Yazarlar, destekleri için NINDS hayvan bakım tesisi personeline teşekkür eder. Bu çalışma, NIH, NINDS (Yıllık Rapor Numarası 1ZIANS003129) Intramural Araştırma Bölümü tarafından desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Preklinik Fare Modellerinde İntravenöz Enjeksiyon Yoluyla AAV Bazlı Tedaviler

<ol>
	<li>Tisdale, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ideas+initiative:+Pilot+study+to+assess+the+impact+of+rare+diseases+on+patients+and+healthcare+systems.">The ideas initiative: Pilot study to assess the impact of rare diseases on patients and healthcare systems.</a> Orphanet J Rare Dis. 16 (1), 429 (2021).</li><li>Condo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rare+monogenic+diseases:+Molecular+pathophysiology+and+novel+therapies.">Rare monogenic diseases: Molecular pathophysiology and novel therapies.</a> Int J Mol Sci. 23 (12), 6525 (2022).</li><li>Vaisitti, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+frequency+of+rare+and+monogenic+diseases+in+pediatric+organ+transplant+recipients+in+italy.">The frequency of rare and monogenic diseases in pediatric organ transplant recipients in italy.</a> Orphanet J Rare Dis. 16 (1), 374 (2021).</li><li>Bulcha, J. T., Wang, Y., Ma, H., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vector+platforms+within+the+gene+therapy+landscape.">Viral vector platforms within the gene therapy landscape.</a> Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 53 (2021).</li><li>Lundstrom, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+in+gene+therapy:+Where+do+we+stand+in+2023.">Viral vectors in gene therapy: Where do we stand in 2023.</a> Viruses. 15 (3), 698 (2023).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+non-viral+vectors+for+gene+delivery.">Emerging non-viral vectors for gene delivery.</a> J Nanobiotechnology. 21 (1), 272 (2023).</li><li>Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(aav)+as+a+vector+for+gene+therapy.">Adeno-associated virus (aav) as a vector for gene therapy.</a> BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).</li><li>Ghosh, S., Brown, A. M., Jenkins, C., Campbell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vector+systems+for+gene+therapy:+A+comprehensive+literature+review+of+progress+and+biosafety+challenges.">Viral vector systems for gene therapy: A comprehensive literature review of progress and biosafety challenges.</a> Appl Biosaf. 25 (1), 7-18 (2020).</li><li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery.">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nat Rev Drug Discov. 18 (5), 358-378 (2019).</li><li>Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationale+and+strategies+for+the+development+of+safe+and+effective+optimized+aav+vectors+for+human+gene+therapy.">Rationale and strategies for the development of safe and effective optimized aav vectors for human gene therapy.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 32, 949-959 (2023).</li><li>Mukherjee, P., Roy, S., Ghosh, D., Nandi, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+animal+models+in+biomedical+research:+A+review.">Role of animal models in biomedical research: A review.</a> Lab Anim Res. 38 (1), 18 (2022).</li><li>Jucker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+benefits+and+limitations+of+animal+models+for+translational+research+in+neurodegenerative+diseases.">The benefits and limitations of animal models for translational research in neurodegenerative diseases.</a> Nat Med. 16 (11), 1210-1214 (2010).</li><li>Vandamme, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+rodents+as+models+of+human+diseases.">Use of rodents as models of human diseases.</a> J Pharm Bioallied Sci. 6 (1), 2-9 (2014).</li><li>Anders, H. J., Vielhauer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+and+validating+novel+targets+with+in+vivo+disease+models:+Guidelines+for+study+design.">Identifying and validating novel targets with in vivo disease models: Guidelines for study design.</a> Drug Discov Today. 12 (11-12), 446-451 (2007).</li><li>Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+substances+to+laboratory+animals:+Routes+of+administration+and+factors+to+consider.">Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).</li><li>Prabhakar, S., Lule, S., Da Hora, C. C., Breakefield, X. O., Cheah, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aav9+transduction+mediated+by+systemic+delivery+of+vector+via+retro-orbital+injection+in+newborn,+neonatal+and+juvenile+mice.">Aav9 transduction mediated by systemic delivery of vector via retro-orbital injection in newborn, neonatal and juvenile mice.</a> Exp Anim. 70 (4), 450-458 (2021).</li><li>Hauff, P., Nebendahl, K., Kiessling, F., Pichler, B. J., Hauff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+administration.">Drug administration.</a> Small Animal Imaging: Basics and Practical. , 127-152 (2017).</li><li>Saleem, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+best+practice+for+validating+tail+vein+injections+in+rat+with+near-infrared-labeled+agents.">A new best practice for validating tail vein injections in rat with near-infrared-labeled agents.</a> J Vis Exp. (146), (2019).</li><li>Resch, M., Neels, T., Tichy, A., Palme, R., Rulicke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+assessment+of+tail-vein+injection+in+mice+using+a+modified+anaesthesia+induction+chamber+versus+a+common+restrainer+without+anaesthesia.">Impact assessment of tail-vein injection in mice using a modified anaesthesia induction chamber versus a common restrainer without anaesthesia.</a> Lab Anim. 53 (2), 190-201 (2019).</li><li>Glascock, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+therapeutic+agents+through+intracerebroventricular+(icv)+and+intravenous+(iv)+injection+in+mice.">Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (icv) and intravenous (iv) injection in mice.</a> J Vis Exp. (56), 2968 (2011).</li><li>Grames, M. S., Jackson, K. L., Dayton, R. D., Stanford, J. A., Klein, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+and+tips+for+intravenous+administration+of+adeno-associated+virus+to+rats+and+evaluation+of+central+nervous+system+transduction.">Methods and tips for intravenous administration of adeno-associated virus to rats and evaluation of central nervous system transduction.</a> J Vis Exp. (126), 55994 (2017).</li><li>Yano, J., Lilly, E. A., Noverr, M. C., Fidel, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+contemporary+warming/restraining+device+for+efficient+tail+vein+injections+in+a+murine+fungal+sepsis+model.">A contemporary warming/restraining device for efficient tail vein injections in a murine fungal sepsis model.</a> J Vis Exp. (165), 61961 (2020).</li><li>Warren, J. S. A., Feustel, P. J., Lamar, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+use+of+tail+vein+metastasis+assays+and+real-time+in+vivo+imaging+to+quantify+breast+cancer+metastatic+colonization+and+burden+in+the+lungs.">Combined use of tail vein metastasis assays and real-time in vivo imaging to quantify breast cancer metastatic colonization and burden in the lungs.</a> J Vis Exp. (154), 60687 (2019).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lab Animal Research. Compound administration I. , (2023).</li><li>UCSF Office of Research, Institutional Animal Care and Use Program. Lateral tail vein injection in mice and rats (preferred technique for vascular access in mice Available from: <a target="_blank" href="https://iacuc.ucsf.edu/sites/g/files/tkssra751/f/wysiwyg/STD%20PROCEDURE%20-%20Misc%20Rodent%20Procedures%20-%20Lateral%20Tail%20Vein%20Injection%20in%20Mice%20and%20Rats.pdf">https://iacuc.ucsf.edu/sites/g/files/tkssra751/f/wysiwyg/STD%20PROCEDURE%20-%20Misc%20Rodent%20Procedures%20-%20Lateral%20Tail%20Vein%20Injection%20in%20Mice%20and%20Rats.pdf</a> (2023)</li><li>Jones, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tail+vein+injections+in+the+mouse+and+rat+sop.">Tail vein injections in the mouse and rat sop.</a> UBC Animal Care Guidelines SOP: ACC-2012-Tech03. , (2012).</li><li>Liadaki, K., Luth, E. S., Kunkell, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-detection+of+gfp+and+dystrophin+in+skeletal+muscle+tissue+sections.">Co-detection of gfp and dystrophin in skeletal muscle tissue sections.</a> Biotechniques. 42 (6), 699-700 (2007).</li><li>Burr, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allometric-like+scaling+of+aav+gene+therapy+for+systemic+protein+delivery.">Allometric-like scaling of aav gene therapy for systemic protein delivery.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 368-379 (2022).</li><li>Lang, J. F., Toulmin, S. A., Brida, K. L., Eisenlohr, L. C., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+screening+methods+underreport+aav-mediated+transduction+and+gene+editing.">Standard screening methods underreport aav-mediated transduction and gene editing.</a> Nat Commun. 10 (1), 3415 (2019).</li><li>Rodriguez-Estevez, L., Asokan, P., Borras, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+optimization+of+aav+vectors+for+human+gene+therapy+of+glaucoma+and+their+reversed+cell+entry+characteristics.">Transduction optimization of aav vectors for human gene therapy of glaucoma and their reversed cell entry characteristics.</a> Gene Ther. 27 (3-4), 127-142 (2020).</li><li>Hatakeyama, S., Yamamoto, H., Ohyama, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+formation+assays.">Tumor formation assays.</a> Methods Enzymol. 479, 397-411 (2010).</li></ol>

Yazarların bu makalede yayınlanan çalışma ile ilgili herhangi bir açıklaması yoktur.

AAV bazlı tedaviler, AAV'nin bir gen terapisi vektörü olarak çok yönlülüğü nedeniyle monogenik bozukluklar için büyük bir potansiyele sahiptir, bu da AAV'leri farklı bozuklukların çeşitli dağıtım ihtiyaçlarını karşılayacak şekilde özelleştirmeyi mümkün kılar 4,5,7,9. AAV'ler, potansiyel terapötiklerin güvenliğini ve etkinliğini test etmek için klinik öncesi fare modellerinde yaygın olarak IV enjeksiyon yoluyla uygulanır16. Enjekte edilen farklı AAV dozları deneysel sonuçlarda belirgin farklılıklara neden olabileceğinden, üretilen in vivo verilerin geçerliliğini ve sağlamlığını sağlamak için deneycilerin amaçlanan AAV dozunu tutarlı bir şekilde enjekte edebilmeleri kritik öneme sahiptir28. IV enjeksiyonlar yaygın olarak kullanılmaktadır, ancak teknik olarak zordur ve sürekli olarak başarılı enjeksiyonlar sağlayan bir beceri düzeyi geliştirmek ve sürdürmek için kapsamlı eğitim ve sürekli uygulama gerektirir 16,17,18,19. AAV'nin doğru bir şekilde enjekte edilmesine ek olarak, genellikle enjekte edilen AAV'nin biyolojik dağılımını ve hedef dokulara veya hücrelere iletim verimliliğini değerlendirmek için tahlillerin kullanılması arzu edilir29,30.
Bu protokol, 7-9 haftalık, sedasyonsuz farelerde AAV'yi uygulamak için optimize edilmiş bir IV enjeksiyon protokolünün ayrıntılarını ayrıntılı bir şekilde açıklayarak, deneycilerin IV enjeksiyonlarını başarılı ve tutarlı bir şekilde kolayca gerçekleştirmelerine yardımcı olmayı amaçlamaktadır. Burada kullanılan yaş aralığındaki vahşi tip farelerden belirgin şekilde daha küçük veya daha büyük olan farelerin, damarların görünürlüğünün azalması veya bu yöntemde kullanılan kısıtlayıcılarla uyumsuzluk nedeniyle daha büyük bir zorluk teşkil edebileceğini unutmamak önemlidir. Daha önce, kuyruk IV enjeksiyonlarının, küçük damar boyutu31 nedeniyle 6 haftalıktan küçük farelerde intravenöz olarak reaktiflerin uygulanması için uygun olmadığı bildirilmiştir. Mümkün olsa da, 22.0 g'dan daha hafif fareleri tutarlı bir şekilde enjekte etmek zor olabilir. başarılı bir şekilde. Atipik büyüklükte fareler kullanan araştırmacıların prosedüre uyarlamalar yapması gerekebilir. Bu protokol ayrıca AAV biyodağılımını ve transdüksiyon verimliliğini değerlendirmek için kullanılabilecek çeşitli testleri de özetlemektedir.
Bu protokolü takip ederken bazı kritik noktaların akılda tutulması gerekir. Enjeksiyon sırasında, iğne damar içinde değilse 29 G iğneler daha fazla direnç sağlar. Bu, başarısız enjeksiyon girişimleri sırasında çözeltinin yanlışlıkla perivasküler enjeksiyonundan kaybedilen hacmi azaltır. İnsülin şırıngaları, normal şırıngalardan daha küçük ölü hacimlere sahiptir. Burada listelenenlerden farklı bir şırınga ve / veya iğne kullanılıyorsa, daha büyük ölü alan hacmini hesaba katmak için protokol adımları 1.1.3.3'te ek enjeksiyon hacminin hazırlanması gerekebilir (ör., amaçlanan doza 15 μL yerine 30 μL ekleyin).
AAV dozunu şırıngaya aspire ederken şırınga kenarlarında ince aspirasyona bağlı hava kabarcıkları oluşursa, enjeksiyonu yavaşça şırınganın yukarısına doğru çekin. Bu, çoğu küçük hava kabarcığını ortadan kaldıracaktır. Enjekte edilecek istenen hacme en az 10-15 μL daha AAV yükleyin. Bu ek hacim, hava kabarcıklarının dışarı atılması veya olası başarısız enjeksiyon girişimleri sırasında kaybedilebilecek herhangi bir hacmi hesaba katmak içindir. (örneğin, enjekte edilecek hedef hacim 150 μL ise, şırıngaya 165 μL yükleyin (şırınga ölçeğindeki 160 μL ile 170 μL işaretlerinin yarısı). İğne damarın içine doğru bir şekilde yerleştirilmişse ve şırıngadaki hacim başarılı enjeksiyon girişiminden hemen önce 165 μL ise, reaktifi şırıngada 15 μL kalana kadar verin (10 μL ve 20 μL işaretlerinin yarısı), böylece 150 μL (165 μL - 150 μL = 15 μL)). Eğim lümeninin (eğim yukarı bakacak şekilde) şırınga ölçeği ile hizalanması, enjeksiyon sırasında verilen hacmin izlenmesini sağlar.
Bazı deneyciler, fareyi, ayakları üzerindeki bir fareye kıyasla damarlarından biri düz ve kolay erişilebilir olacak şekilde yan yatırmayı tercih edebilir. Bununla birlikte, bir farenin yan tarafındaki kuyruğu, fare boyutuna bağlı olarak farklı açılarda eğimli olacaktır ve farklı boyutlarda fareler enjekte edilirken enjeksiyon açısı ayarı gerektirecektir. Bu, prosedürün başarısının tutarlılığını olumsuz yönde etkileyebilir. İlk uygulama denemeleri sırasında, deneyciler tercih ettikleri yaklaşımı belirlemek için her iki fare kısıtlama yönelimini de deneyebilirler. Fareyi ayakları üzerinde tutmak, her iki yan kuyruk damarına hızlı ve kolay erişim sağlar. Bu, birden fazla başarısız enjeksiyon girişimi durumunda her iki damara erişim gerektiğinde kısıtlama süresini azaltır.
Lateral ven kuyruk tabanına yakın (fare gövdesine daha yakın) enjekte ediliyorsa (özellikle >30 g ağırlığındaki fareler için), enjeksiyon açısını damara paralel olarak damara 5°-10° olarak ayarlayın çünkü kuyruk tabanındaki damar distal olarak olduğundan biraz daha derindir.
Burada listelenen RNaz sindirimi ve RNA kontaminasyon kontrol protokolleri, 20 μL'de toplam 175-700 ng nükleik asit içeren taze dondurulmuş karaciğer dokularından izole edilen DNA örneklerinde doğrulanmıştır. RNaz sindirim protokolü, RNaz sindiriminden sonra vektör genomunun ve fare genomunun varlığını doğrulamak için taze donmuş karaciğer dokularından ve FACS'a göre sıralanmış hücrelerden izole edilen DNA örnekleri üzerinde de test edildi. Sonuçlar, hedef amplikonların son nokta PCR amplifikasyonunun agaroz jel elektroforezi kullanılarak görselleştirildi.
Açıklanan metodolojiyi takip etmek, IV enjeksiyonlarında ustalaşmak için gereken eğitim ve uygulama süresini azaltabilir ve reaktifleri kurtaracak daha yüksek bir başarılı enjeksiyon oranı ile sonuçlanabilir. Bu protokol, hazır bulunmayabilecek gelişmiş ekipman veya kurulumlara ihtiyaç duymadan basit ve yaygın olarak kullanılan araçları kullanır. Ayrıca, burada listelenen IV enjeksiyon adımları, enjeksiyona bağlı olarak enjeksiyon hazırlama adımlarında yapılan uygun modifikasyonlarla, antisens oligonükleotidler (ASO'lar) gibi intravenöz olarak uygulanması gereken çok çeşitli enjeksiyonlara uygulanabilir.

Monogenik bozukluklar, dünya çapında 300 milyon kişiyi toplu olarak etkileyen nadir hastalıkların %80'ini oluşturmaktadır 1,2. Şu anda bu büyük ölçüde zayıflatıcı nadir bozuklukların çoğu için onaylanmış bir iyileştirici tedavi yoktur 1,2,3. Bununla birlikte, monogenik bozukluklar, işlevsiz genleri değiştirebilen, tamamlayabilen, düzeltebilen veya susturabilen gen tedavileri için ideal adaylardır 4,5. Şu anda, belirli hücre tiplerine gen terapileri sağlamak için çoklu vektörler geliştirilmekte ve kullanılmaktadır 4,6. Bu vektörlerden biri adeno-ilişkili virüstür (AAV). AAV, gen terapisi vektörü7 olarak giderek daha fazla kullanılan patojenik olmayan bir parvovirüstür. Diğer viral vektörlerle karşılaştırıldığında, AAV daha düşük immünojenisiteye, konakçı genomuna entegrasyon potansiyelinden daha düşük ve çeşitli dokularda bölünen ve bölünmeyen hücreleri verimli bir şekilde dönüştürme yeteneğine sahiptir 7,8. Ek olarak, spesifik doku tropizmi veya daha da azaltılmış immünojenisite gibi arzu edilen özelliklere sahip AAV'leri tasarlamak ve tanımlamak için çoklu yaklaşımlar geliştirilmiştir, bu da AAV'nin farklı endikasyonlar için viral bir vektör olarak çok yönlülüğünü büyük ölçüde artırır9. Bu faktörler, AAV'yi yaygın olarak araştırılan bir gen terapisi vektörü haline getirmiş ve FDA onaylı çoklu AAV bazlı gen terapilerinin geliştirilmesine yol açmıştır10.
Fare modelleri, potansiyel gen terapilerini in vivo olarak test etmek ve monogenik bozuklukların patomekanizmalarını daha iyi anlamak için yaygın olarak kullanılır. Bunun nedeni, fare modellerinin farklı koşulların patolojilerini özetlemesi, genomlarının insan genomuna benzerliği ve fare kullanımı, bakımı ve 11,12,13 neslinin göreceli kolaylığıdır. İn vivo test, kas distrofileri gibi vücudun birden fazla sistemini veya bölgesini etkileyen bozuklukları incelerken özellikle önemlidir. Bu bozukluklar için, in vitro testler, sistemik uygulamadan sonra farklı vücut bölgelerine ulaşması amaçlanan terapötiklerin güvenliğini, etkinliğini, farmakokinetiğini ve farmakodinamiğini kapsamlı bir şekilde değerlendirmek için yeterli olmayabilir14.
İlaçları vermek için çeşitli sistemik uygulama yolları kullanılabilir. Her rotanın avantajları, dezavantajları ve araştırılan hayvan modeli ve ilaçla uyumluluk derecesi vardır15. İntravenöz (IV) lateral tail-ven enjeksiyonu, farelerde AAV'nin sistemik olarak verilmesi için yaygın olarak kullanılan bir yoldur16. Lateral kuyruk veni enjeksiyonları, enjekte edilen maddenin fare kan dolaşımına hızlı ve doğrudan uygulanmasına izin vererek sistemik dolaşımda yüksek ilaç biyoyararlanımı sağlar17. Ayrıca, gerçekleştirilmesi için nispeten basit ve yaygın olarak bulunan araçlar gerektirirler. Bununla birlikte, esas olarak küçük kuyruk damar çapı ve damarın yerinin belirlenmesindeki zorluk nedeniyle, lateral kuyruk veni enjeksiyonları teknik olarak zordur ve başarısız enjeksiyon girişimlerinden veya eksik doz dağıtımından kaçınmak için yüksek derecede beceri ve sürekli uygulama gerektirir 16,17,18,19. Bunlar, özellikle enjeksiyon gerçekleştirilirken eksik enjeksiyon tanınmazsa, pahalı reaktiflerin kaybına veya yanlış sonuçlara neden olabilir. Burada özetlenen deneyimimiz, kullanımımız için uyarladığımız, iyi belgelenmiş makalelerde bildirilen protokollere dayanmaktadır ve enjeksiyonların tutarlı bir şekilde başarılı olmasını sağlamak için lateral kuyruk-ven enjeksiyon prosedürünün çeşitli adımlarını optimize etmektedir 20,21,22,23,24,25,26,27.
Burada, basit ve yaygın olarak bulunan araçları kullanarak AAV'yi sedasyonsuz 7-9 haftalık farelere iletmek için bu ayrıntılı optimize edilmiş yanal kuyruk damarı enjeksiyon protokolünü açıklıyoruz. Ek olarak, AAV dağıtımını ve biyodağıtımını değerlendirmek için kullanılan yöntemler için protokoller sağlıyoruz. Bu protokoller, enjeksiyon sonrası doku toplama, doku fiksasyonu, DNA ekstraksiyonu ve diploid genom (vg/dg) ölçümü başına dijital polimeraz zincir reaksiyonu (dPCR) vektör genomunu kapsar. Burada sağlanan IV enjeksiyon protokolü ve işaretçileri, lateral kuyruk veni enjeksiyonlarının başarılı bir şekilde gerçekleştirilmesinin kolaylığını artırmayı amaçlamaktadır. Bu, potansiyel olarak enjeksiyon becerilerinde ustalaşmak için gereken süreyi azaltmaya yardımcı olurken, aynı zamanda enjeksiyonların doğruluğunu ve tutarlılığını da iyileştirecektir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGVM33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3 mL insulin syringes with 29G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>324702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL microcentrifuge&#160; tube</td>
			<td>Crystalgen</td>
			<td>23-2051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% EtOH</td>
			<td>The Warner Graham Company</td>
			<td>201096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td>Used to prepare 1x PBS for tissue fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube holder</td>
			<td>Multiple sources</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190 proof ethyl alcohol</td>
			<td>The Warner Graham Company</td>
			<td>6810-01-113-7320</td>
			<td>Used to prepare 70% ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x sterile PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microcentrifuge tissue storage tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022363344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>157-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adeno-associated virus (AAV)</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Single-stranded DNA (ssDNA) AAV was packaged to deliver Cre recombinase as the transgene driven by CMV promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swab</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead lysis tube</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>GREENE5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsuRI (HaeIII) restriction enzyme</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ER0151&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet blender</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BBX24B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ai14-derived mice from JAX 007914 strain (genetic background: C57BL/6J)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Mice containing Ai14 Cre-reporter allele were purchased from JAX (catalog number: 007914)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable absorbent pads</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1420662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T)</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T)</td>
			<td>14085-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA degradation reagent (DNAZap)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-Extraction RNase A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td>For RNA digestion during nucleic acid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase-free RNase for DNA cleanup</td>
			<td>&#160;F. Hoffmann-La Roche</td>
			<td>11119915001</td>
			<td>For RNA digestion after nucleic acid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPCR Probe PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>250102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPCR software&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>N/A&#160;</td>
			<td>QIAcuity Software Suite&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevated platform</td>
			<td>Multiple sources</td>
			<td>N/A</td>
			<td>An empty pipette tips box was used to elevate the mouse restrainer during tail warming up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Multiple sources</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model used here: Nikon Eclipse Ti</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope software&#160;</td>
			<td>Multiple sources&#160;</td>
			<td>N/A&#160;</td>
			<td>Software used here: NIS-Elements&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>9022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Thermomixer 5350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal container</td>
			<td>Vollrath</td>
			<td>80125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylbutane</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>Q223-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular grade water</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-029-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse tube restrainer</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>TV-RED-150-STD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myfuge mini centrifuge</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase chain reaction thermal cycler</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1851148</td>
			<td>Model: C1000 Touch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>7552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAcuity dPCR Nanoplate 26k 24-well</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>250001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAcuity One dPCR system</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>911020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td>Used for DNA extraction from tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen QIAamp DNA Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>56304</td>
			<td>Used for cleanup of genomic DNA, and the isolation of DNA from small volumes of blood prtocotol was used for DNA extraction from FACS-sorted cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent restrainer cone</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>MDC-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>72212663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam box</td>
			<td>Multiple sources</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface cleaner and disinfectant</td>
			<td>Peroxigard</td>
			<td>29101&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Multiple sources</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T)</td>
			<td>91113-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Daigger &#38; Company</td>
			<td>22220A</td>
			<td>Model: Daigger Vortex Genie 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

consistent delivery of adeno-associated virus via lateral tail-vein injection in adult mice

Birçok bozukluk birden fazla organı etkiler veya vücudun farklı bölgelerini içerir, bu nedenle farklı bölgelerde bulunan etkilenen hücreleri hedeflemek için terapötiklerin sistemik olarak verilmesi çok önemlidir. İntravenöz enjeksiyon, vücut çapında uygulamaya yönelik tedavileri değerlendiren klinik öncesi çalışmalarda yaygın olarak kullanılan bir sistemik uygulama yoludur. Yetişkin farelerde, terapötik ajanın farenin lateral kuyruk damarlarına intravenöz olarak uygulanmasını içerir. Ustalaşıldığında, kuyruk damarı enjeksiyonları güvenli ve hızlıdır ve yalnızca basit ve yaygın olarak bulunan aletler gerektirir. Bununla birlikte, kuyruk damarı enjeksiyonları teknik olarak zordur ve amaçlanan dozun doğru bir şekilde verilmesini sağlamak için kapsamlı eğitim ve sürekli uygulama gerektirir.
Burada, deneyimlerimize ve daha önce diğer gruplar tarafından bildirilen önerilere dayanarak geliştirdiğimiz ayrıntılı, optimize edilmiş, lateral kuyruk veni enjeksiyon protokolünü açıklıyoruz. Fare kısıtlayıcıları ve insülin şırıngaları dışında, bu protokol yalnızca çoğu laboratuvarda kolayca bulunabilen reaktifler ve ekipman gerektirir. Bu protokolün izlenmesinin, adeno-ilişkili virüsün (AAV) sedasyonsuz 7-9 haftalık farelerin kuyruk damarlarına tutarlı bir şekilde başarılı intravenöz iletimi ile sonuçlandığını bulduk. Ek olarak, AAV transdüksiyonunu ve biyodağılımını değerlendirmek için kullanılan diploid genom (vg/dg) kantifikasyonu başına floresan raportör proteinlerin ve vektör genomunun histolojik tespiti için optimize edilmiş protokolleri açıklıyoruz. Bu protokolün amacı, deneycilerin kuyruk-damar enjeksiyonlarını başarılı ve tutarlı bir şekilde kolayca gerçekleştirmelerine yardımcı olmaktır, bu da tekniğe hakim olmak için gereken uygulama süresini azaltabilir.

Monogenic disorders make up 80% of rare diseases, which collectively affect 300 million individuals worldwide1,2. There are currently no approved curative therapies for the majority of these greatly debilitating rare disorders1,2,3. However, monogenic disorders are ideal candidates for gene therapies that can replace, supplement, correct, or silence dysfunctional genes4,5. Currently, multiple vectors are being developed and used to deliver gene therapies to specific cell types4,6. One of those vectors is adeno-associated virus (AAV). AAV is a non-pathogenic parvovirus that is increasingly being used as a gene therapy vector7. Compared to other viral vectors, AAV has lower immunogenicity, lower potential to integrate into the host genome, and the ability to efficiently transduce dividing and non-dividing cells in various tissues7,8. Additionally, multiple approaches have been developed to engineer and identify AAVs with desirable characteristics such as specific tissue tropism or further reduced immunogenicity, which greatly enhances AAV&#39;s versatility as a viral vector for different indications9. These factors have made AAV a widely investigated gene therapy vector and led to the development of multiple FDA-approved AAV-based gene therapies10.
Mouse models are commonly used to test potential gene therapies in vivo and better understand the pathomechanisms of monogenic disorders. This is due to the mouse models&#39; recapitulation of the pathologies of different conditions, their genome&#39;s similarity to the human genome, and the relative ease of mouse handling, maintenance, and generation11,12,13. In vivo testing is particularly important when studying disorders that affect multiple systems or regions of the body, such as muscular dystrophies. For these disorders, in vitro testing might not be sufficient to comprehensively assess the safety, efficacy, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of therapeutics intended to reach different body regions after systemic administration14.
Various systemic administration routes can be used to deliver drugs. Each route has its advantages, drawbacks, and degree of compatibility with the animal model and drug being investigated15. Intravenous (IV) lateral tail-vein injection is a commonly used route for systemic delivery of AAV in mice16. Lateral tail-vein injections allow fast and direct administration of the injectate into the mouse bloodstream ensuring high drug bioavailability in systemic circulation17. They also require relatively simple and commonly available tools to be performed. However, mainly due to the small tail vein diameter and difficulty in locating the vein, lateral tail-vein injections are technically challenging and require a high degree of skill and constant practice to avoid failed injection attempts or incomplete dose delivery16,17,18,19. These can result in the loss of expensive reagents or inaccurate results, especially if the incomplete injection is not recognized while performing the injection. Our experience summarized here is based on protocols reported in well-documented articles that we have adapted for our use, optimizing various steps of the lateral tail-vein injection procedure to ensure consistently successful injections20,21,22,23,24,25,26,27.
Here, we describe this detailed optimized lateral tail-vein injection protocol to deliver AAV into unsedated 7-9-week-old mice using simple and commonly available tools. Additionally, we provide the protocols for methods used to assess AAV delivery and biodistribution. These protocols cover post injection tissue collection, tissue fixation, DNA extraction, and digital polymerase chain reaction (dPCR) vector genome per diploid genome (vg/dg) quantification. The IV injection protocol and pointers provided here aim to enhance the ease of successfully performing lateral tail-vein injections. This will potentially help reduce the time needed to master the injection skills while simultaneously improving the accuracy and consistency of injections.

Yazar Spotlight: Kas Distrofileri ve Nöromüsküler Bozukluklar için Gen Terapileri Geliştirme

Yetişkin farelerde lateral kuyruk veni enjeksiyonu yoluyla adeno ilişkili virüsün tutarlı bir şekilde verilmesi

We work on developing gene therapies for congenital and early onset muscular dystrophies and neuromuscular disorders. And to accomplish this, we use different gene therapy modalities to address the underlying genetic causes of those disorders. The continuous development of viral and non-viral gene therapy vectors has been very important to our field.As the new improved viral and non-viral gene therapy vectors allow safer and more efficient gene therapies to be developed, this in turn enhances the safety and reduces the time to get those therapies ready for the patients. In this protocol, we provide thorough and detailed optimized steps of performing mouse lateral tail vein injections, and the aim of this protocol is to assist experimenters in consistently performing the injection procedures successfully.

Yedi ila dokuz haftalık erkek farelere, 150-200 μL enjeksiyon hacminde verilen 1.5 ×10 12 vg / farede lateral kuyruk ven enjeksiyonu yoluyla AAV enjekte edildi. Burada kullanılan ssDNA AAV, CMV promotörü tarafından yönlendirilen Cre rekombinaz transgeni sağladı. Enjekte edilen fareler, Cre muhabiri Ai14 aleli için homozigottu. Cre rekombinaza maruz kaldığında, Ai14 alel içeren hücreler floresan tdTomato proteinini eksprese eder. tdTomato ekspresyonu, Cre'nin neden olduğu genomik rekombinasyondan kaynaklandığından, tdTomato eksprese eden hücreler, ya doğrudan AAV tarafından transdüksiyona uğramış ya da transdüksiyonlu hücrelerin döl hücreleri olan hücreleri gösterir. Burada gösterilen veriler, 160 μL'de (5.8-5.9 × 1013 vg / kg) 1.5 ×12 vg / farede AAV9-CMV-Cre enjekte edilen farelere aittir. Fareler enjeksiyondan 28 gün sonra sakrifiye edildi ve dokular yukarıda tarif edildiği gibi toplandı. Birkaç iskelet kası ve karaciğer lobu sindirildi ve hücreleri FACS kullanılarak toplandı. Birkaç karaciğer lobu, nükleik asit ekstraksiyonu için önceden soğutulmuş metilbütan kullanılarak hemen donduruldu. Birkaç iskelet kası ve karaciğer lobu floresan tdTomato'nun histolojik görüntülemesi için fiks-donduruldu. tdTomato, karaciğer (Şekil 2A) ve kuadriseps (Şekil 2C) boyunca yaygın olarak eksprese edildi, bu da AAV9'un her iki dokunun farklı bölgelerine geniş ölçüde ulaştığını ve transdüksiyon yaptığını gösteriyor.
Taze donmuş karaciğer ve FACS ile sıralanmış hücrelerden ekstrakte edilen DNA, dPCR kullanılarak vg/dg'yi ölçmek için kullanıldı. Vg/dg miktar tayini, analiz edilen numunede enjeksiyon tutarlılığını ve AAV'nin transdüksiyon verimliliğini değerlendirmek için kullanılabilir. Testin geçerliliğini sağlamak için taze donmuş karaciğer dokusu örneğinden ve FACS ile sıralanmış hücrelerden elde edilen 1D damlacık dağılım grafikleri kullanıldı (Şekil 3A, C). Dağılım grafiği, pozitif ve negatif bölümlerin varlığını, algılama eşiğinin doğru bir şekilde belirlenmesini sağlayan pozitif ve negatif bölümler arasında net bir ayrım olduğunu ve pozitif ve negatif bölümler arasında dPCR testinin doğruluğunu azaltabilecek az veya birkaç damlacıkların varlığını gösterdi. Tüm bu kriterlerin karşılanması, dPCR test sonuçlarının geçerli olduğunu gösterdi. Her numunedeki Polr2a gen kopyalarının sayısı, fare diploid genomlarının sayısını belirlemek için ölçüldü (2 Polr2a gen kopyası / fare diploid genomu) ve viral genomu ölçmek için Cre rekombinaz transgen dizisine karşı primerler / prob kullanıldı (1 transgen kopyası / viral genom, Tablo 1). Vg/dg değeri, taze donmuş karaciğer dokusu örneği ve FACS'a göre sıralanmış hücreler için ölçüldü ve her örnekte sırasıyla 187.7 vg/dg ve 4.7 vg/dg varlığını gösterdi (Şekil 3B,D). PBS enjekte edilen farelerden ve nükleik asit içermeyen şablon olmayan kontrollerden alınan numuneler negatif kontroller olarak kullanıldı.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig01.jpg"> Şekil 1: İntravenöz enjeksiyon istasyonuna genel bakış. (A) IV enjeksiyonu gerçekleştirmek için gerekli aletler. Burada gösterilen (1) zamanlayıcı, (2) fare tüpü sınırlayıcı, (3) kesilmemiş ve (4) kesilmiş plastik kısıtlayıcı koniler, (5) alkollü çubuk, (6) fare tüpü tutucuyu yükseltmek için bir platform olarak kullanılan boş pipet uçları kutusu, (7) tek kullanımlık emici pedler, (8) ılık su ile 15 mL konik tüp, (9) 15 mL tüp tutucu, (10) gazlı bez ve (11) insülin şırıngası. (B) Fare önce tüp tutucunun içine yerleştirilir. Ardından, fare yalnızca tüp tutucu tarafından kısıtlanamayacak kadar küçükse, farenin etrafında bir sınırlama manşonu oluşturmak için kesilmiş tutucu koni yerleştirilir. Farenin solunumunun sınırlayıcılar tarafından engellenmediğinden emin olun. Tüp tutucu, fare kuyruğunun ılık suya yerleştirilmesine izin vermek için yükseltilmiş platformun üzerine yerleştirilir. (C) Enjeksiyonu gerçekleştirmeden hemen önce fare kuyruğu konumlandırması ve iğne tutma açısı. Kuyruğu geri çekin, böylece kuyruk gerilir ve enjeksiyon bölgesi tamamen yatay olur. İğne kuyruğa ve damara paraleldir ve eğim yukarı bakmaktadır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig02.jpg"> Şekil 2: IV enjeksiyon sonrası floresan raportör proteinin tespiti. Cre raportörü Ai14 alelini barındıran yedi ila dokuz haftalık erkek farelere, 160 μL (5.8-5.9 × 1013 vg / kg) veya PBS'de verilen 1.5 ×10 12 vg / farede AAV9-CMV-Cre IV enjekte edildi. Cre IV enjeksiyonu yapan AAV9 sonrası fare (A) karaciğer veya (C) kuadriseps bölümlerinin temsili floresan görüntüleri. (B) PBS enjekte edilen farelerden karaciğer veya (D) kuadriseps kesitleri, negatif kontroller olarak hizmet etmek üzere görüntülendi. Dokular IV enjeksiyondan 28 gün sonra toplandı ve sabitlendi. Cre maruziyeti sonrası, floresan tdTomato proteini, transdüksiyona uğrayan hücrelerde ve transdüksiyona uğrayan hücrelerin döl hücrelerinde eksprese edilir. 10 μm kalınlığındaki kesitler 10x büyütmede görüntülendi. Ölçek çubukları = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig03.jpg"> Şekil 3: Diploid genom başına vektör genomu (vg/dg) miktar tayini . AAV9-CMV-Cre veya PBS enjekte edilen farelerden toplanan (A) karaciğer dokusu veya (C) FACS ile sıralanmış hücrelerde dPCR vektör genomlarının kantifikasyonunun 1D dağılım grafiği. Dağılım grafikleri, pozitif ve negatif dPCR bölümlerinin yanı sıra numuneler boyunca yatay çizgi ile gösterilen algılama eşiğini gösterir. (B,D) vg/dg miktar tayini, (B) karaciğer dokusunda veya (D) FACS'ta sıralanmış hücre örneklerinde fare diploid genomlarının ve vektör genomlarının ölçülmesinden sonra. Burada gösterilen sonuçlar, tek bir AAV9 enjekte edilmiş fareden ve her fare için teknik bir dPCR kopyasına sahip tek bir PBS enjekte edilmiş fareden alınmıştır. Hata çubukları, her numune için %95 güven aralığını gösterir. Kısaltmalar: NTC = Şablon olmayan kontrol; dPCR = dijital PCR; FACS = floresanla aktive edilen hücre sıralaması. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Astar</td>
			<td>Sıra</td>
		</tr><tr><td>Cre ileri astar</td>
			<td>CTGACGGTGGGAGAATGTTAAT</td>
		</tr><tr><td>Cre ters astar</td>
			<td>CATCGCTCGACCAGTTTAGTT</td>
		</tr><tr><td>Cre sondası</td>
			<td>/56-FAM/CGCAGGTGT/ZEN/AGAGAAGGCACTTAGC/3IABkFQ/</td>
		</tr><tr><td>Polr2a ileri astar</td>
			<td>GACTCCTTCACTCACTGTCTTC</td>
		</tr><tr><td>Polr2a ters astar</td>
			<td>TCTTGCTAGGCAGTCCATTATC</td>
		</tr><tr><td>Polr2a sondası</td>
			<td>/5HEX/ACGAGATGC/ZEN/TGAAAGAGCCAAGGT/3IABkFQ/</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: vg/dg miktar tayini için kullanılan primer ve prob dizileri. Vektör genomunu ölçmek için Cre primerleri ve prob kullanıldı. Fare diploid genomunu ölçmek için Polr2a primerleri ve probu kullanıldı.

Burada, yetişkin farelerde adeno-ilişkili virüsü (AAV) sistemik olarak uygulamak için fare lateral kuyruk veni enjeksiyonu için optimize edilmiş bir protokolü detaylandırıyoruz. Ek olarak, AAV transdüksiyonunu değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan tahlillerin protokollerini açıklıyoruz.

Many disorders affect multiple organs or involve different regions of the body, so it is critical to deliver therapeutics systemically to target the ...

consistent-delivery-adeno-associated-virus-via-lateral-tail-vein

Research

JoVE Journal

Medicine

Consistent Delivery of Adeno-Associated Virus via Lateral Tail-Vein Injection in Adult Mice

513 Görüntüleme.  National Institutes of Health. Konjenital ve erken başlangıçlı musküler distrofiler ve nöromusküler hastalıklar için gen tedavileri geliştirmek üzerinde çalışıyoruz. Ve bunu başarmak için, bu bozuklukların altında yatan genetik nedenleri ele almak için farklı gen terapisi yöntemleri kullanıyoruz. Viral ve viral olmayan gen tedavisi vektörlerinin sürekli gelişimi alanımız için çok önemli olmuştur.Yeni geliştirilmiş viral ve viral olmayan gen terapisi...