Araştırmamız, akupunkturun viseral ağrı üzerindeki analjezik etkilerini anlatan nöronlar ve somatosensoriyel sistem devreleri üzerine odaklanırken, nöro DRG'nin akupunktur uyaranlarına nöron yanıtlarını ayarlamaya çalışmaktadır. Elektro kayıt gibi geleneksel yöntemler, in vivo olarak viseral veya somatik duyarlı nöronları tanımlamak için yeterli hücre sayılarını ve farklı spesifik hücresel bağları verimli bir şekilde inceleyemez. Akupunkturun analjezik etkisinde DRG nöronunun fonksiyonel rollerini incelemek, teknolojik kısıtlamalar nedeniyle zor olmuştur.
Altı numaralı DRG nöronunun in vivo olarak intrakolonik ve akupunktur simülasyonuna olan sorumluluğunu gözlemlemek için genel bir yaklaşım getirdik. Protokol, somatik ve iç organ girdisine yanıt olarak DRG nöronlarının aktivitesini in vivo olarak gözlemleme prosedürlerini ana hatlarıyla belirtir. Bu, yalnızca somatik uyaranlar altında L5 DRG'deki nöron tepkilerini araştırmaya odaklanan önceki çalışmaya göre bir gelişmedir.
Gelecekte, doğru kurulumla, DRG in vivo CAS görüntüleme torasik veya servikal segmentlerde yapılabilir ve bu da viseral nosisepsiyon ve akupunktur etkilerini incelemek için daha güçlü bir araç sağlar. Bu yöntem, akupunktur araştırmacılarının öğrenmesi için gereklidir. Başlamak için, trakeostomili fareyi ısıtma yastığı üzerinde yüzüstü konuma getirin.
Alt sırtta yedi santimetre uzunluğunda bir orta hat kesisi yapın ve beşinci belden birinci sakral omurlara kadar uzatın. Ardından, üç omurun dikenli süreçlerini ortaya çıkarmak için longissimus lumborum kaslarını dikkatlice bir kenara koyun. Bilateral longissimus lumborum, dorsal lomber omurga kasları ve dorsal lomber yarı omurga kaslarının iç kısımlarını, omurların ortasındaki kayıt segmenti ile ardışık üç eklem ve memeli sürecini ortaya çıkarmak için hareket ettirin.
Şimdi, komşu omurların bilateral eklem süreçleri üzerinde hayvanı diş forseps ile güvenli bir şekilde hareketsiz hale getirin. Lomber dört veya altı omurun sol veya sağ eklem ve memeli süreçlerini çıkarmak için rongeur forseps kullanın. Üzerindeki bağ dokularını temizledikten sonra sol veya sağ lomber six DRG'yi dikkatlice açığa çıkarın.
Bel altı omurun seçilen tarafında epinöryumun sağlam kaldığından emin olun. Aktif durumu korumak için açıkta kalan DRG alanlarını tuzlu suya batırılmış küçük pamuk toplarla örtün. Şimdi, fareleri entübe etmek için düşük akışlı anestezi dağıtım sistemini trakeal kanüle bağlayın.
Hayvanı, açıkta kalan DRG ile özelleştirilmiş bir omurga kelepçesinin sahnesinde bulunan bir ısıtma yastığına yerleştirin. Komşu omurların omurgalarında iki kelepçe kullanarak, test sırasında hareketi en aza indirmek için hayvanı sabitleyin. Ardından, tuzlu suyla ıslatılmış pamuk toplarını cerrahi alan yeterince temiz olana kadar değiştirin.
Özelleştirilmiş omurga kelepçesini özel olarak tasarlanmış mikroskop aşamasına yerleştirin. Görüntüleme için, konfokal bir mikroskoptan alınan uzun çalışma mesafeli bir hava objektif merceğini açıkta kalan DRG'nin üzerine yerleştirin. Adım başına 25 mikrometre ve 512 x 512 veya 1.024 x 1.024 piksel çözünürlüğe sahip sağlam lomber dört veya altı DRG'nin hızlandırılmış Z yığınlarını yakalayın.
DRG'nin XYZT taramasını bir ila üç temel durumu, iki ila üç akupunktur veya viseral kolorektal distansiyon uyaranını ve bir ila iki uyaran sonrası durumu kapsayan dört ila sekiz yığınla gerçekleştirin. Ardından, görüntülenen DRG nöronlarının en hassas alıcı alanını değerlendirmek için hayvanın alt sırtına, arka bacağına veya arka pençesine fırçalama veya çimdikleme uyaranları uygulayın. Akupunktur uyaranlarını manuel olarak veya piyasada bulunan bir akupunktur noktası ve sinir stimülatörü kullanarak uygulayın.
Viseral uyaranları indüklemek için kendi kendine yapılan bir hava basıncı göstergesi ile kolorektal distansiyon kullanın. Konfokal bir mikroskop kullanarak, somatik veya viseral uyaranları takiben hücre içi kalsiyuma bağlandıktan sonra nöronal GCaMP'nin yeşil floresansındaki artışı ölçün. Görüntüleme yazılımını kullanarak, renk seçeneğini kullanarak videoyu aydınlatın.
Görünür hücreleri manuel olarak tanımlayın ve hücre boyutunu ve nispi floresan yoğunluğunu belirleyin. Floresan yoğunluğunu, maksimum uyarılmış floresanstaki artışın bazal seviyeye oranı olarak ifade edin. Lomber altı DRG nöronları genellikle temel GFP floresansından yoksundur, muhtemelen GCaMP ekspresyon seviyelerinden ve cerrahi hasardan etkilenir.
Kolorektal distansiyon uyaranları, GCaMP floresansında hızlı, geçici bir artışa neden oldu. BL25 elektroakupunktur uygulamasında da benzer tepkiler gözlenmiştir. Isı haritaları ve çizgi çizelgeleri, daire içine alınmış tüm nöronların kolorektal distansiyon ve BL25 elektroakupunktura tepkilerini gösterdi.
Histogram, kolorektal distansiyona ve BL25 elektroakupunktura duyarlı nöronların çaplarını gösterir.
