We thank Wendy Zhang, Austin Tom, Jacquie Janney, Erin Lemley, and Brittany Janney for assistance with plant growth and extractions, Dr. Anatoli Lygin for assistance with chromatographic analyses, and Syngenta Crop Protection for funding.

1. Bitki Malzeme Büyüme Koşullar ve Bitkisel Klonlama Not: Üç waterhemp nüfusları bu araştırmada incelenmiştir: MCR (Adams County, IL itibaren), ACR ve WCS (McLean County, IL itibaren) (Tablo 1) (Wayne County, IL itibaren). <ol><li> Toplamak ve 0.1 g L-1 agar içinde waterhemp tohumları askıya: çimlenmeyi artırmak için en az 30 gün süre ile 4 ° C &#39;de su çözeltisi. Not: Bazı waterhemp popülasyonları uykuda, ama bu adım dinlenmesi aşmak ve tohum daha muntazam çimlenme yapmak için yardımcı olur. </li><li> Bir serada saksı ortamı içeren 12 x 12 cm tepsilere (Tablo 1 &#39;de olduğu gibi), her waterhemp nüfusun tohum çimlenme. <ol><li> Bir 16/8 saat fotoperyod 12 içinde 28/22 ° C gündüz / gece sıcaklıklarında sera koşulları koruyun. </li><li> 500 umol m minimum sağlamak için cıva halide lambaları ışık serada doğal ışık Supplement -2 </sup&gt; Bitki gölgelik düzeyinde sn -1 foton akı. </li></ol></li><li> Onlar 80 cm serada 3 tencere içine 2 cm boyunda olduğunda Nakli fidan ortaya çıktı. </li><li> 1: 1: saksı karışımı 1 karışımı: Toprak: turba: kum fidanları 4 cm boyunda 950 cm 3 içeren 3 kap içine Nakli fidanları. Her tencereye yavaş salınımlı gübre granüllerinin 5 g ekleyin ve bu toprak karışımı ile karıştırın. </li><li> Apikal hakimiyetini ortadan kaldırmak için kesin ve 7 cm boyunda bitkilerden üç genç yaprakları içeren sürgün apikal meristemi kaldırın. Not: Bu adım her bitki klonlamak için yeterli 3 cm aksiller sürgünler büyüyecek olmasını sağlar. </li><li> Fideleri (Tablo 1 &#39;de olduğu gibi), her waterhemp popülasyonundan boyunda yaklaşık 14 cm olan tüketim beş aksiller filizleri (uzunluğu 3 cm). Daha fazla kullanım sırasında su kaybını azaltmak için bu aksiller sürgünlerde yaprak çoğunluğu çıkarın, ancak nakli üzerine daha fazla büyümesini sağlamak için iki genç yaprakları korumak. <br/&gt; Not: dikkatle tutun ve yaprakları sökerken sürgünler zarar vermemeye çalışın. Bir hissesini her bitkiyi etiketleyin. </li><li> Nakli Aksiller çimlenme için kullanılan aynı orta saksı ortamı içine 80 cm 3 tencere (saksı başına bir fide) içine vuruyor. Dolgu ortamı başlangıçta, doymuş bir büyüme odasında kökleri oluşana kadar, daha sonra kökleri oluşturmak için 7 gün boyunca bir büyüme odasında sabit bir nem ve yeri kaplar muhafaza edilmelidir. Not: Bitkiler bu noktada çok hassastır ve stresli olmamalıdır. <ol><li> Bir 16/8 saat fotoperyod 12 içinde 28/22 ° C gündüz / gece sıcaklıklarında büyüme odası koşulları koruyun. </li><li> Akkor ve floresan ampuller bir arada büyüme odasında ışık sağlamak için kullanılabilir ve en az 550 ľmol m -2 bitki gölgelik düzeyinde 12 at sn -1 foton akı teslim etmelidir. </li></ol></li><li> 950 cm 3 tencere içine tekrar Nakli (saksı başına bir fide) c1: 1: saksı karışımı 1 karışımı: Toprak: turba: 3 içeren gruptur klonlanmış bitkiler 4 cm boyunda olduğunda kum sonra tekrar seraya transfer (ayrıca 5 gr yavaş salınımlı gübre granülleri dahil). </li><li> Yukarıda açıklanan aynı yöntemi kullanarak bitkilere ikinci kez Clone (yani tekrar adımlar daha sonra 1.8 1.5 ve 2.1 den adıma geçin). Tipik bir zaman ders çalışması için, her waterhemp nüfus en az altı bağımsız bitkilerden klonlar oluşturmak ve çizgiler MCR 1-6, 1-6 ve ACR WCS 1-6 olarak kaydeder. <ol><li> Deneyi tekrar ve yeterli her waterhemp nüfus içindeki genetik değişkenliği temsil etmek için en az altı farklı &quot;üst&quot; klonal hatları oluşturulması. </li><li> Analiz edilecektir kaç zaman noktalarında bağlı olarak, zaman ders çalışma yürütmek için her bir &quot;ebeveyn&quot; klonal satırından yeterli alt klonları oluşturmak. </li></ol></li></ol> 2. eksize Waterhem ile Metabolizma Çalışması yürütmekp Yapraklar <ol><li> Klonlanmış waterhemp bitkiler herbisit metabolizması ve DT 50 analiz için uzun boylu 10 ila 12 cm ne üçüncü en genç yaprakları (ekli petiole 0.5 cm dahil uzunluğu 2 ila 3 cm) tüketim. </li><li> Her waterhemp bitkiden Kesme yaprak sapı ikinci kez su altında (yaprak sapı 0,3 cm kalmasını sağlayarak) ve Bu kesme 1,5 ml&#39;lik plastik tüplere (şişe başına bir yaprak) 15 içine sona yerleştirin. Not: su altında bir kez kesme biçimlendirilmiş ve odunsu doku damarları takmayı hava kabarcıkları önler. <ol><li> İlk olarak, kısmi olarak 1 saat süre ile 0.1 M Tris-HCl (pH 6) ile ön inkübasyon tampon maddesi (200 ul) kesme Petiol ile birlikte eksize yaprakları bırakın. </li><li> İkinci olarak, yeni bir 1.5 ml&#39;lik bir şişe, 0.1 M Tris-HCl (pH 6) artı 150 uM [URL- 14C] herbisitin (200 ul), bir inkübasyon tampon içeren, her bir yaprak getirin ve 1 saat boyunca 28 ° C&#39;de inkübe edin yaprak bitkilerine herbisit emme için izin verir. Not: Her iki 14 C-mezotrion ve <syukarı&gt; 14 C-primisulfuron-metil yaklaşık 20 mCi mmol belirli etkinlikler bizim çalışmalarda kullanılan -1. Ksilem transpirasyon akışı ile her ikisi de difüzyon ve alımı yaprak başına alınan herbisit miktarı katkıda bulunur. Not: herbisit metabolizması metabolik inhibitörlerinin etkisi, adım 2.2.1 yukarıda 2.2.2 değiştirerek belirlenebilir. Ön kuluçka tamponu inhibitörün 100 uM ekleyin ve sonra herbisit ile kuluçkalama tamponuna aktarma ve yeniden 100 uM inhibitörü ekleyin, 2 saat süre ile inkübe edin. Örneğin, malation ve tetcyclacis bitkiler 15-17 belirli sitokrom P450 aktivitelerini inhibe eder. </li><li> Deiyonize su ile eksize yaprakları dalmış kısmını yıkayın ve çeyrek gücü Murashige ve Skoog (MS) tuzları solüsyonu (500 ul), sırasıyla 0 saat, 5 saat, 11 saat, 23 saat veya 35 saat için eksize yaprakları transfer zaman akışı metabolizması çalışma için bir büyütme odasında. </li></ol></li><li> Izin kaldırarak HasatEl ile inkübasyon, uygun bir zaman noktasında çözeltisi ve S, bir polipropilen tüp (15 mi) ve cam havan tokmağı kullanarak sıvı azot içinde, her bir yaprak dokusu öğütün. </li><li> Radyo-etiketli herbisit ve yukarıdaki gibi aynı polipropilen tüp içinde laboratuar doku homojenizörü ile% 90 aseton 7 ml her yaprağın onun metabolitleri ekstrakte edin. % 90 aseton ek 7 ml doku homojenleştirici durulayın ve doku iyice (genellikle yaklaşık 2 dakika) toz haline gelene kadar homojenize devam eder. Not:% 90 aseton bitki dokularında en herbisitlerin ekstraksiyonu için de kullanılabilir. Bu yöntem emilen radyo-etiketli bileşikler% 90&#39;dan daha fazla elde etmek için mümkün olan, ancak, daha sonra% 90 metanol veya% 90 asetonitril özütleme çözücüsü gibi ikame edilebilir. </li><li> Ek çıkarma oluşması için Etiket% 90 aseton ekstreleri (14 ml toplam) ve mağaza da -4 16 saat C izin °. Not: işlenmiş yaprakların bu çekimi sonrasında, özütlenebilir rad miktarıioactivity işlenmiş yaprak tarafından emilen radyo-etiketli bileşiklerden en az% 98, tipik olarak. Eksize yapraklarda olmayan ekstrakte radyoaktivite (bağlanmış artıklar) daha önceki çalışmada 12 tüm zaman noktaları arasında sadece% 0.3 ortalama, fakat bu miktar incelenmiştir kullanılan herbisitin ve zaman noktasına göre değişebilir. </li><li> 0.5 ml&#39;lik bir nihai hacme kadar santrifüj 10 dakika boyunca 5000 x g&#39;de örnekler ve bir döner buharlaştırıcı ile 40 ° C &#39;de konsantre süpernatanlar elde edilir. 2.0 ml bir plastik tüpe Bu hacim aktarın. </li><li> Tesisinin son hacmi 1.25 ml özler ayarlayın ve yeniden santrifüj 10,000 x g&#39;de 10 dakika boyunca herhangi bir partikülleri ortadan kaldırmak için: (1 hacim itibarı ile, 1) su: asetonitril ekleyin. </li><li> (Dpm ul -1), sıvı sintilasyon spektroskopisi (LSS) 12 ile her bir örnek alınan bir alikot toplam radyoaktivite ölçülür ve miktarlarını normalize (örneğin HPLC analizi için enjekte bileşikler, 10,00 [14C-etiketli]Sonuçları grafik zaman 0 toplam dpm / numune / run) yani y-eksenleri örnekleri arasında muntazam olacaktır. </li></ol> Kesilen Leaves Herbisit Metabolizma 3. HPLC Analizi Not: Aşağıdaki RP-HPLC koşulları 12 ile ana herbisit ve herbisit metabolitleri içine toplam ekstrakte radyoaktivite giderin. <ol><li> 1 ml dk bir akış oranında bir C18 kolonu (4.6 x 250 mm, analitik HPLC için 5 um parçacık boyutu) olan, RP-HPLC gerçekleştirme -1 en polar olmayan herbisit. Not: C 4 ya da Cı 12 RP-HPLC sütunları da onun metabolitleri ile ilgili ana yabani ot öldürücü ayrılmasını optimize etmek için kullanılabilir. Ön sütun filtresi ve / ya da koruyucu sütunu korunması ve RP kolonuna ömrünü uzatmak için kullanılabilmektedir. <ol><li> Eluent A, su içinde% 0.1 formik asit (hac / hac) ve Taşıyıcı B% 100 HPLC-grade asetonitril: RP-HPLC için aşağıdaki mobil faz kullanın. Not: HPLC-dereceli metanol El olarak kullanılabiliruent daha polar bileşikleri ve metabolitleri çözülmesi için B, ama tutma süreleri de değişebilir unutmayın. Not: araştırmamızda 12 kendi polar metabolitlerden mezotrion ya primisulfuron-metil çözmek için kullanılan elüsyon profili: Adım 1, A: B (4: 1, hac / hac): B (3: 2, hac / hac ) doğrusal gradyanı (12 dakika); B: A: (2, hac / hac 3): Aşama 2, bir B (3: 7, v / v) bir doğrusal gradyan (5 dakika); Aşama 3, A: B: A: (7, hac / hac 3) B: 2 dakika boyunca lineer gradyanı (9: 1, v / v) (19 dakika toplam içeren) karıştırılır. Not: Degradeler ve İzokratik adımlar çözünürlüğünü optimize etmek için ana malzemenin fiziksel özelliklerine göre ayarlanması gerekebilir. </li><li> B (4: 1, v / v) bir doğrusal gradyan (3 dakika) ve a: A: (9, h / h 1) B: A, yukarıda doğrusal gradyan adımları B (4: 1, v / h) en az 2 dakika izokratik aşama () aşağıdaki özü 12 enjekte etmeden önce RP sütunu yeniden dengelemek için. </li></ol></li><li> Algılama ve Akış sintigrafisinde ile radyoaktif işaretli bileşikler görselleştirmekllation Analyzer. Her bir numunedeki toplam radyoaktivite yüzdesi olarak, her bir numune içinde Kalan üst herbisit miktarını kaydedin (algılanabilir ve üreticinin talimatlarına uygun olarak akış Sintilasyon Analiz cihazı ile ölçülmüştür) bir zaman boyunca, her waterhemp popülasyonda herbisit metabolizmasının oranlarını belirlemek için. </li></ol> 4. Statistik prosedürler <ol><li> Bir tesadüf tasarım (ya da istatistiksel analizler için başka uygun bir düzenleme) tedavileri düzenleyin. </li><li> Her bir deney için üç biyolojik çoğaltır oluşan her tedavi, iki bağımsız deneyler yapın. İki bağımsız deney toplam altı biyolojik çoğaltır içerir. Deney etkisi (α = 0.05) anlamlı olmayan ise, her bir bağımsız deneyde verileri birleştirmek ve analiz. Deney etkisi önemli ise, o zaman ayrı ayrı deney analiz. Not: İlk üç biyolojik çoğaltır dahil in 1 Deney ve Deney 2&#39;de önümüzdeki üç biyolojik çoğaltır Her biyolojik çoğaltmak (MCR 1-6, ACR 1-6 ve 1-6 WCS) Her nüfus türetilen klonal çizgi böylece ayrı bir &quot;üst&quot; temsil her zaman- Tabii analizi genetik özdeş bitkiler kullanır. Iki bağımsız deney her waterhemp nüfus için bir medyan DT 50 genetik değişkenliği ve kararlılık, yeterli temsili sağlayan toplam altı biyolojik çoğaltır içerir. </li><li> Doğrusal olmayan en küçük kareler regresyon analizi ile verileri analiz ve DT 50 s tahmin etmek için basit bir birinci dereceden eğri ile uyum. Aşağıdaki denklem modeli anlatılmaktadır: <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/53236/53236eq1.jpg" /></li><li> nerede bu model y t zamanında kalan ebeveyn herbisit yüzdesini temsil, μ i her DT 50waterhemp nüfusu i ve parametre C 0 t = 0 12 de ana herbisit mevcut tahmini tutardır. </li></ol>

<ol>
	<li>Yu, Q., Powles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism-based+herbicide+resistance+and+cross-resistance+in+crop+weeds:+A+threat+to+herbicide+sustainability+and+global+crop+production.">Metabolism-based herbicide resistance and cross-resistance in crop weeds: A threat to herbicide sustainability and global crop production.</a> Plant Physiology. 166, 1106-1118 (2014).</li><li>Powles, S. B., Yu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+in+action:+plants+resistant+to+herbicides.">Evolution in action: plants resistant to herbicides.</a> Annual Reviews in Plant Biology. 61, 317-347 (2010).</li><li>Heap, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+perspective+of+herbicide-resistant+weeds.">Global perspective of herbicide-resistant weeds.</a> Pest Management Science. 70 (9), 1306-1315 (2014).</li><li>D&#233;lye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-target-site-based+resistance+should+be+the+centre+of+attention+for+herbicide+resistance+research:+Alopecurus+myosuroides+as+an+illustration.">Non-target-site-based resistance should be the centre of attention for herbicide resistance research: Alopecurus myosuroides as an illustration.</a> Weed Research. 51 (5), 433-437 (2011).</li><li>Kreuz, K., Tommasini, R., Martinoia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Old+enzymes+for+a+new+job.+Herbicide+detoxification+in+plants.">Old enzymes for a new job. Herbicide detoxification in plants.</a> Plant Physiology. 111, 349-353 (1996).</li><li>Riechers, D. E., Kreuz, K., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detoxification+without+intoxication:+herbicide+safeners+activate+plant+defense+gene+expression.">Detoxification without intoxication: herbicide safeners activate plant defense gene expression.</a> Plant Physiology. 153, 3-13 (2010).</li><li>Siminszky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cytochrome+P450-mediated+herbicide+metabolism.">Plant cytochrome P450-mediated herbicide metabolism.</a> Phytochemistry Reviews. 5 (2-3), 445-458 (2006).</li><li>Fonn&#233;-Pfister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxylation+of+primisulfuron+by+an+inducible+cytochrome+P450-dependent+monooxygenase+system+from+maize.">Hydroxylation of primisulfuron by an inducible cytochrome P450-dependent monooxygenase system from maize.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 37 (2), 165-173 (1990).</li><li>Steckel, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dioecious+Amaranthus+spp.:+here+to+stay.">The dioecious Amaranthus spp.: here to stay.</a> Weed Technology. 21 (2), 567-570 (2007).</li><li>Horak, M. J., Loughin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+analysis+of+four+Amaranthus+species.">Growth analysis of four Amaranthus species.</a> Weed Science. 48 (3), 347-355 (2000).</li><li>Hausman, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+HPPD-inhibiting+herbicides+in+a+population+of+waterhemp+(Amaranthus+tuberculatus)+from+Illinois,+United+States.">Resistance to HPPD-inhibiting herbicides in a population of waterhemp (Amaranthus tuberculatus) from Illinois, United States.</a> Pest Management Science. 67 (3), 258-261 (2011).</li><li>Ma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+detoxi&#64257;cation+mechanisms+confer+resistance+to+mesotrione+and+atrazine+in+a+population+of+waterhemp.">Distinct detoxi&#64257;cation mechanisms confer resistance to mesotrione and atrazine in a population of waterhemp.</a> Plant Physiology. 163, 363-377 (2013).</li><li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-target-site+resistance+to+ALS+inhibitors+in+waterhemp+(Amaranthus+tuberculatus).">Non-target-site resistance to ALS inhibitors in waterhemp (Amaranthus tuberculatus).</a> Weed Science. in press, (2015).</li><li>Patzoldt, W. L., Tranel, P. J., Hager, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+waterhemp+(Amaranthus+tuberculatus)+biotype+with+multiple+resistance+across+three+herbicide+sites+of+action.">A waterhemp (Amaranthus tuberculatus) biotype with multiple resistance across three herbicide sites of action.</a> Weed Science. 53 (1), 30-36 (2005).</li><li>Kreuz, K., Fonn&#233;-Pfister, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbicide-insecticide+interaction+in+maize:+malathion+inhibits+cytochrome+P450-dependent+primisulfuron+metabolism.">Herbicide-insecticide interaction in maize: malathion inhibits cytochrome P450-dependent primisulfuron metabolism.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 43 (3), 232-240 (1992).</li><li>Correia, M. A., Ortiz de Montellano, P. R., Ortiz de Montellano, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cytochrome P450: Structure, Mechanism, and Biochemistry. , 247-322 (2005).</li><li>Hawkes, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesotrione:+mechanism+of+herbicidal+activity+and+selectivity+in+corn.">Mesotrione: mechanism of herbicidal activity and selectivity in corn.</a> Proceedings of the Brighton Crop Protection Conference &#8211; Weeds. 2, 563-568 (2001).</li><li>Patzoldt, W. L., Tranel, P. J., Hager, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+herbicide+responses+among+Illinois+waterhemp+(Amaranthus+rudis+and+A.+tuberculatus)+populations.">Variable herbicide responses among Illinois waterhemp (Amaranthus rudis and A. tuberculatus) populations.</a> Crop Protection. 21 (9), 707-712 (2002).</li><li>Jalaludin, A., Yu, Q., Powles, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+resistance+across+glufosinate,+glyphosate,+paraquat+and+ACCase-inhibiting+herbicides+in+an+Eleusine+indica+population.">Multiple resistance across glufosinate, glyphosate, paraquat and ACCase-inhibiting herbicides in an Eleusine indica population.</a> Weed Research. 55 (1), 82-89 (2015).</li><li>Iwakami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+P450+CYP81A12+and+CYP81A21+are+associated+with+resistance+to+two+acetolactate+synthase+inhibitors+in+Echinochloa+phyllopogon.">Cytochrome P450 CYP81A12 and CYP81A21 are associated with resistance to two acetolactate synthase inhibitors in Echinochloa phyllopogon.</a> Plant Physiology. 165, 618-629 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada tarif edilen kesilmiş yaprak yöntemi, mısır yaprak 15 içinde primisülfüron metabolizma araştırma, daha önce kullanılmış olan, ancak sonuçlar, bu protokol, aynı zamanda, bir dikot zararlı bitki türleri 12 herbisid metabolizmasını ölçmek için, etkili, uygun ve tekrarlanabilir olduğunu göstermektedir. Bütün bitki çalışmalarla karşılaştırıldığında kesilmiş yaprak tekniğin önemli bir avantajı, bir kesilmiş yaprak bütün bitki translokasyon toprak yüzeyi...

Otların herbisit direnci gıda ve lif 1,2 küresel üretim ciddi bir tehdit sunuyor. Şu anda yüzden fazla ot türünden dayanıklı nüfus ve biyotipten dünya çapında binlerce belgelenmiş ve 3 çalışılmıştır. Bitkilerde herbisit dayanıklılığı veren önemli bir mekanizma, herbisite protein bağlama kinetikleri veya hedef site gen 2 amplifikasyonu etkileyen genetik mutasyonlar da dahil olmak üzere herbisit hedef sitesi genler ve proteinler, değişikliktir. Sitokrom P450 monooksigenazı (P450) ya da glutation S -Transferase (GST) enzimlerin yüksek aktiviteleri ile metabolik detoksifikasyon hedef alan bazlı mekanizmalar 2 çeşitli şekillerde farklı olan bir yabani ot herbisid direnci kazandıran bir mekanizmadır. Metabolik tabanlı direnç (spor cezaları aka) bitki spor maliyetleri herbisit dayanıklılığı mekaniği kaynaklanabilecek olup önemli etkileri vardırm, hem de yabani popülasyonları 1,2,4 bölgesindeki çapraz veya birden fazla herbisit direnci vermek için, tek bir detoksifikasyon mekanizması potansiyeli açısından. Genel olarak, bitkilere herbisid metabolizması üç ayrı 5 ayrılabilir. Artan polarite ve kısmi herbisit detoksifikasyon 5,6 giden ya da O-dealkilasyon reaksiyonları - Faz I Bu aromatik halkaların ya da alkil gruplarının P450 aracılı hidroksilasyon, ya da N ile olduğu gibi, herbisit veya değiştiren aktivasyonunu içermektedir. Yeni ben GST&#39;lerin azaltılmış glutatyon konjugasyon için bağlantı siteleri sağlayabilir veya Faz II 5,7 UDP-bağımlı glikosiltransferazların tarafından glikoza Faz fonksiyonel gruplar tanıttı. Örneğin, mısırda primisulfuron-metil baştaki metaboliti hidroksi-primisulfuron-glukosite (Phase II) ve daha sonra metabolize uzun süreli depolama ya da daha fazla metabolik için vaküole nakledilebilir hidroksi-primisulfuron-metil 8, olduğu profesyonelcessing 5,6 (Phase III). Waterhemp (Amaranthus tuberculatus) Birleşik Devletler mısır üretimini (Zea mays), soya fasulyesi (Glycine max) ve pamuk (Gossypium hirsutum) engelleyen bir zor kontrol, dikot yıllık yabancı ot türüdür. Waterhemp genetik çeşitliliğin yüksek derecede onun ikievcikli biyolojisi ve uzun mesafe rüzgar tozlaşma ile kolaylaştırılır ve bir tek kadın waterhemp bitki milyon tohumlar 9 kadar üretebilir. Bu tohumlar doğal olarak etkili bir dağılma mekanizmasına sahip waterhemp bağışlamak, hangi küçük ve kolayca yayılırlar. Waterhemp büyüyen sezon 9 boyunca sürekli çimlenme görüntüler ve tohumları uyuşukluk birkaç yıl sonra filizlenmeye edebiliyoruz. Waterhemp ekilebilir kırpma sistemlerinde 10 en geniş yapraklı yabancı otların daha yüksek büyüme oranını sahip bir C 4 bitkidir. Ayrıca, çok sayıda waterhemp popülasyonları birden fam dayanıklıdırherbisit 3 ilies. Illinois waterhemp (MCR adlandırılır) popülasyonu 4-hidroksi-fenilpiruvat dioksigenaz (HPPD) bu tür mezotrion olarak inhibe edici herbisitler 11, hem de atrazin ve asetolaktat sintazı (ALS) için, herbisit inhibe edici primisulfuron-metil içeren dayanıklı , hedef dışı site bazlı mekanizmalar 12,13 nedeniyle. Ve atrazin dirençli ancak mezotrion duyarlı ve primisülfüron-metil duyarlıdır DTH 14 olarak adlandırılan bir waterhemp popülasyon (nedeniyle ALS geninin mutasyona) primisülfüron-metil-dirençli ACR 14 belirlenen waterhemp farklı bir popülasyon, mezotrion ve atrazin, bizim daha önceki araştırmalar 12 ve mevcut deneylerde MCR ile karşılaştırıldığında kullanıldı (Tablo 1 &#39;de özetlenmiştir). İlk çalışmalar MCR içinde, HPPD gen dizisi veya ifade düzeylerinde değişikliklere, veya azaltılmış mezotrion alımını tespit etmediNüfus zaman mezotrion duyarlı nüfus 12 ile karşılaştırıldığında. Ancak, bütün bitkilerle metabolizma çalışmaları 11,12 mezotrion önceki fenotipik yanıtları ile ilişkili ACR ve WCS ile karşılaştırıldığında MCR ebeveyn mezotrion herbisit anlamlı derecede düşük düzeylerde gösterdi. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Waterhemp Nüfus </td><td> Kısaltma </td><td> Mezotrion için Fenotip </td><td> Mezotrion Direnç Mekanizması </td><td> Primisülfüron için Fenotip </td><td> Primisülfüron Direnç Mekanizması </td></tr><tr><td> McLean İlçe Dayanıklı </td><td> MCR </td><td> Dayanıklı </td><td> Metabolizma * </td><td> Dayanıklı </td><td> Metabolizma </td></tr><tr><td> Adams County Dayanıklı </td><td> ACR </td><td> Sensitive </td><td> - </td><td> Dayanıklı </td><td> ALS 14 Hedef site mutasyonu </td></tr><tr><td> Wayne County Duyarlı </td><td> WCS </td><td> Duyarlı </td><td> - </td><td> Duyarlı </td><td> - </td></tr></tbody></table> * Geliştirilmiş metabolizma dışında hedef olmayan site direnç mekanizmaları, aynı zamanda MCR nüfus 12 mezotrion direnci kazandırabilmektedir. Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan Illinois&#39;den waterhemp popülasyonlarının tanımlanması. Sağlam waterhemp fide herbisid metabolizması hızlarının belirlenmesine ek olarak, farklı deneysel yaklaşım geliştirilmiştir ve kesilmiş waterhemp yaprak tahlil 12 yanı sıra çeşitli P450 inhibitörlerinin (ör tetcyclacis malathion) kullanarak, metabolizmayı incelemek için önceki çalışmada kullanılan. Bu yöntem, bir önceki yaklaşımlardan waterhemp için özel olarak uyarlanmıştıreksize yaprak tahlili henüz bir dikot bitkide herbisit metabolizması araştırma için rapor edilmemiştir beri eksize mısırda primisulfuron-metil metabolizması lı soruşturma, 15 bırakır. Organophophosate insektisit malation sıklıkla in vivo kullanılmıştır ve in vitro herbisite metabolizması araştırma P450 tutulumu 16 gösterir. Örneğin, tolerans ve mısırdaki mezotrion ve hızlı metabolizma malation mezotrion 17 mısır duyarlılığı arttıkça doğrulanmıştır P450 katalizlenen halka hidroksilasyon, kaynaklanmaktadır. Benzer şekilde, malation kesilmiş mısır ALS inhibitörü primisulfuron-metil 15 yaprak metabolizmasını inhibe etti. Bitkilerde sistemik olarak, topraktan çıkma herbisidlerin metabolizmasını değerlendirirken eksize yaprak tekniğin önemli bir avantajı, üretilen veriler bütün bitki translokasyon desen bağımsız olmasıdır, önemli bir faktör dikkate. Sonuç olarak, bu yöntem, niceliksel izin verir veNitel metabolik tedavi edilen tek bir yaprak 12 odaklanmak analizleri. Bir bitkisel klonlama stratejisi, eksize yaprak protokolü ile kombinasyon halinde, daha önce metabolizma çalışmaları 12 yapmak için waterhemp da kullanılmıştır. Nedeniyle waterhemp (ayrı erkek ve dişi bitkiler) ve ikievcikli amaranthus türlerinin 9 içindeki genetik çeşitliliğin büyük derecesi outcross doğası gereği, bu protokol genetik özdeş waterhemp fidanları zaman ders deneyler içinde analiz edildi sağlanmalıdır. Bu makalede, bir dikot ot (waterhemp) herbisid metabolizmasının oranlarını ölçmek için kesilmiş yaprak yöntemin kullanımını göstermektedir. Ana yabani ot öldürücü miktarı, (absorbe herbisitin% 50 indirgeme için zaman tahmin etmek için basit bir birinci dereceden eğrisi ile uygun olan doğrusal olmayan en küçük kareler regresyon analizi ile her bir zaman noktasında (Şekil 1) belirlendi ve geri kalan DT 50). Temsilciters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi (RP-HPLC) ile ilgili kromatogramlar karşı ALS ve zaman-akışı çalışma sırasında ana yabani ot öldürücü ve kutupsal metabolit (ler) eşlik eden oluşumuyla kaybolması göstermektedir -duyarlı waterhemp popülasyonları (Şekil için gösterildi 2). Bizim derlemenin konusu düzgün olarak bir halka etiketli (URL- 14 ° C) herbisit kullanarak, tarif ve dikot bitkilerdeki herbisid metabolizmasının yeniden üretilebilir ve kesin hızını belirlemek için bitkisel klonlama yöntemi ile kombinasyon halinde kesilmiş yaprak testinin kullanılmasını göstermek için bunların bütün bitki yanıtlarında farklı üç waterhemp popülasyonları HPPD- ve ALS engelleyici herbisitler (Tablo 1).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296</td>
			<td>for pre-germinating seeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potting medium</td>
			<td>Sun Gro Horticulture</td>
			<td>49040233</td>
			<td>for plant growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutricote</td>
			<td>Agrivert&#160;</td>
			<td>TOTAL BLEND 13-13-13 T100</td>
			<td>slow-release fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber E15</td>
			<td>Controlled Environments Limited</td>
			<td>20207</td>
			<td>plant culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>buffer for excised leaves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (concentrated)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144500</td>
			<td>adjust pH of buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog (MS) salts&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0404</td>
			<td>incubation of excised leaves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>leaf washes after incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td>plant extractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (HPLC grade)</td>
			<td>Macron Fine Chemicals</td>
			<td>MKH07610</td>
			<td>HPLC mobile phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid&#160;</td>
			<td>Mallinckrodt Analytical</td>
			<td>MK259205</td>
			<td>acidify mobile phase pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>1.5 or 2.0 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (temperature controlled)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td>15 or 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene centrifuge tube</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>430790</td>
			<td>15 mL, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>B&#220;CHI</td>
			<td>R200</td>
			<td>concentrate plant samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation spectrometry (LSS)</td>
			<td>Packard Instruments</td>
			<td>104470</td>
			<td>quantify 14C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance liquid chromatography</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N2910401</td>
			<td>resolve herbicide metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow scintillation analyzer&#160;</td>
			<td>LabLogic System</td>
			<td>1103303</td>
			<td>for HPLC analysis of 14C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypersil Gold C18 column&#160;</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>03-050-522&#160;</td>
			<td>reversed phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultima-Flo M cocktail</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6013579</td>
			<td>for Flow-scintillation analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SX18</td>
			<td>for LSS; biodegradable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory homogenizer</td>
			<td>Kinematica</td>
			<td>CH-6010&#160;</td>
			<td>homogenize leaf samples</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring rates of herbicide metabolism in dicot weeds with an excised leaf assay

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we developed an excised leaf assay combined with a vegetative cloning strategy to normalize herbicide uptake and remove translocation as contributing factors in herbicide-resistant (R) and &#8211;sensitive (S) waterhemp populations. Biokinetic analyses of organic pesticides in plants typically include the determination of uptake, translocation (delivery to the target site), metabolic fate, and interactions with the target site. Herbicide metabolism is an important parameter to measure in herbicide-resistant weeds and herbicide-tolerant crops, and is typically accomplished with whole-plant tests using radiolabeled herbicides. However, one difficulty with interpreting biokinetic parameters derived from whole-plant methods is that translocation is often affected by rates of herbicide metabolism, since polar metabolites are usually not mobile within the plant following herbicide detoxification reactions. Advantages of the protocol described in this manuscript include reproducible, accurate, and rapid determination of herbicide degradation rates in R and S populations, a substantial decrease in the amount of radiolabeled herbicide consumed, a large reduction in radiolabeled plant materials requiring further handling and disposal, and the ability to perform radiolabeled herbicide experiments in the lab or growth chamber instead of a greenhouse. As herbicide resistance continues to develop and spread in dicot weed populations worldwide, the excised leaf assay method developed and described herein will provide an invaluable technique for investigating non-target site-based resistance due to enhanced rates of herbicide metabolism and detoxification.

Mezotrion metabolizma oranlarında büyük farklılıklar WCS veya ACR ve MCR (Şekil 1) ya arasında tespit edildi. Her zaman noktasında, MCR daha hızlı bir şekilde daha önceki bütün bitki fenotipik yanıtların 11 ile ilişkilidir, iki mezotrion-hassas grupların, WC&#39;ler ve ACR, daha mezotrion metabolize olan. Her nüfus tek bir ebeveyn bitkiden yeterince bitkiler klonlama yoluyla, herbisit metabolizması zaman ders analizleri nedeniyle her zaman ders 12 içindeki gene...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay at JoVE.com

Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.

Bir kesilmiş yaprak Testi ile Dikot Weeds Herbisit Metabolizma düşük Ölçme

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

measuring-rates-herbicide-metabolism-dicot-weeds-with-an-excised-leaf

Research

JoVE Journal

Environment

11.9K Görüntüleme.  University of Illinois. This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.

Video: Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K+) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.

In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K+) and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.

Radyoaktif izleyiciler ile Bitkilerde Mineral Besin ve Toksikantların Değişimler Ölçme

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

Çevre

Protocols for Robust Herbicide Resistance Testing in Different Weed Species

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented protocols, based on whole-plant bioassays performed in a greenhouse, can be readily adapted to a wide range of weed species and herbicides through appropriate variants. Seed samples from plants that survived a field herbicide treatment are collected and stored dry at low temperature until used. Germination methods differ according to weed species and seed dormancy type. Seedlings at similar growth stage are transplanted and maintained in the greenhouse under appropriate conditions until plants have reached the right growth stage for herbicide treatment. Accuracy is required to prepare the herbicide solution to avoid unverifiable mistakes. Other critical steps such as the application volume and spray speed are also evaluated. The advantages of this protocol, compared to others based on whole plant bioassays using one herbicide dose, are related to the higher reliability and the possibility of inferring the resistance level. Quicker and less expensive in vivo or in vitro diagnostic screening tests have been proposed (Petri dish bioassays, spectrophotometric tests), but they provide only qualitative information and their widespread use is hindered by the laborious set-up that some species may require. For routine resistance testing, the proposed whole plant bioassay can be applied at only one herbicide dose, so reducing the costs.

A robust and flexible approach to confirm herbicide resistance in weed populations is presented. This protocol allows the herbicide resistance levels to be inferred and applied to a wide range of weed species and herbicides with minor adaptations.

Farklı Ot Türlerinin Sağlam Herbisit Direnci Testi için Protokoller

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented ...

LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic pathways requires a model in which external factors can be well controlled, allowing for reproducible and meaningful results. Many studies employ transformed cellular models for these purposes; however, metabolic reprogramming that occurs in many cancer cell lines may introduce confounding variables. For this reason primary cells are desirable, though attaining adequate biomass for metabolic studies can be challenging. Here we show that human platelets can be utilized as a platform to carry out metabolic studies in combination with liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis. This approach is amenable to relative quantification and isotopic labeling to probe the activity of specific metabolic pathways. Availability of platelets from individual donors or from blood banks makes this model system applicable to clinical studies and feasible to scale up. Here we utilize isolated platelets to confirm previously identified compensatory metabolic shifts in response to the complex I inhibitor rotenone. More specifically, a decrease in glycolysis is accompanied by an increase in fatty acid oxidation to maintain acetyl-CoA levels. Our results show that platelets can be used as an easily accessible and medically relevant model to probe the effects of xenobiotics on cellular metabolism.

Here we show isolated human platelets can be used as an accessible ex vivo model to study metabolic adaptations in response to the complex I inhibitor rotenone. This approach employs isotopic tracing and relative quantification by liquid chromatography-mass spectrometry and can be applied to a variety of study designs.

Mitokondriyal Metabolizma incelenmesi için Platform olarak İnsan Trombositler LC-MS Analizi

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic ...

Laboratory and Field Protocol for Estimating Sheet Erosion Rates from Dendrogeomorphology

Sheet erosion is among the crucial drivers of soil degradation. Erosion is controlled by environmental factors and human activities, which often lead to severe environmental impacts. The understanding of sheet erosion is, consequently, a worldwide issue with implications for both environment and economies. However, the knowledge on how erosion evolves in space and time is still limited, as well as its effects on the environment. Below, we explain a new dendrogeomorphological protocol for deriving eroded soil thickness (Ex) by acquiring accurate microtopographic data using both terrestrial laser scanning (TLS) and microtopographic profile gauges. Additionally, standard dendrogeomorphic procedures, dependent on anatomical variations in root rings, are utilized to establish the timing of exposure. Both TLS and microtopographic profile gauges are used to obtain ground surface pro&#64257;les, from which Ex is estimated after the threshold distance (TD) is determined, i.e., the distance between the root and the sediment knickpoint, which allows de&#64257;ning the lowering of the ground surface caused by sheet erosion. For each profile, we measured the height between the topside of the root and a virtual plane tangential to the ground surface. In this way, we intended to avoid small-scale impacts of soil deformation, which may be due to pressures exerted by the root system, or by the arrangement of exposed roots. This may provoke small amounts of soil sedimentation or erosion depending on how they physically affect the surface runoff. We demonstrate that an adequate microtopographic characterization of exposed roots and their associated ground surface is very valuable to obtain accurate erosion rates. This finding could be utilized to develop the best management practices designed to eventually halt or perhaps, at least, lessen soil erosion, so that more sustainable management policies can be put into practice.

Characterizing erosion from dendrogeomorphology has usually focused on accurately finding the starting time of root exposure, by examining macroscopic or cell level changes caused by exposure. Here, we offer a detailed description of different novel techniques to obtain more precise erosion rates from highly accurate microtopographic data.

Laboratuvar ve levha erozyon oranları üzerinden Dendrogeomorphology tahmin etmek için alan Protokolü

Sheet erosion is among the crucial drivers of soil degradation. Erosion is controlled by environmental factors and human activities, which often lead to ...

An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium

Mercury (Hg) bioavailability to microbes is a key step to toxic Hg biomagnification in food webs. Cadmium (Cd) transformations and bioavailability to bacteria control the amount that will accumulate in staple food crops. The bioavailability of these metals is dependent on their speciation in solution, but more particularly under anoxic conditions where Hg is methylated to toxic monomethylmercury (MeHg) and Cd persists in the rhizosphere. Whole-cell microbial biosensors give a quantifiable signal when a metal enters the cytosol and therefore are useful tools to assess metal bioavailability. Unfortunately, most biosensing efforts have so far been constrained to oxic environments due to the limited ability of existing reporter proteins to function in the absence of oxygen. In this study, we present our effort to develop and optimize a whole-cell biosensor assay capable of functioning anaerobically that can detect metals under anoxic condition in quasi-real time and within hours. We describe how the biosensor can help assess how chemical variables relevant to the environmental cycling of metals affect their bioavailability. The following protocol includes methods to (1) prepare Hg and Cd standards under anoxic conditions, (2) prepare the biosensor in the absence of oxygen, (3) design and execute an experiment to determine how a series of variable affects Hg or Cd bioavailability, and (4) to quantify and interpret biosensor data. We show the linear ranges of the biosensors and provide examples showing the method's ability to distinguish between metal bioavailability and toxicity by utilizing both metal-inducible and constitutive strains.

Here, we present a protocol to use an anaerobic whole-cell microbial biosensor to evaluate how different environmental variables affect the bioavailability of Hg and Cd to bacteria in anoxic environments.

Bir anaerobik biyoalgılayıcı tahlil civa ve kadmiyum tespiti için

Mercury (Hg) bioavailability to microbes is a key step to toxic Hg biomagnification in food webs. Cadmium (Cd) transformations and bioavailability to ...

Estimating Sediment Denitrification Rates Using Cores and N2O Microsensors

Denitrification is the primary biogeochemical process removing reactive nitrogen from the biosphere. The quantitative evaluation of this process has become particularly relevant for assessing the anthropogenic-altered global nitrogen cycle and the emission of greenhouse gases (i.e., N2O). Several methods are available for measuring denitrification, but none of them are completely satisfactory. Problems with existing methods include their insufficient sensitivity, and the need to modify the substrate levels or alter the physical configuration of the process using disturbed samples.This work describes a method for estimating sediment denitrification rates that combines coring, acetylene inhibition, and microsensor measurements of the accumulated N2O. The main advantages of this method are a low disturbance of the sediment structure and the collection of a continuous record of N2O accumulation; these enable estimates of reliable denitrification rates with minimum values up to 0.4-1 &#181;mol N2O m-2 h-1. The ability to manipulate key factors is an additional advantage for obtaining experimental insights. The protocol describes procedures for collecting the cores, calibrating the sensors, performing the acetylene inhibition, measuring the N2O accumulation, and calculating the denitrification rate. The method is appropriate for estimating denitrification rates in any aquatic system with retrievable sediment cores. If the N2O concentration is above the detection limit of the sensor, the acetylene inhibition step can be omitted to estimate the N2O emission instead of denitrification. We show how to estimate both actual and potential denitrification rates by increasing nitrate availability as well as the temperature dependence of the process. We illustrate the procedure using mountain lake sediments and discuss the advantages and weaknesses of the technique compared to other methods. This method can be modified for particular purposes; for instance, it can be combined with 15N tracers to assess nitrification and denitrification or field in situ measurements of denitrification rates.

Estimating Sediment Denitrification Rates Using Cores and N2O Microsensors

This method estimates sediment denitrification rates in sediment cores using the acetylene inhibition technique and microsensor measurements of the accumulated N2O. The protocol describes procedures for collecting the cores, calibrating the sensors, performing the acetylene inhibition, measuring the N2O accumulation, and calculating the denitrification rate.

Çekirdek ve N2O Microsensors kullanarak tahmin tortu denitrifikasyon oranları

Denitrification is the primary biogeochemical process removing reactive nitrogen from the biosphere. The quantitative evaluation of this process has ...

Measuring the Shape and Size of Activated Sludge Particles Immobilized in Agar with an Open Source Software Pipeline

Experimental bioreactors, such as those treating wastewater, contain particles whose size and shape are important parameters. For example, the size and shape of activated sludge flocs can indicate the conditions at the microscale, and also directly affect how well the sludge settles in a clarifier.
Particle size and shape are both misleadingly &#39;simple&#39; measurements. Many subtle issues, often unaddressed in informal protocols, can arise when sampling, imaging, and analyzing particles. Sampling methods may be biased or not provide enough statistical power. The samples themselves may be poorly preserved or undergo alteration during immobilization. Images may not be of sufficient quality; overlapping particles, depth of field, magnification level, and various noise can all produce poor results. Poorly specified analysis can introduce bias, such as that produced by manual image thresholding and segmentation.
Affordability and throughput are desirable alongside reproducibility. An affordable, high throughput method can enable more frequent particle measurement, producing many images containing thousands of particles. A method that uses inexpensive reagents, a common dissecting microscope, and freely-available open source analysis software allows repeatable, accessible, reproducible, and partially-automated experimental results. Further, the product of such a method can be well-formatted, well-defined, and easily understood by data analysis software, easing both within-lab analyses and data sharing between labs.
We present a protocol that details the steps needed to produce such a product, including: sampling, sample preparation and immobilization in agar, digital image acquisition, digital image analysis, and examples of experiment-specific figure generation from the analysis results. We have also included an open-source data analysis pipeline to support this protocol.

The size and shape of particles in activated sludge are important parameters that are measured using varying methods. Inaccuracies arise from non-representative sampling, suboptimal images, and subjective analysis parameters. To minimize these errors and ease measurement, we present a protocol specifying every step, including an open source software pipeline.

Nesnenin şeklini ve boyutunu Agar bir açık kaynak yazılım boru hattı ile immobilize aktif çamur parçacıkların ölçme

Experimental bioreactors, such as those treating wastewater, contain particles whose size and shape are important parameters. For example, the size and ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the treatment of wastes. As most new research efforts begin at laboratory scale, there is a need for cost-effective methods for culturing microalgae in a reproducible manner. Here, we communicate an effective approach to culture microalgae in laboratory-scale photobioreactors, and to measure the growth and neutral lipid content of that algae. Instructions are also included on how to set up the photobioreactor system. Although the example organisms are species of Chlorella and Auxenochlorella, this system can be adapted to cultivate a wide range of microalgae, including co-cultures of algae with non-algae species. Stock cultures are first grown in bottles to produce inoculum for the photobioreactor system. Algae inoculum is concentrated and transferred to photobioreactors for cultivation in batch mode. Samples are collected daily for the optical density readings. At the end of the batch culture, cells are harvested by centrifuge, washed, and freeze dried to obtain a final dry weight concentration. The final dry weight concentration is used to create a correlation between the optical density and the dry weight concentration. A modified Folch method is subsequently used to extract total lipids from the freeze-dried biomass and the extract is assayed for its neutral lipid content using a microplate assay. This assay has been published previously but protocol steps were included here to highlight critical steps in the procedure where errors frequently occur. The bioreactor system described here fills a niche between simple flask cultivation and fully-controlled commercial bioreactors. Even with only 3-4 biological replicates per treatment, our approach to culturing algae leads to tight standard deviations in the growth and lipid assays.

Here, we present a protocol to construct lab-scale bubble column photobioreactors and use them to culture microalgae. It also provides a method for the determination of the culture growth rate and neutral lipid content.

Kabarcık sütun Photobioreactors ve bir tahlil yeşil mikroalg ekimi için nötr lipitler

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for describing the vegetation structure in the fields of ecology, forestry, and agriculture. Therefore, procedures of three commercially used methods (litter traps, needle technique, and a plant canopy analyzer) for performing LAI estimation were presented step-by-step. Specific methodological approaches were compared, and their current advantages, controversies, challenges, and future perspectives were discussed in this protocol. Litter traps are usually deemed as the reference level. Both the needle technique and the plant canopy analyzer (e.g., LAI-2000) frequently underestimate LAI values in comparison with the reference. The needle technique is easy to use in deciduous stands where the litter completely decomposes each year (e.g., oak and beech stands). However, calibration based on litter traps or direct destructive methods is necessary. The plant canopy analyzer is a commonly used device for performing LAI estimation in ecology, forestry, and agriculture, but is subject to potential error due to foliage clumping and the contribution of woody elements in the field of view (FOV) of the sensor. Eliminating these potential error sources was discussed. The plant canopy analyzer is a very suitable device for performing LAI estimations at the high spatial level, observing a seasonal LAI dynamic, and for long-term monitoring of LAI.

An accurate estimation of leaf area index (LAI) is crucial for many models of material and energy fluxes within plant ecosystems and between an ecosystem and the atmospheric boundary layer. Therefore, three methods (litter traps, needle technique, and PCA) for taking precise LAI measurements were in the presented protocol.

Saf Yaprak Döken Standlarda Üç Farklı Yöntem Kullanılarak Yaprak Alan İndeksi Tahmini

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...

Investigation of Xenobiotics Metabolism In Salix alba Leaves via Mass Spectrometry Imaging

The method presented uses mass spectrometry imaging (MSI) to establish the metabolic profile of S. alba leaves when exposed to xenobiotics. Using a non-targeted approach, plant metabolites and xenobiotics of interest are identified and localized in plant tissues to uncover&#160;specific distribution patterns. Then, in silico prediction of potential metabolites (i.e., catabolites and conjugates) from the identified xenobiotics is performed. When a xenobiotic metabolite is located in the tissue, the type of enzyme involved in its alteration by the plant is recorded. These results were used to describe different types of biological reactions occurring in S. alba leaves in response to xenobiotic accumulation in the leaves. The metabolites were predicted in two generations, allowing the documentation of successive biological reactions to transform xenobiotics in the leaf tissues.

Investigation of Xenobiotics Metabolism In Salix alba Leaves via Mass Spectrometry Imaging

This method uses mass spectrometry imaging (MSI) to understand metabolic processes in S. alba leaves when exposed to xenobiotics. The method allows the spatial localization of compounds of interest and their predicted metabolites within specific, intact tissues.

Salix alba Leaves'ta Kizobiyotik Metabolizmasının Kütle Spektrometresi Görüntüleme Yoluyla Araştırılması

The method presented uses mass spectrometry imaging (MSI) to establish the metabolic profile of S. alba leaves when exposed to xenobiotics. Using a ...