Bu çalışma Gastroenteroloji / Kanada Sağlık Araştırma / Crohn Derneği ve Kanada New Araştırmacı Ödülü Kolit Vakfı Kanadalı Derneği tarafından desteklenen LMS için Crohn ve Kanada Kolit Vakfı bir &#39;Araştırma Yardım Grant&#39; tarafından desteklenmiştir.

1. Klodronat içeren Lipozomlar kullanma Delen Makrofajlar <ol><li> Lipozomlar 4 ° C&#39;de saklanır İki saat enjeksiyondan önce, oda sıcaklığına (18 ° C) gelmesini sağlamak için buzdolabından klodronat içeren lipozomlar, PBS içeren lipozomlar veya steril PBS (enjeksiyon kontrolü) çıkarın. </li><li> 1 ml enjektöre 200 ul yüklemeden önce eşit dağılımını sağlamak için lipozomlar 8-10 kez içeren tüpler ters çevirin. Şırınga üstüne bir 26 gauge iğne takın. </li><li> Sadece kendi kafa ve bacaklarda hareketsiz yeterli cilt tutan kulakları aşağıda sol elinizle, berduş fare kullanma. </li><li> Iç organların karın sağ alt kadranda bulunan enjeksiyon, uzaklaşın böylece başını yere doğru biraz yani fare eğin. </li><li> Avuçlarınızın arasında şırınga yuvarlayın ve enjeksiyon için eşit önce lipozom çözümü dağıtmak için 6 kez ters çevirin. </li> &lt;li&gt; 30-40 derecelik bir açıyla fare karnın sağ alt tarafında iğne yerleştirin. Lipozom çözüm veya PBS 200 mikrolitre enjekte edilir. </li><li> Tetiklenmiş bir inflamasyon modeli sırasında, DSS bağlı kolit gibi yeni infiltre makrofajlar tüketmek protokolü sırasında ikamet makrofaj ve her 2 günde tükenmesi sağlamak için önce deneysel inflamasyon başlangıcından 4 gün fareler enjekte. </li><li> Deney sonunda, planlanan deneysel analizleri ile birlikte, ilgi sitesinden dokuların kaldırmak ve immünohistokimyasal makrofaj tükenmesi onaylamak için paraformaldehit ile sabitleyin. </li></ol> 2. Kemik İliği ASPİRAT gelen Polarize Makrofajlar türetilmesi <ol><li> Yaş 8 ve 12 hafta arasında farelerin kemik iliği kemik iliği kaynaklı makrofajlar en yüksek verim sağlar. Fare Euthanize, onun sırtüstü yatıyordu, ve mümkün olduğunca bacakları germe, pençeleri mecbur. </li><li> Hoo steril bir çalışmad, mümkün olduğu kadar çok kas gibi kesilip, femur ve tibia çıkarın. </li><li> % 10 FCS ile IMDM kullanarak kemiklerden Flush iliği, 26 gauge iğne ile donatılmış bir 5 ml şırınga içine yüklenir. </li><li> Seyreltilir kemik iliği% 10 FCS, bir 75 cm 2 doku kültürü şişe içinde yer hücreler ve 37 ° C&#39;de inkübe edilir, 5% 4 saat boyunca CO2 ile IMDM içinde 40 ml aspire. Bu adım, hematopoietik öncü yapışık mezenkimal hücreler veya olgun makrofajlar kaldırır. </li><li> 1200 rpm&#39;de 5 dakika boyunca 50 ml konik Falcon tüpü ve santrifüj ile yapışmaz progenitörlerin içeren transferi kültür yüzey maddesi. </li><li> Pastör pipetiyle hücre 5 ml IMDM yılında pelet,% 10 FCS ve asetik asit 20 hücre süspansiyonu 1 seyreltilmesiyle çekirdekli hücreleri saymak. Bu prosedür, kırmızı kan hücreleri ve kalan çekirdek bir hemositometre sayılabilir dahil tüm hücreleri lyses. </li><li> 0.5 &#39;lik bir konsantrasyon x 10 6 hücre / ml tam medyum içinde azından Pastör pipetiyle hücreleri; IMDM,% 10 FCS, 150 uM monothiogliserol (MTG) ve 10 ng / MCSF, GM-CSF, ya da IL-3 ya ml. GM-CSF-ya da IL-3-türevi makrofajlar alternatif olarak aktive edilir ise MCSF-türevi makrofajlar, klasik olarak makrofajlar aktive edilir. </li><li> Yapışmaz hücreleri aşağı eğirme ve şişeyi onları dönen ve gün 7&#39;de atarak yapışmaz hücreleri, 4. günde orta değiştirin. </li><li> Buna ek olarak, IFNγ (10 ng / ml) ya da IL-4 (10 ng / ml) eğriltme makrofajlar etmek üzere gün 7&#39;de MCSF türetilmiş hücreler içeren şişe ilave edilebilir bir klasik olarak, sırasıyla, aktive edilmiş veya bir alternatif olarak aktif fenotipe. 3 gün daha hücreleri inkübe edin. </li><li> 10. günde, medya kaldırmak ve Hücre Disosiyasyon Tampon (Gibco-BRL) kullanılarak doku kültürü balonun hücreleri kaldırın. Sonra Place 5 oda sıcaklığında (18 ° C) 5 dakika hücrelerindeki tampon ml ve palmiye topuk sıkıca birkaç kez şişenin yan vuruyorum. Hücreler altında şişesi inceleyerek balonun kaldırdı emin olunmikroskop. Pipet ile 15 ml konik tüpe Falcon hücreleri tekrar süspanse edilir ve IMDM,% 10 FBS ilave bir 10 ml şişeye yıkanır. Havuz ve 300 × g az 5 dakika boyunca hücreleri aşağı spin. </li><li> Steril PBS içerisinde 10 pH7.4 7 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyonda bir hemasitometre ile Pastör pipetiyle kullanılarak canlı hücreler sayma. Makrofajlar farelere enjeksiyon için hazırdır. </li><li> Rezerv 1.0 × makrofaj fenotip değerlendirilmesi için 10 6 makrofajlar. Lipopolisakkarid salgılayan nitrik oksit yüksek seviyede ve IL-10 ve IL-12p70 ve düşük seviyede olmaları ile uyarılan, klasik olarak aktive makrofajlar alternatif aktive makrofajlar kıyasla. Alternatif olarak aktive makrofajlar yapısal olarak YM1 ve Batı immunoblotting ile tespit edilebilir arginaz I (Argi), ifade eder. </li></ol> 3. Fareler içine Makrofajlar tranferring <ol><li> 10. 7 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyonda steril PBS içinde Pastör pipetiyle makrofajlar. Bu, bir sağlargüvenli ve rahat kuyruk veninden farelere enjekte edilebilir bir hacmi 100 ul, toplam hacmi 10 6 makrofajların travenous enjeksiyon. </li><li> Kuyruk veni genişletmek için 5-10 dakika bir ısıtma yastığı veya sıcak kucağında kullanarak Sıcak fareler. Hipertermi belirtileri için her zaman fare izleyin. </li><li> Kuyruk damarlar erişime izin veren bir frenleyici cihaz için fareyi aktarın. </li><li> Kuyruk 90 ° çevirin ven yukarı bakacak şekilde. Damarları kuyruk her iki yanal olarak aşağı doğru çalıştırma ve ven ya da kullanılabilir. </li><li> Bir alkollü bez ile enjeksiyon yeri temizleyin ve yavaş yavaş 26 veya 28 gauge iğne ile 1 ml şırınga kullanarak 100 ul (10 6 makrofajlar) enjekte edilir. Yukarı gelecek şekilde eğim yüzü ve ven neredeyse paralel hafif bir açıyla iğne yerleştirin. </li><li> Iğnenin doğru takılırsa hiçbir direnç hissettim edilmeli ve damar enjeksiyonu sonrası net olmalıdır. İğne mevcut değilseven, kuyruk çıkıntı olacak. Bu durumda, iğneyi çıkarın ve tekrar son girişimi veya diğer ven proksimalinde deneyin. Kuyruk sert ve iğne kuyruk damarından enjeksiyon sırasında çabuk sıkıcı hale yeni bir iğne her enjeksiyon için kullanılmalıdır. </li><li> Enjeksiyonu takiben, iğneyi çıkarın kanama durana kadar enjeksiyon yerinde hafifçe basınç uygulayın ve bu kanama durdu sağlamak için ek bir 5min için fare izlemek. </li><li> Deneysel işlem sırasında polarize makrofajların sürekli teslim olması için her türlü 4 gün makrofaj enjeksiyonları tekrarlayın. </li><li> Deney sonunda, deneysel analizleri ile birlikte, ilgi sitesinden dokuların kaldırmak ve immünohistokimyasal polarize makrofajların etkili teslim onaylamak için paraformaldehid veya formalin ile sabitleyin. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Ikamet macrop sayısı ve fenotipHerhangi bir dokuda hages incelenen doku bağlıdır ve enfeksiyon veya inflamasyon döneminde değişecek. Benzer şekilde, bir doku makrofajlar tüketeceğinden klodronat-içeren lipozomlar yeteneği idare ve hedef doku için etkili bir teslimat güzergahı bağlı olacaktır. F4/80 azalma + makrofaj işaretleyici, F4/80 (Şekil 1A) için immünhistokimyasal boyama ile belirgindir DSS bağlı kolit sırasında fare kolon makrofajlarda klodronat içeren lipozomlar sonuçları intraperitoneal. Histolojik boyama de doku kesitlerinde makrofaj sayısı ve fenotip nicel farklılıkları belirlemek için kullanılabilir. Şekil 1B farelere enjekte edildiğinde makrofajların 55 ortalama% fare kolon tespit hiçbir tükenmesi göre klodronat içeren lipozomlar tarafından tüketilmiş olduğunu gösterir enjeksiyon kontrol olarak PBS yalnız. Her değer F4/80 ve Argi leke sayarak belirlenirsayma deneysel durumu bilmeyen iki kişi tarafından gerçekleştirilen ile fare başına 3 bölümde 3 noktada 6 fare, seri doku kesitlerinde ed pozitif hücreler. Bu sonuçlar, klodronat lipozomlar intraperitoneal farelerde kolon makrofajlar tüketen göstermektedir. (GM-CSF veya IL-3-türevi veya MCSF-türetilen ve klasik olarak aktive (MCSF-türetilen ya MCSF-türetilen ve IFNγ ile muamele) ya da alternatif olarak aktive edilir farklı büyüme faktörleri verim makrofajlar varlığında kemik iliği makrofajlar türetilmesi ), IL-4 ile muamele edilmiştir. 8 haftalık bir fareden 2 femur ve 2 tibia kemik iliği Flushing genellikle fare başına 6 × 10 7 çekirdekli hücreler ve verimleri 8 × 10 6 MCSF kökenli makrofajlar, 10 × 10 6 GM-CSF kökenli makrofajlar, ya da 12 verir × 10 6, IL-3-türevi makrofajlar. Şekil 2A makrofaj nitrit ve IL-12p70/IL-10 oranı sup gösterirernatants 24 saat boyunca lipopolisakkarit ile muamele Şekil 2B 0,5 tipik bir Western blot analizi × MCSF den 10 makrofajlar 6 + / gösterir -. IL-4 türetilmesi koşulları alternatif aktive makrofajlar belirteçler, Argi, YM1 yönelik antikorlar ile probed, ya da bir şekilde GAPDH ile kontrolü yükleniyor. Bu veriler, kemik iliği kaynaklı makrofajlar türetme sırasında kutuplaşmış bir fenotipi etkiye sahip olabileceğini göstermektedir. Bir doku ex vivo elde polarize makrofajların etkin transferi yönetim ve doku erişim yolu bağlıdır. DSS indüklenen kolit sırasında, makrofajlar enflamasyon sitesine seyahat ve alternatif olarak aktive makrofajlar hastalığı şiddetini azaltmak damardan enjekte edilir. Şekil 3A makrofajlar toplam sayısını gösterir ve farelerin histolojik bölümlerde sayıldı Argi + (alternatif olarak aktif) makrofajların numarası polarize enjekte kemik iliğiMakrofaj kaynaklı. DSS bağlı kolit sırasında kolon polarize makrofajların transferi etkisi hastalık aktivite indeksi, kilo kaybı, rektal kanama, dışkı kıvamı ve azalmış (Şekil 3B) dayalı bir katkı puanı ile gösterilir. Bu sonuçlar, ex vivo olarak türetilmiş olduğunu göstermek, adoptively transfer makrofajlar kolon ve etkisini indüklenen inflamasyon trafik yapabilirsiniz. M2 makrofajlar önemli hastalık aktivite indeksi azaltmak ise M1 makrofajlar inflamasyon etkisi yoktur. <img src="/files/ftp_upload/4105/4105fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1. Klodronat içeren lipozomlar etkili F4/80 incelten + ve F480 + Argi + in vivo fare kolon hücreleri. Karışık C57BL / 6 × 129Sv arka plan üzerinde vahşi tip farelerin bir F2 nesil tedavi DSS önce PBS (Kontrol) veya klodronat içeren lipozomlar (Klodronat) 4 gün ile 7 gün ve enjekte IP için% 5 DSS verildive gün 0, 2, 4, ve 6 DSS tedavi sırasında on. (A) Kolonlar, kaldırıldı sabit ve bölümler olgun makrofajlar (F4/80) ve M2 makrofaj işaretleyici, Argi immünohistokimyasal olarak boyandı edildi. F4/80 (B) kantitasyonu + ve Argi + makrofajlar. Pozitif boyanan hücreler 3. bölüm / fareden ve 6 farelerin / gruptan 6 alanda 40 × büyütmede kullanılan deney koşullarını bilmeyen iki kişi tarafından sayıldı. * P &lt;0.01. <img src="/files/ftp_upload/4105/4105fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2,. MCSF-türevi makrofajlar, bir klasik olarak aktive fenotip ifade edebilir ve IL-4 ile muamele MCSF-türetilmiş bir alternatif aktive makrofajlar makrofaj fenotip ifade eder. (A) bir klasik olarak aktif fenotip ile uyumlu olarak, MCSF-türevi makrofajlar lipopolisakkarid yanıt olarak nitrik oksit daha yüksek seviyelerde üretmek ve onun aşağı metaboliti, nitrit algılar Griess deneyi ile ölçülebilir. Onlar alsELISA ile ölçülebilir daha yüksek bir IL-12p70/IL-10 oranı, üretmek o. * P n = 3 &lt;0.01. (B) bir alternatif aktive fenotipi ile uyumlu olarak, IL-4 yapısal olarak ifade YM1 ve Argi ile tedavi MCSF kökenli makrofajlar, hangi Batı immunoblotting tarafından tespit edilebilir. Veri benzer sonuçlar ile 3 bağımsız deneyler temsilcisi vardır. <img src="/files/ftp_upload/4105/4105fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3. İntravenöz enjeksiyonlu, ex vivo kaynaklı alternatif kolon makrofajlar trafik aktif ve bağırsak iltihabı azaltır. Bir karma C57BL / 6 × 129Sv arka plan üzerinde vahşi tip farelerin bir F2 kuşak altı gün süreyle içme suyu içinde% 5 DSS verildi. M1 ve M2 makrofajlar DSS tedavi sırasında Gün 0 ve 4 IV enjekte edildi. (A) Kolonlar, kaldırıldı sabit ve bölümler olgun makrofajlar (F4/80) için immünhistokimya ve M2 makrofaj işaretleyici (Argi) tarafından boyandı edildi.Kontrolü PBS enjekte fareler (C) makrofajlar kantitasyonu, M1 makrofajlar (+ M1) ve M2 makrofajlar (+ M2) enjekte edilmiş farelere enjekte edilen farelerde 3 bölümden / fareden 6 alanda 40 × büyütme ile pozitif boyanan hücrelerin sayımı ile yapıldı ve 6 fare / grup. Sayma deneysel durumu bilmeyen iki kişi tarafından gerçekleştirildi. (B) Hastalık aktivitenin izlendiği ve tedavi sırasında günlük attı ve kilo kaybı, rektal kanama, dışkı kıvamı ve azalmış dayanan bir katkı puanı dir. * P n &lt;0.05, 2 bağımsız deneyde = 6 fareler.

<ol>
	<li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+activation+of+macrophages.">Alternative activation of macrophages.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).</li><li>Rescigno, M., Lopatin, U., Chieppa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+among+dendritic+cells,+macrophages,+and+epithelial+cells+in+the+gut:+implications+for+immune+tolerance.">Interactions among dendritic cells, macrophages, and epithelial cells in the gut: implications for immune tolerance.</a> Curr. Opin. Immunol. 20, 669-675 (2008).</li><li>Heinsbroek, S. E., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+macrophages+in+inflammatory+bowel+diseases.">The role of macrophages in inflammatory bowel diseases.</a> Expert Rev. Mol. Med. 11, e14 (2009).</li><li>Collins, S. M., Piche, T., Rampal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+putative+role+of+inflammation+in+the+irritable+bowel+syndrome.">The putative role of inflammation in the irritable bowel syndrome.</a> Gut. 49, 743-745 (2001).</li><li>Maeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colon+cancer-derived+factors+activate+NF-kappaB+in+myeloid+cells+via+TLR2+to+link+inflammation+and+tumorigenesis.">Colon cancer-derived factors activate NF-kappaB in myeloid cells via TLR2 to link inflammation and tumorigenesis.</a> Mol. Med. Report. 4, 1083-1088 (2011).</li><li>van Rooijen, N., van Kesteren-Hendrikx, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clodronate+liposomes:+perspectives+in+research+and+therapeutics.">Clodronate liposomes: perspectives in research and therapeutics.</a> J. Liposome Res. 12, 81-94 (2002).</li><li>Hunter, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro-derived+alternatively+activated+macrophages+reduce+colonic+inflammation+in+mice.">In vitro-derived alternatively activated macrophages reduce colonic inflammation in mice.</a> Gastroenterology. 138, 1395-1405 (2010).</li><li>Weisser, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHIP-deficient,+alternatively+activated+macrophages+protect+mice+during+DSS-induced+colitis.">SHIP-deficient, alternatively activated macrophages protect mice during DSS-induced colitis.</a> J. Leukoc. Biol. 90, 483-492 (2011).</li><li>Qualls, J. E., Kaplan, A. M., van Rooijen, N., Cohen, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+experimental+colitis+by+intestinal+mononuclear+phagocytes.">Suppression of experimental colitis by intestinal mononuclear phagocytes.</a> J. Leukoc. Biol. 80, 802-815 (2006).</li><li>Van Rooijen, N., Sanders, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+mediated+depletion+of+macrophages:+mechanism+of+action,+preparation+of+liposomes+and+applications.">Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications.</a> J. Immunol. Methods. 174, 83-93 (1994).</li><li>Smith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+with+a+helminth+parasite+prevents+experimental+colitis+via+a+macrophage-mediated+mechanism.">Infection with a helminth parasite prevents experimental colitis via a macrophage-mediated mechanism.</a> J. Immunol. 178, 4557-4566 (2007).</li><li>van Rooijen, N., Hendrikx, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+for+specific+depletion+of+macrophages+from+organs+and+tissues.">Liposomes for specific depletion of macrophages from organs and tissues.</a> Methods Mol. Biol. 605, 189-203 (2010).</li><li>Kataoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+vitreal+macrophages+and+circulating+leukocytes+in+retinal+neovascularization.">The roles of vitreal macrophages and circulating leukocytes in retinal neovascularization.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 1431-1438 (2011).</li><li>Weisser, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+activation+of+macrophages+by+IL-4+requires+SHIP+degradation.">Alternative activation of macrophages by IL-4 requires SHIP degradation.</a> Eur. J. Immunol. 41, 1742-1753 (2011).</li><li>Cailhier, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+macrophage+ablation+demonstrates+that+resident+macrophages+initiate+acute+peritoneal+inflammation.">Conditional macrophage ablation demonstrates that resident macrophages initiate acute peritoneal inflammation.</a> J. Immunol. 174, 2336-2342 (2005).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Makrofajlar, bağışıklık sisteminin önemli bir rol oynamaktadır fagositik hücrelerdir. Onlar doğuştan gelen bağışıklık yanıtı başlatılması ve edinilmiş bağışıklık yanıtı yönetmenlik sorumludur. Tipik olarak, klasik olarak aktive makrofajlar IFNγ veya LPS ile aktive ve patojenlerin ortadan kaldırılması ve bir inflamatuvar yanıt 1 montajı için sorumludurlar. Bunun tersine, alternatif olarak aktive makrofajlar, IL-4 ve IL-13 ile aktive ve inflamasyon 1 çözünürlü...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Klodronat-içeren lipozomlar </td><td> <a href="http://Clodronateliposomes.org" target="_blank">Clodronateliposomes.org</a> </td><td></td></tr><tr><td> PBS-içeren lipozomlar </td><td> <a href="http://Clodronateliposomes.org" target="_blank">Clodronateliposomes.org</a> </td><td></td></tr><tr><td> Steril PBS pH7.4 </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td></tr><tr><td> IMDM </td><td> Invitrogen </td><td> 12440 </td></tr><tr><td> Fötal Buzağı Serumu (FCS) </td><td> Invitrogen </td><td> 12483 </td></tr><tr><td> asetik asit </td><td> BDH Aristar </td><td> BDH3092-500MLP </td></tr><tr><td> Monotiyogliserol (MTG) </td><td> Sigma </td><td> 96-275 </td></tr><tr><td> Recombyapıldıktan sonra aynı operas fare MCSF </td><td> Stemcell Teknolojileri </td><td> 02951 </td></tr><tr><td> GM-CSF Rekombinant murin </td><td> Stemcell Teknolojileri </td><td> 02935 </td></tr><tr><td> Rekombinan sıçan, IL-3 </td><td> Stemcell Teknolojileri </td><td> 02903 </td></tr><tr><td> Rekombinant fare IFNγ </td><td> Stemcell Teknolojileri </td><td> 02746 </td></tr><tr><td> Rekombinan sıçan, IL-4 </td><td> Stemcell Teknolojileri </td><td> 02714 </td></tr><tr><td> Hücre Ayrılma Tampon </td><td> Invitrogen </td><td> 13150-016 </td></tr><tr><td> Anti-F4/80 Antikor sıçan </td><td> AbD Serotec </td><td> MCA497GA </td></tr><tr><td> Fare anti-Argi Antikor </td><td> BD İletimi Laboratuvarları </td><td> 610708 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Bu protokolde kullanılan özel reaktifler.

depletion and reconstitution of macrophages in mice

Makrofajlar doğuştan bağışıklık yanıtı başlatılması ve edinilmiş bağışıklık yanıtı yönetmenlik bulaşıcı meydan okuma ya da yaralanma Doğal bağışıklık sisteminde önemli oyuncular vardır. Makrofaj disfonksiyon uygun bir bağışıklık yanıtı monte bir yetersizlik yol açabilir ve bu şekilde, inflamatuvar barsak hastalıkları gibi birçok hastalık süreçleri, karıştığı edilmiştir. Makrofajlar, kabaca iki kategoriye ayrılır polarize fenotipleri gösterilecek. Klasik aktive makrofajlar, IFNγ veya LPS ile uyarılması ile aktive çözünürlükte alternatif aktive makrofajlar ise, IL-4 veya IL-13 tarafından aktive, süpürücü enkaz ve doku yeniden katılmak ve suçlanmıştır bakteriyel meydan okumaya yanıt olarak önemli bir role enflamasyon faz. In vivo bir inflamatuvar yanıt sırasında, makrofajlar bağışıklık hücrelerinin infiltre karmaşık bir karışımı ortasında bulunan ve ağırlaştırarak ya çözümleriniz katılabileceklerdirg iltihabı. Bir bütün hayvan modelinde yerinde makrofajların rolünü tanımlamak için, bu karmaşık ortamdan makrofajlar tüketen etkisini incelemek gerekir. In situ makrofaj fenotip rolü hakkında soru sormak için, fenotipik olarak tanımlanan kutuplaşmış makrofajların kemik iliği aspirasyon gelen, ex vivo elde edilebilir ve veya makrofajların önceden tükenmesi olmadan geri farelere ekledi. Protokolde klodronat-içeren lipozomlar Burada sunulan, karşılık PBS enjekte kontroller, dekstran, sodyum sülfat (DSS) ile endüklenen farelerde kolit esnasında kolon makrofajlar tüketen için kullanıldı. Buna ek olarak, polarize makrofajlar ex vivo olarak elde edildi ve farelere damardan enjeksiyon yoluyla aktarılmıştır. Bu yaklaşımın bir uyarı olduğunu klodronat içeren lipozomlar böylece tükenmesi tarafından gözlemlenen etkisi makrofaj özgü, sulandırılması o olduğundan emin olmak için dendritik hücreler ve makrofajlar dahil olmak üzere tüm profesyonel fagositler, tüketmek olduğunumakrofajların evlatlık transferi ile f fenotip gereklidir. Farelerde sistemik makrofaj azalması da bir CD11b-DTR arka plan üzerine backcrossing fareler elde edilebilir, ki tamamlayıcı bir yaklaşımdır. Klodronat ihtiva eden lipozom-aracılı tükenmesi avantajı backcrossing farelerin dahil süresi ve masrafı gerekmez ve bağımsız olarak farelere (C57BL / 6, BALB / c, ya da karışık arka plan ve farelerde de kullanılabilir olmasıdır ).

Watch this Scientific Journal Video about Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice at JoVE.com

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Makrofajlar homeostasis merkezi bir rol oynar ve birçok dokularda patoloji. Burada sunulan protokol makrofajlar tüketen için kullanılan yöntemleri açıklar<em&gt; In vivo</em&gt;, Kemik iliği aspirasyon gelen polarize makrofajlar doğan ve adoptively farelere makrofajlar aktarılması. Bu teknikler polarize makrofajlar sağlık ve hastalıkta oynadığı rol belirlenmesini sağlar.

Farelerde Makrofajlar tükenmesi ve Sulandırma

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

depletion-and-reconstitution-of-macrophages-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

39.4K Görüntüleme.  University of British Columbia. Makrofajlar homeostasis merkezi bir rol oynar ve birçok dokularda patoloji. Burada sunulan protokol makrofajlar tüketen için kullanılan yöntemleri açıklar In vivo, Kemik iliği aspirasyon gelen polarize makrofajlar doğan ve adoptively farelere makrofajlar aktarılması. Bu teknikler polarize makrofajlar sağlık ve hastalıkta oynadığı rol belirlenmesini sağlar.

Video: Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

Kompleman tükenmesi Özel Hücre Populasyonlarının tükenmesi

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

Canlı Makrofagların içinde Phagolysosome Biogenesis&#39;den Çalışması

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

Kullanımı<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Otofaji-Sitoiskelet Etkileşimleri Okumak

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

Etkin Killer yapay antijen sunan hücreler (KaAPC)<em&gt; İn Vitro</em&gt; İnsan Antijen-spesifik T hücrelerinin tükenmesi

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

2D Elektroforez ile Makrofagların proteomik Profil

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Makrofaj Kolesterol tükenmesi ve Fagositoz Üzerine Etkisi<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like Shigella flexneri and Francisella novicida need to induce the rupture of the phagosome. In contrast, Salmonella typhimurium replicates in a vacuolar compartment, known as Salmonella-containing vacuole (SCV). However certain mutants of Salmonella fail to maintain SCV integrity and are thus released into the cytosol. The percentage of cytosolic vs. vacuolar bacteria on the level of single bacteria can be measured by differential permeabilization, also known as phagosome-protection assay. The approach makes use of the property of detergent digitonin to selectively bind cholesterol. Since the plasma membrane contains more cholesterol than other cellular membranes, digitonin can be used to selectively permeabilize the plasma membrane while leaving intracellular membranes intact. In brief, following infection with the pathogen expressing a fluorescent marker protein (e.g. mCherry among others), the plasma membrane of host cells is permeabilized with a short incubation in digitonin containing buffer. Cells are then washed and incubated with a primary antibody (coupled to a fluorophore of choice) directed against the bacterium of choice (e.g. anti-Salmonella-FITC) and washed again. If unmarked bacteria are used, an additional step can be done, in which all membranes are permeabilized and all bacteria stained with a corresponding antibody. Following the staining, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria can be quantified by FACS or microscopy by counting single or double-positive events. Here we provide experimental details for use of this technique with the bacterium Salmonella typhimurium. The advantage of this assay is that, in contrast to other assay, it provides a quantification on the level of single bacteria, and if analyzed by microscopy provides the exact number of cytosolic and vacuolar bacteria in a given cell.

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

Koful genel Sitosolik kantifikasyonu<em&gt; Salmonella</em&gt; Diferansiyel permeabilizasyon tarafından İlköğretim Makrofagların içinde

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Salmonella typhimuriumyalıtım-makrofajlar üzerinden Phagosomes içeren

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Tuning Degradation to Achieve Specific and Efficient Protein Depletion

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting them for degradation. This system is exploited in many non-plant eukaryotes, such that a target protein, tagged with the AID motif, is degraded upon auxin addition. The level of TIR1 expression is critical; excessive expression leads to degradation of the AID-tagged protein even in the absence of auxin, whereas low expression leads to slow depletion. A &#946;-estradiol-inducible AID system was created, with expression of TIR1 under the control of a &#946;-estradiol inducible promoter. The level of TIR1 is tunable by changing the time of incubation with &#946;-estradiol before auxin addition. This protocol describes how to rapidly deplete a target protein using the AID system. The appropriate &#946;-estradiol incubation time depends on the abundance of the target protein. Therefore, efficient depletion depends on optimal timing that also minimizes auxin-independent depletion.

Here, we present a protocol to effectively and specifically deplete a protein of interest in the yeast Saccharomyces cerevisiae using the &#946;-est AID system.

Belirli ve verimli protein tükenmesi elde etmek için bozulma ayarlama

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting ...