Apresentamos dois kits internos de RT-qPCR de uma etapa baseados em sonda para vírus respiratórios comuns. O primeiro ensaio é para SARS-CoV-2 (N), Influenza A (H1N1 e H3N2) e Influenza B. O segundo é para SARS-Cov-2 (N) e MERS (UpE e ORF1a). Estes ensaios podem ser implementados com sucesso em qualquer laboratório especializado. 