Unsere Forschung konzentriert sich auf die Neuronen und die Schaltkreise des somatosensorischen Systems, die an der Erzählung der analgetischen Wirkung der Akupunktur auf viszerale Schmerzen beteiligt sind, während wir versuchen, die neuronalen Reaktionen der Neuro-DRG auf Akupunkturreize anzupassen. Traditionelle Methoden, wie z. B. die Elektroaufzeichnung, können die ausreichende Zellzahl und die eindeutigen spezifischen zellulären Bindungen zur Identifizierung der viszeralen oder somatischen responsiven Neuronen in vivo nicht effizient untersuchen. Die Untersuchung der funktionellen Rolle des DRG-Neurons bei der analgetischen Wirkung der Akupunktur war aufgrund technologischer Einschränkungen schwierig.
Wir haben einen allgemeinen Ansatz eingeführt, um die Verantwortung eines DRG-Neurons mit der Nummer sechs für die intrakolonische und Akupunktursimulation in vivo zu beobachten. Das Protokoll beschreibt die Verfahren zur Beobachtung der Aktivität von DRG-Neuronen in vivo als Reaktion auf somatische und eingeweidete Eingaben. Dies ist eine Verbesserung gegenüber der vorherigen Studie, die sich nur auf die Untersuchung der Neuronenantworten in L5 DRG unter den somatischen Stimuli konzentrierte.
In Zukunft kann mit dem richtigen Setup die DRG-In-vivo-CAS-Bildgebung im thorakalen oder zervikalen Segment durchgeführt werden, was ein leistungsfähigeres Werkzeug zur Untersuchung von viszeralen Nozizeption- und Akupunktureffekten darstellt. Diese Methode ist für Akupunkturforscher unerlässlich, um sie zu lernen. Platzieren Sie zunächst die tracheotomierte Maus in Bauchlage auf dem Heizkissen.
Machen Sie einen sieben Zentimeter langen Schnitt in der Mittellinie im unteren Rücken und verlängern Sie ihn vom fünften Lendenwirbel bis zum ersten Kreuzbeinwirbel. Schieben Sie dann vorsichtig die Muskeln des Longissimus lumborum zur Seite, um die Dornfortsätze der drei Wirbel freizulegen. Bewegen Sie die inneren Teile des beidseitigen Longissimus lumborum, der dorsalen Lendenwirbelsäulenmuskulatur und der dorsalen Lendenwirbelsäulenmuskulatur, um die drei aufeinanderfolgenden Gelenk- und Brustfortsätze mit dem Aufzeichnungssegment in der Mitte der Wirbel freizulegen.
Nun fixieren Sie das Tier mit einer Zahnzange sicher an den beidseitigen Gelenkfortsätzen der benachbarten Wirbel. Verwenden Sie eine Rongeur-Pinzette, um den linken oder rechten Gelenk- und Brustfortsatz der vier oder sechs Wirbel der Lendenwirbel zu entfernen. Legen Sie vorsichtig die linke oder rechte Lendenwirbelsäule frei, nachdem Sie das darüber liegende Bindegewebe gereinigt haben.
Achten Sie darauf, dass das Epineurium auf der gewählten Seite der sechs Lendenwirbel intakt bleibt. Decken Sie die freiliegenden DRG-Bereiche mit kleinen Wattebällchen ab, die in Kochsalzlösung getränkt sind, um den aktiven Zustand zu erhalten. Verbinden Sie nun das Low-Flow-Anästhesiesystem mit der Trachealkanüle, um die Mäuse zu intubieren.
Positionieren Sie das Tier mit dem freiliegenden DRG auf einem Heizkissen, das sich auf dem Tisch einer individuell angefertigten Wirbelsäulenklemme befindet. Sichern Sie das Tier mit zwei Klammern an den Wirbelsäulen der benachbarten Wirbel, um die Bewegung während des Tests zu minimieren. Tauschen Sie dann die mit Kochsalzlösung benetzten Wattebällchen aus, bis der Operationsbereich ausreichend sauber ist.
Setzen Sie die kundenspezifische Wirbelsäulenklemme in den speziell angefertigten Mikroskoptisch ein. Positionieren Sie für die Bildgebung eine Luftobjektivlinse mit großem Arbeitsabstand von einem konfokalen Mikroskop über dem belichteten DRG. Erfassen Sie Zeitraffer-Z-Stacks der intakten lumbalen vier oder sechs DRG mit 25 Mikrometern pro Schritt und einer Auflösung von 512 x 512 oder 1.024 x 1.024 Pixeln.
Führen Sie eine XYZT-Untersuchung des DRG mit vier bis acht Stapeln durch, die ein bis drei Ausgangszustände, zwei bis drei Akupunktur- oder viszerale kolorektale Dehnungsreize und ein bis zwei Nachstimulierungszustände umfasst. Wenden Sie dann Bürsten- oder Kneifreize auf den unteren Rücken, die Hintergliedmaßen oder die Hinterpfote des Tieres an, um das empfindlichste rezeptive Feld der abgebildeten DRG-Neuronen zu bewerten. Verabreichen Sie Akupunkturreize manuell oder mit einem handelsüblichen Akupunktur- und Nervenstimulator.
Nutzen Sie die kolorektale Dehnung mit einem selbstgebauten Luftdruckmesser, um viszerale Reize zu induzieren. Messen Sie mit einem konfokalen Mikroskop die Zunahme der grünen Fluoreszenz des neuronalen GCaMP bei Bindung an intrazelluläres Kalzium nach somatischen oder viszeralen Reizen. Hellen Sie das Video mit der Farboption mithilfe der Imaging-Software auf.
Manuelle Abgrenzung sichtbarer Zellen und Bestimmung der Zellgröße und der relativen Fluoreszenzintensität. Drückt die Fluoreszenzintensität als Verhältnis des Anstiegs der maximal evozierten Fluoreszenz zum Basalniveau aus. Den lumbalen sechs DRG-Neuronen fehlt im Allgemeinen eine GFP-Fluoreszenz zu Studienbeginn, die möglicherweise durch GCaMP-Expressionsniveaus und chirurgische Schäden beeinflusst wird.
Kolorektale Distensionsstimuli induzierten einen schnellen, vorübergehenden Anstieg der GCaMP-Fluoreszenz. Ähnliche Reaktionen wurden bei der Anwendung der BL25-Elektroakupunktur beobachtet. Heatmaps und Liniendiagramme zeigten die Reaktionen aller eingekreisten Neuronen auf kolorektale Dehnung und BL25-Elektroakupunktur.
Das Histogramm zeigt die Durchmesser der Neuronen, die auf kolorektale Dehnung und BL25-Elektroakupunktur reagieren.
