Desenvolvimento de ensaios RT-qPCR multiplex em tempo real para a detecção de SARS-CoV-2, Influenza A/B e MERS-CoV

O objetivo geral deste ensaio é administrar uma abordagem multiplex para a detecção simultânea de vírus respiratórios comumente circulantes, como SARS-CoV-2, MERS, influenza A e influenza B. As tecnologias predominantes que impulsionam os avanços em nosso campo incluem CRISPR, ensaios amino de fluxo lateral, sensores biomoleculares baseados em papel, teste de Sherlock em um pote, aptâmeros de DNA e RT-qPCR multiplex integrado com amplificação isotérmica mediada por loop, LÂMPADA. No entanto, o RT-qPCR multiplex é o mais sensível, comum e é o padrão-ouro para diagnosticar vários vírus. O desafio experimental atual é estabelecer um protocolo que possa ser usado para detectar cópias de RNAs tão baixas quanto 10 cópias.

Usamos o kit interno de RT-qPCR para o ensaio, que é econômico e de tempo. Para começar, prepare o tampão 2x para RT-qPCR em água livre de DNAs/RNAs Armazene o tampão a menos 20 graus Celsius até uso posterior. Em seguida, misture os primers e as sondas em um tubo de 1,5 mililitro.

Completar o volume com tampão de eluição e, em seguida, armazenar o tubo a menos 20 graus Celsius. Prepare uma mistura enzimática com taq polimerase e MMLV-RT em um tubo de 1,5 mililitro no gelo. Aumente o volume com tampão de armazenamento da taq polimerase.

Agora ressuspenda os RNAs sintéticos virais em tubos separados com 100 microlitros de tampão Tris-EDTA para fazer estoques de 10 a sextas cópias de RNA por microlitro. Para misturar os estoques de vírus, adicione cinco microlitros de SARS-CoV-2, influenza A e B a 50 microlitros de tampão Tris-EDTA. Da mesma forma, misture SARS-CoV-2 e MERS-CoV para obter uma segunda mistura viral.

Diluir ambas as misturas dez vezes para obter uma diluição final de 10 cópias de RNA por microlitro. Para cada poço de uma placa de 96 poços, pipete 2x tampão, primer, enzima, água livre de DNAs/RNAs e as misturas de RNA correspondentes. Sele a placa com um selo de placa adesiva.

Em seguida, centrifugue a placa por um minuto para coletar o líquido no fundo do poço. Em seguida, programe a máquina de PCR para aceitar o tipo de bloco rápido de 96 poços com o tipo experimental definido para a curva padrão. Defina os reagentes para reagentes TaqMan e selecione as propriedades de execução padrão.

Defina os alvos genéticos e o corante repórter. Em seguida, defina os nomes das amostras para cada reação a ser testada e atribua alvos e amostras ao layout da placa. Agora insira o programa de ciclo no instrumento.

Transfira a placa para a máquina QPCR em tempo real na orientação correta e pressione run para iniciar o ciclo. Escolha o local do arquivo para salvar os dados experimentais. Em seguida, examine os gráficos de amplificação fornecidos pelo programa QPCR.

Os dois kits desenvolvidos foram capazes de amplificar com sucesso todos os três genes-alvo simultaneamente, com apenas 10 cópias de RNA por reação. As eficiências de amplificação para todas as titulações virais foram superiores a 99%