Bu nedenle nörminik asit türevi sadece patojenik bakterilerde bulunur, aminiglikozile flagella bu şekeri içerir. Genlerde bulunan bölgenin çerçeve delesyonu, flagella glikozilasyon kümelerinin bulunmasına yardımcı olabilir. Bu teknik, aralarında yüksek homolojiye sahip olan ve farklı süreçlerde yer alan glikoziltransferazlar gibi en son spesifik bölge veya genleri ve flagella glikozilasyon sürecine katılımını analiz eder.
Bu teknik aynı zamanda patojenik bakterilerde ilgili polisakkaritlerin biyosentezinde rol oynayan glikoziltransferazların rolünü ve ayrıca flagella oluşumunda rol oynayan gen kodlayan proteinlerin rolünü bulmaya yardımcı olabilir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımın teknisyeni Maite Polo olacak. DNA bölgelerini, silinecek seçilen gen veya bölgenin yukarı ve aşağı akışını yükselten iki çift primer tasarlayın.
Primer A ve D'nin beş asal uçta, pDM4'te klonlamaya izin veren bir endonükleaz için bir kısıtlama bölgesi içermesi gerekir. B ve C primerlerinin silinecek genin içinde veya silinecek bölgenin ilk ve son geninin içinde olduğundan emin olun. Her iki primerin de çerçeve içinde olduğundan ve genin içinde beş ila altı kodon arasında bulunduğundan emin olun.
Her iki primerin de DNA amplikonları AB ve CD'ye katılmak için beş asal uçta 21 baz çifti tamamlayıcı bir dizi içerdiğinden emin olun.AB ve CD primerleri olan iki asimetrik PCR setinde şablon olarak 100 nanogram saflaştırılmış kromozomal DNA kullanın, ardından elde edilen ürünlerin analizi% 1 agaroz jelinde analiz edin. Eksize edilen amplikonları elektroforetik jelden arındırın ve ölçün. Her amplikonun 100 nanogramını astarsız PCR reaktifleri ile karıştırın.
Genişlettikten sonra, A ve D astarları ekleyin ve bunları tek bir parça olarak yükseltin. Daha sonra elde edilen ürünleri daha önce açıklandığı gibi analiz edin, saflaştırın ve ölçün. Bir mikrogram pDM4 ve 400 nanogram AD amplikonunu bir endonükleaz ile sindirin.
Sindirilmiş pDM4'ü bir molar vektörde AD amplikon ile birleştirerek bir ila dört oranında ekleme yapın ve ligasyon reaksiyonunu hazırlayın. Gece boyunca 20 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, T4 ligazını 20 dakika boyunca 70 santigrat derecede etkisiz hale getirin.
Escherichia coli suşunu Luria Bertani Miller suyuna aşılayın ve 0.4 ila 0.6 arasında bir optik yoğunluk gözlenene kadar 200 RPM'de sallanarak 30 santigrat derecede inkübe edin. Bakteri kültürünü 15 dakika boyunca 5.000 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleme ile toplayın. Peleti soğutulmuş damıtılmış suda askıya alın ve temizleme işlemini iki kez daha tekrarlayın.
Bakteri süspansiyonunu mikrofüj tüplerine aktarın ve santrifüjlemeyi beş dakika boyunca 14.000 kez G ve dört santigrat derecede tekrarlayın. Pelet soğutulmuş suda yeniden askıya alındıktan sonra, yaklaşık 3.5 mikrolitre ligasyon karışımı ekleyin ve beş dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. İçeriği soğutulmuş iki milimetre boşluklu elektroporasyon küvetine aktarın.
Elektroporasyondan sonra SOC ortamını ekleyin ve içeriği bir kültür tüpüne aktarın. 200 RPM'de sallayarak 30 santigrat derecede bir saat boyunca kuluçkaya yatırın. LB agar plakaları üzerindeki dönüştürülmüş hücreleri kloramfenikol ile desteklenmiş olarak plakalayın.
PDM4 klonlama tarafını çevreleyen primerleri kullanarak silme yapısının PCR ile pDM4'e yerleştirilmesini kontrol edin. Gece kültürleri hazırlayın, böylece alıcı Aeromonas suşunun rifampisine dirençli ve iki farklı Escherichia coli suşu. Donör suşu pDM4 rekombinant plazmid ile ve yardımcı suş PRK 2073 plazmid ile 30 santigrat derecede.
Donör, alıcı ve yardımcı suşların aynı sayıda kolonisini, 150 mikrolitre LB ile üç LB tüpünde askıya alın. Daha sonra antibiyotiksiz bir LB agar plakasında, üç bakteriyel süspansiyonu bir alıcıda iki damla halinde karıştırarak donöre beş ila bire bir oranında yardımcı olun ve plakayı gece boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. LB agar plakasına bir mililitre LB suyu ekleyerek bakterileri hasat edin. Bakteriyel süspansiyonu konik 1.5 mililitrelik bir mikrofüj tüpüne ve kuvvetli bir şekilde girdaba aktarın.
Bakteriyel süspansiyonun 100 mikrolitresini rifampisin ve kloramfenikol ile LB agar plakalarına yayın. 200 mikrolitre ve 600 mikrolitre numuneyi döndürün, peleti 100 mikrolitre LB et suyunda askıya alın ve LB agar üzerindeki plakayı rifampisin ve kloramfenikol ile inkübasyon ile takip edin. Kolonilerin Aeromonas olduğunu doğrulamak için bir oksidaz testi yapın.
Ayrıca, pDM4 rekombinant plazmidinin E ve F primerlerini kullanarak PCR ile spesifik kromozomal bölgeye yerleştirildiğini onaylayın. Rekombinant kolonileri% 10 sakkaroz ile ve gece boyunca 30 santigrat derecede antibiyotik olmadan iki mililitre LB içinde büyütün. Farklı kültür seyreltmeleri hazırlandıktan sonra, bakteri kültürlerinin 100 mikrolitresini ve LB agar plakasındaki seyreltmeleri% 10 sakkaroz ile plakalayın ve gece boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin.
Ertesi gün, kolonileri toplayın ve kloramfenikollü ve kloramfenikolsüz LB plakalarına aktarın. Onları gece boyunca 30 santigrat derecede inkübe ettikten sonra, kloramfenikol duyarlı kolonileri seçin. EF primer çiftini kullanarak PCR ile hassas kolonileri analiz edin ve PCR ürünü silinen yapının boyutuyla ilişkili olan kolonileri seçin.
Kapak slaytının dört köşesine küçük bir damla silikon koyun ve gece boyunca yetiştirilen Aeromonas kültürünü bir kapak kaydırağına monte edin. Kapak slaytına kazılmış bir slayt yerleştirin ve slaytı baş aşağı çevirin. Optik mikroskop kullanarak ışık mikroskobu ile yüzme hareketliliğini analiz edin, ardından kültürün üç mikrolitresini yumuşak bir agar plakasının merkezine aktarın.
Plakayı gece boyunca 25 ila 30 santigrat derece arasında yüzüstü inkübe edin. Kuluçkanın sonunda bir cetvel kullanarak, plaka merkezinden agar boyunca çevreye doğru bakteri göçünü ölçün. Kültür Aeromonas gece boyunca 900 mililitre TSB'de 25 ila 30 santigrat derece arasında gerilir.
Santrifüjlemeden sonra, peleti pH 7.8'in 100 milimolar Tris hidrojen klorür tamponunun 20 mililitresinde askıya alın. Ankrajlı flagellayı çıkarmak için, süspansiyonu üç ila dört dakika boyunca cam çubuklu bir girdapta tutun ve ardından 21 gauge şırıngadan tekrar tekrar geçirin. Bakterileri dört santigrat derecede iki ardışık santrifüjleme ile toplayın ve süpernatantı ayrı bir tüp halinde toplayın.
Süper nantantı ultrasantrifüjledikten sonra, peleti iki milimolar EDTA tamponu içeren 150 mikrolitre 100 milimolar Tris hidrojen klorür içinde askıya alın. Flagella'nın zenginleştirilmiş fraksiyonunun 150 mikrolitresini ince duvarlı ultra berrak bir tüpe aktarın ve 12 mililitre sezyum klorür çözeltisi ile doldurun. Tüpü sallanan bir kova rotorunda dört santigrat derecede 48 saat boyunca 60.000 kez G'de ultrasantrifüj yapın.
Flagella bandını bir şırınga ile sezyum klorür gradyanına toplayın ve 100 milimolar Tris hidrojen klorür artı iki milimolar EDTA'ya karşı diyaliz, ardından elektroforez ve Coomassie mavi boyama veya kütle spektrometrisi ile analiz edin. Aşağıdaki şekilde, şerit WT Aeromonas piscicola AH3'tür. Bir ila sekiz şerit, ikinci rekombinasyonun kloramfenikol duyarlı kolonilerini gösterir.
ST hiper mesane 1KB belirtecidir. Bir ila üç ve beş ila sekiz şerit, vahşi tip FGI4 genine sahip kolonileri şerit WT olarak gösterir. Dördüncü şerit, silinmiş FGI4 genine sahip bir koloni gösterir. Işık mikroskobu testleri, polar veya lateral flagella modifikasyonlarının sadece migrasyon çaplarında azalmaya yol açtığını, bu nedenle AH-3 FGI mutantı ve AH-3 FGI-4 mutantlarının vahşi tip suşuna göre sadece azalmış hareketlilik gösterdiğini göstermiştir.
Şekil, birinci şeridin AH-3'ünden polar flagellum ve şerit iki'nin FGI bölgesindeki mutantların ve üçüncü şeridin FGI-4 genindeki mutantların olmadığını, burada her iki mutantın da vahşi tip suşundan daha düşük moleküler ağırlığa sahip polar flagellinlere sahip olduğunu göstermektedir. flagella glikanındaki değişiklikler. Mutasyonların aşağı akış genlerini etkilemediğinden ve flagella düzeneğinin yetersizliğine veya flagella filamentlerinin yetersizliğine yol açmasını sağlamak önemlidir. Flagelin proteinlerindeki değişim tespit edilemediğinde, glikan kütlesini bilmek için flagellin peptidlerinin toplam proteinini kullanarak kütle spektrometresi analizi gereklidir.
