In Vivo Calcium Imaging of Dorsal Root Ganglia Neurons' Response to Somatic and Visceral Stimuli

私たちの研究は、鍼治療の鎮痛効果が内臓痛に及ぼす影響を語る神経細胞と体性感覚系の回路を中心に研究し、鍼治療刺激に対する神経DRGのニューロン応答を調整しようとしています。電子記録などの従来の方法では、in vivoで内臓または体細胞応答性ニューロンを特定するための十分な細胞数と明確な特定の細胞結合を効率的に調べることはできません。鍼治療の鎮痛効果におけるDRGニューロンの機能的役割を研究することは、技術的な制約のために困難でした。

私たちは、in vivoでの結腸内および鍼治療シミュレーションに対する6番DRGニューロンの役割を観察するための一般的なアプローチを導入しました。このプロトコルは、体細胞および内臓の入力に応答してin vivoでDRGニューロンの活動を観察するための手順を概説しています。これは、体細胞刺激下でのL5 DRGのニューロン応答の調査のみに焦点を当てた以前の研究からの改善です。

将来的には、適切なセットアップにより、DRG in vivo CASイメージングを胸部または頸部で行うことができ、内臓侵害受容および鍼治療効果を研究するためのより強力なツールを提供します。この方法は、鍼灸の研究者が学ぶために不可欠です。まず、気管切開したマウスを加熱パッドの腹臥位に置きます。

腰に7センチメートルの長さの正中線切開を行い、それを第5腰椎から第1仙椎まで延長します。次に、腰部長筋を慎重に脇に動かして、3つの椎骨の棘突起を露出させます。両側の腰長筋、背側腰椎筋、および背側腰椎半脊椎筋の内側を動かして、椎骨の中央に記録セグメントがある連続する3つの関節および乳房突起を露出させます。

次に、隣接する椎骨の両側関節突起に歯の鉗子で動物をしっかりと固定します。ロンジャー鉗子を使用して、腰椎の4つまたは6つの椎骨の左右の関節および乳房の突起を取り除きます。その上の結合組織を取り除いた後、左右の腰椎6つのDRGを慎重に露出させます。

腰椎の6つの椎骨の選択した側に神経上膜を無傷に保つことを確認してください。露出したDRG領域を生理食塩水に浸した小さな綿球で覆い、活動状態を維持します。次に、低流量麻酔送達システムを気管カニューレに接続して、マウスに挿管します。

DRGが露出した動物を、カスタマイズされた脊椎クランプのステージにある加熱パッドに配置します。隣接する椎骨の脊柱に2つのクランプを使用して、試験中の動きを最小限に抑えるために動物を固定します。次に、生理食塩水で濡らしたコットンボールを、手術部位が十分にきれいになるまで交換します。

カスタマイズした脊椎クランプをカスタムデザインの顕微鏡ステージに挿入します。イメージングには、共焦点顕微鏡からの長作動距離の空気対物レンズを露出したDRGの上に配置します。無傷の腰椎4または6DRGのタイムラプスZスタックを、ステップあたり25マイクロメートル、512×512または1,024×1,024ピクセルの解像度でキャプチャします。

1〜3つのベースライン状態、2〜3つの鍼治療または内臓結腸直腸膨満刺激、および1〜2つの刺激後状態を含む、4〜8つのスタックでDRGのXYZTスキャンを実行します。次に、動物の腰、後肢、または後足にブラッシングまたはピンチ刺激を適用して、画像化されたDRGニューロンの最も感度の高い受容野を評価します。鍼治療の刺激は手動で投与するか、市販のツボと神経刺激装置を使用して投与します。

自作の空気圧計で結腸直腸の膨張を利用して、内臓刺激を誘発します。共焦点顕微鏡を使用して、体細胞刺激または内臓刺激後に細胞内カルシウムに結合したときのニューロンGCaMPの緑色蛍光の増加を測定します。イメージングソフトウェアを使用して、カラーオプションを使用してビデオを明るくします。

可視細胞を手動で描写し、細胞サイズと相対的な蛍光強度を確認します。蛍光強度は、最大誘発蛍光の増加を基底レベルに対する比率として表します。腰椎の6つのDRGニューロンは、一般にベースラインのGFP蛍光を欠いており、これはおそらくGCaMP発現レベルと外科的損傷の影響を受けます。

結腸直腸膨満刺激は、GCaMP蛍光の急速で一時的な増加を誘発しました。BL25電気鍼治療の適用でも同様の反応が観察されました。ヒートマップと折れ線グラフは、結腸直腸膨満とBL25電気鍼治療に対するすべての丸で囲まれたニューロンの応答を示しました。

ヒストグラムは、結腸直腸膨満とBL25電気鍼治療に対する応答性ニューロンの直径を示しています。