Les auteurs tiennent à remercier le personnel de l’établissement de soins aux animaux du NINDS pour son soutien. Ce travail a été soutenu par la Division de la recherche intra-muros des NIH, NINDS (rapport annuel numéro 1ZIANS003129). Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health.

Thérapies à base d’AAV par injection intraveineuse dans des modèles murins précliniques

<ol>
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A., Feustel, P. J., Lamar, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+use+of+tail+vein+metastasis+assays+and+real-time+in+vivo+imaging+to+quantify+breast+cancer+metastatic+colonization+and+burden+in+the+lungs.">Combined use of tail vein metastasis assays and real-time in vivo imaging to quantify breast cancer metastatic colonization and burden in the lungs.</a> J Vis Exp. (154), 60687 (2019).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lab Animal Research. Compound administration I. , (2023).</li><li>UCSF Office of Research, Institutional Animal Care and Use Program. 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Les auteurs n’ont aucune divulgation pertinente pour le travail publié dans cet article.

Les thérapies à base d’AAV présentent un grand potentiel pour les troubles monogéniques en raison de la polyvalence de l’AAV en tant que vecteur de thérapie génique, ce qui permet de personnaliser les AAV pour répondre aux divers besoins d’administration de différents troubles 4,5,7,9. Les AAV sont couramment administrés par injection IV dans des modèles murins précliniques pour tester l’innocuité et l’efficacité de traitements potentiels16. Étant donné que différentes doses d’AAV injectées peuvent entraîner des différences marquées dans les résultats expérimentaux, il est essentiel que les expérimentateurs soient en mesure d’injecter systématiquement la dose d’AAV prévue pour garantir la validité et la robustesse des données in vivo générées28. Les injections IV sont largement utilisées, mais elles sont techniquement difficiles et nécessitent une formation approfondie et une pratique continue pour développer et maintenir un niveau de compétence qui garantit des injections toujours réussies 16,17,18,19. En plus de l’injection correcte de l’AAV, il est généralement souhaitable d’utiliser des tests pour évaluer la biodistribution de l’AAV injecté et l’efficacité de l’administration dans les tissus ou les cellules cibles29,30.
Ce protocole vise à aider les expérimentateurs à effectuer facilement des injections IV avec succès et de manière cohérente en décrivant en détail les détails d’un protocole d’injection IV optimisé pour administrer l’AAV chez des souris non sédatives âgées de 7 à 9 semaines. Il est important de noter que les souris qui sont nettement plus petites ou plus grandes que les souris de type sauvage dans la tranche d’âge utilisée ici peuvent présenter un plus grand défi en raison d’une visibilité réduite des veines ou d’une incompatibilité avec les dispositifs de retenue utilisés dans cette méthode. Il a déjà été signalé que les injections par voie intraveineuse ne sont pas appropriées pour l’administration de réactifs par voie intraveineuse chez les souris de moins de 6 semaines en raison de la petite taille des vaisseaux31. Bien que possible, il peut être difficile d’injecter régulièrement des souris pesant moins de 22,0 g avec succès. Les chercheurs utilisant des souris de taille atypique peuvent avoir besoin d’adapter la procédure. Ce protocole décrit également plusieurs tests qui peuvent être utilisés pour évaluer la biodistribution et l’efficacité de la transduction des AAV.
Certains points critiques doivent être gardés à l’esprit lors du suivi de ce protocole. Lors de l’injection, les aiguilles de 29 G offrent une plus grande résistance si l’aiguille n’est pas à l’intérieur de la veine. Cela réduit le volume perdu lors d’une injection périvasculaire accidentelle de la solution lors de tentatives d’injection infructueuses. Les seringues à insuline ont des volumes morts plus petits que les seringues ordinaires. Si vous utilisez une seringue et/ou une aiguille différentes de celles énumérées ici, il peut être nécessaire de préparer un volume d’injection supplémentaire aux étapes 1.1.3.3 du protocole pour tenir compte d’un volume d’espace mort plus important (p. ex., ajouter 30 μL à la dose prévue au lieu de 15 μL).
Si de fines bulles d’air provoquées par l’aspiration se forment sur les côtés de la seringue lors de l’aspiration de la dose d’AAV dans la seringue, tirez lentement l’injectat plus haut dans la seringue. Cela éliminera la plupart des petites bulles d’air. Chargez au moins 10 à 15 μL supplémentaires d’AAV au volume prévu à injecter. Ce volume supplémentaire doit tenir compte de tout volume qui pourrait être perdu lors de l’expulsion de bulles d’air ou d’éventuelles tentatives d’injection infructueuses. (p. ex., si le volume cible à injecter est de 150 μL, chargez 165 μL dans la seringue (à mi-chemin entre les marques de 160 μL et de 170 μL sur l’échelle de la seringue). Si l’aiguille est correctement placée à l’intérieur de la veine et que le volume de la seringue est de 165 μL immédiatement avant la tentative d’injection réussie, délivrez le réactif jusqu’à ce qu’il reste 15 μL dans la seringue (à mi-chemin entre les marques de 10 μL et de 20 μL), délivrant ainsi 150 μL (165 μL - 150 μL = 15 μL)). L’alignement de la lumière du biseau (biseau vers le haut) avec l’échelle de la seringue permet de suivre le volume délivré pendant l’injection.
Certains expérimentateurs préféreront peut-être placer la souris sur le côté de manière à ce que l’une de ses veines soit droite et facilement accessible par rapport à une souris sur ses pieds. Cependant, la queue d’une souris sur le côté sera inclinée à des angles différents en fonction de la taille de la souris, ce qui nécessite un ajustement de l’angle d’injection lors de l’injection de souris de différentes tailles. Cela pourrait avoir un impact négatif sur la cohérence du succès de la procédure. Lors des premières tentatives d’entraînement, les expérimentateurs peuvent essayer les deux orientations de contention des souris pour déterminer leur approche préférée. Le fait d’avoir la souris sur ses pieds permet un accès rapide et facile aux deux veines latérales de la queue. Cela réduit le temps de contention lorsque l’accès aux deux veines est nécessaire en cas de tentatives d’injection multiples infructueuses.
Si vous injectez la veine latérale près de la base de la queue (plus près du corps de la souris) (en particulier pour les souris pesant >30 g), ajustez l’angle d’injection de parallèle à la veine à 5°-10° par rapport à la veine, car la veine à la base de la queue est légèrement plus profonde qu’elle ne l’est distalement.
Les protocoles de digestion de la RNase et de contrôle de la contamination par l’ARN énumérés ici ont été vérifiés sur des échantillons d’ADN isolés de tissus hépatiques fraîchement congelés contenant un total de 175 à 700 ng d’acides nucléiques dans 20 μL. Le protocole de digestion de la RNase a également été testé sur des échantillons d’ADN isolés de tissus hépatiques fraîchement congelés et de cellules triées par FACS pour confirmer la présence du génome du vecteur et du génome de la souris après la digestion de la RNase. Les résultats ont été visualisés à l’aide de l’électrophorèse sur gel d’agarose de l’amplification PCR finale des amplicons cibles.
Suivre la méthodologie décrite peut réduire le temps de formation et de pratique nécessaire pour maîtriser les injections IV et entraîner un taux d’injection réussi plus élevé, ce qui permettrait d’économiser des réactifs. Ce protocole utilise des outils simples et couramment utilisés sans avoir besoin d’équipements avancés ou de configurations qui pourraient ne pas être facilement disponibles. De plus, les étapes d’injection IV énumérées ici peuvent être appliquées à une large gamme d’injections qui doivent être administrées par voie intraveineuse, telles que les oligonucléotides antisens (ASOs), avec les modifications appropriées apportées aux étapes de préparation de l’injection en fonction de l’injection.

Les maladies monogéniques représentent 80 % des maladies rares, qui touchent collectivement 300 millions de personnes dans le monde 1,2. Il n’existe actuellement aucun traitement curatif approuvé pour la majorité de ces maladies rares très débilitantes 1,2,3. Cependant, les troubles monogéniques sont des candidats idéaux pour les thérapies géniques qui peuvent remplacer, compléter, corriger ou réduire au silence les gènes dysfonctionnels 4,5. À l’heure actuelle, de multiples vecteurs sont mis au point et utilisés pour administrer des thérapies géniques à des types de cellules spécifiques 4,6. L’un de ces vecteurs est le virus adéno-associé (AAV). L’AAV est un parvovirus non pathogène qui est de plus en plus utilisé comme vecteur de thérapie génique7. Comparé à d’autres vecteurs viraux, l’AAV a une immunogénicité plus faible, un potentiel d’intégration plus faible dans le génome de l’hôte et la capacité de transduire efficacement les cellules en division et non divisées dans divers tissus 7,8. De plus, de multiples approches ont été développées pour concevoir et identifier des AAV présentant des caractéristiques souhaitables telles qu’un tropisme tissulaire spécifique ou une immunogénicité encore réduite, ce qui améliore considérablement la polyvalence des AAV en tant que vecteur viral pour différentes indications9. Ces facteurs ont fait de l’AAV un vecteur de thérapie génique largement étudié et ont conduit au développement de plusieurs thérapies géniques à base d’AAV approuvées par la FDA10.
Les modèles murins sont couramment utilisés pour tester des thérapies géniques potentielles in vivo et mieux comprendre les mécanismes pathologiques des maladies monogéniques. Cela est dû à la récapitulation par les modèles murins des pathologies de différentes conditions, à la similitude de leur génome avec le génome humain et à la facilité relative de manipulation, d’entretien et de génération de souris 11,12,13. Les tests in vivo sont particulièrement importants lorsqu’il s’agit d’étudier des troubles qui affectent plusieurs systèmes ou régions du corps, tels que les dystrophies musculaires. Pour ces troubles, les tests in vitro peuvent ne pas être suffisants pour évaluer de manière exhaustive l’innocuité, l’efficacité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique des traitements destinés à atteindre différentes régions du corps après une administration systémique14.
Diverses voies d’administration systémique peuvent être utilisées pour administrer des médicaments. Chaque voie a ses avantages, ses inconvénients et son degré de compatibilité avec le modèle animal et le médicament étudiés15. L’injection intraveineuse latérale (IV) dans la veine caudale est une voie couramment utilisée pour l’administration systémique d’AAV chez la souris16. Les injections latérales de la veine caudale permettent une administration rapide et directe de l’injectat dans la circulation sanguine de la souris, assurant une biodisponibilité élevée du médicament dans la circulation systémique17. Ils nécessitent également des outils relativement simples et couramment disponibles pour être exécutés. Cependant, principalement en raison du petit diamètre de la veine de la queue et de la difficulté à localiser la veine, les injections latérales de la veine de la queue sont techniquement difficiles et nécessitent un haut degré de compétence et une pratique constante pour éviter les tentatives d’injection ratées ou l’administration incomplète de la dose 16,17,18,19. Ceux-ci peuvent entraîner la perte de réactifs coûteux ou des résultats imprécis, surtout si l’injection incomplète n’est pas reconnue lors de l’injection. Notre expérience résumée ici est basée sur des protocoles rapportés dans des articles bien documentés que nous avons adaptés à notre usage, en optimisant les différentes étapes de la procédure d’injection latérale de la veine caudale pour assurer des injections toujours réussies 20,21,22,23,24,25,26,27.
Ici, nous décrivons ce protocole d’injection latérale optimisé et détaillé de la veine caudale pour administrer de l’AAV à des souris non sédatives âgées de 7 à 9 semaines à l’aide d’outils simples et couramment disponibles. De plus, nous fournissons les protocoles pour les méthodes utilisées pour évaluer l’administration et la biodistribution des AAV. Ces protocoles couvrent la collecte de tissus post-injection, la fixation tissulaire, l’extraction de l’ADN et la quantification du génome du vecteur par génome diploïde (vg/dg) par réaction en chaîne par polymérase numérique (dPCR). Le protocole d’injection IV et les conseils fournis ici visent à améliorer la facilité d’effectuer avec succès des injections latérales de la veine caudale. Cela pourrait aider à réduire le temps nécessaire pour maîtriser les compétences d’injection tout en améliorant simultanément la précision et la cohérence des injections.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGVM33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3 mL insulin syringes with 29G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>324702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL microcentrifuge&#160; tube</td>
			<td>Crystalgen</td>
			<td>23-2051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% EtOH</td>
			<td>The Warner Graham Company</td>
			<td>201096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td>Used to prepare 1x PBS for tissue fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube holder</td>
			<td>Multiple sources</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190 proof ethyl alcohol</td>
			<td>The Warner Graham Company</td>
			<td>6810-01-113-7320</td>
			<td>Used to prepare 70% ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x sterile PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microcentrifuge tissue storage tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022363344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>157-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adeno-associated virus (AAV)</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Single-stranded DNA (ssDNA) AAV was packaged to deliver Cre recombinase as the transgene driven by CMV promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swab</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead lysis tube</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>GREENE5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsuRI (HaeIII) restriction enzyme</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ER0151&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet blender</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BBX24B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ai14-derived mice from JAX 007914 strain (genetic background: C57BL/6J)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Mice containing Ai14 Cre-reporter allele were purchased from JAX (catalog number: 007914)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable absorbent pads</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1420662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T)</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T)</td>
			<td>14085-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA degradation reagent (DNAZap)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-Extraction RNase A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td>For RNA digestion during nucleic acid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase-free RNase for DNA cleanup</td>
			<td>&#160;F. Hoffmann-La Roche</td>
			<td>11119915001</td>
			<td>For RNA digestion after nucleic acid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPCR Probe PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>250102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPCR software&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>N/A&#160;</td>
			<td>QIAcuity Software Suite&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevated platform</td>
			<td>Multiple sources</td>
			<td>N/A</td>
			<td>An empty pipette tips box was used to elevate the mouse restrainer during tail warming up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Multiple sources</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model used here: Nikon Eclipse Ti</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope software&#160;</td>
			<td>Multiple sources&#160;</td>
			<td>N/A&#160;</td>
			<td>Software used here: NIS-Elements&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>9022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Thermomixer 5350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal container</td>
			<td>Vollrath</td>
			<td>80125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylbutane</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>Q223-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular grade water</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-029-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse tube restrainer</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>TV-RED-150-STD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myfuge mini centrifuge</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase chain reaction thermal cycler</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1851148</td>
			<td>Model: C1000 Touch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>7552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAcuity dPCR Nanoplate 26k 24-well</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>250001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAcuity One dPCR system</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>911020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td>Used for DNA extraction from tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen QIAamp DNA Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>56304</td>
			<td>Used for cleanup of genomic DNA, and the isolation of DNA from small volumes of blood prtocotol was used for DNA extraction from FACS-sorted cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent restrainer cone</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>MDC-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>72212663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam box</td>
			<td>Multiple sources</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface cleaner and disinfectant</td>
			<td>Peroxigard</td>
			<td>29101&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Multiple sources</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T)</td>
			<td>91113-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Daigger &#38; Company</td>
			<td>22220A</td>
			<td>Model: Daigger Vortex Genie 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

consistent delivery of adeno-associated virus via lateral tail-vein injection in adult mice

De nombreux troubles affectent plusieurs organes ou impliquent différentes régions du corps, il est donc essentiel d’administrer des traitements de manière systémique pour cibler les cellules affectées situées dans différents sites. L’injection intraveineuse est une voie d’administration systémique largement utilisée dans les études précliniques qui évaluent les traitements destinés à une administration à l’échelle du corps. Chez les souris adultes, il implique l’administration intraveineuse de l’agent thérapeutique dans les veines latérales de la queue de la souris. Lorsqu’elles sont maîtrisées, les injections de la veine caudale sont sûres et rapides, et ne nécessitent que des outils simples et couramment disponibles. Cependant, les injections de la veine caudale sont techniquement difficiles et nécessitent une formation approfondie et une pratique continue pour assurer l’administration précise de la dose prévue.
Nous décrivons ici un protocole d’injection latérale de la veine caudale détaillé et optimisé que nous avons développé sur la base de notre expérience et des recommandations qui avaient déjà été rapportées par d’autres groupes. Outre les dispositifs de contention pour souris et les seringues à insuline, ce protocole ne nécessite que des réactifs et du matériel facilement disponibles dans la plupart des laboratoires. Nous avons constaté que le respect de ce protocole permet une administration intraveineuse réussie et constante du virus adéno-associé (AAV) dans les veines de la queue de souris âgées de 7 à 9 semaines non sédatives. De plus, nous décrivons les protocoles optimisés pour la détection histologique des protéines rapporteures fluorescentes et la quantification du génome du vecteur par génome diploïde (vg/dg) utilisés pour évaluer la transduction et la biodistribution des AAV. L’objectif de ce protocole est d’aider les expérimentateurs à effectuer facilement des injections de la veine caudale avec succès et cohérence, ce qui peut réduire le temps de pratique nécessaire pour maîtriser la technique.

Monogenic disorders make up 80% of rare diseases, which collectively affect 300 million individuals worldwide1,2. There are currently no approved curative therapies for the majority of these greatly debilitating rare disorders1,2,3. However, monogenic disorders are ideal candidates for gene therapies that can replace, supplement, correct, or silence dysfunctional genes4,5. Currently, multiple vectors are being developed and used to deliver gene therapies to specific cell types4,6. One of those vectors is adeno-associated virus (AAV). AAV is a non-pathogenic parvovirus that is increasingly being used as a gene therapy vector7. Compared to other viral vectors, AAV has lower immunogenicity, lower potential to integrate into the host genome, and the ability to efficiently transduce dividing and non-dividing cells in various tissues7,8. Additionally, multiple approaches have been developed to engineer and identify AAVs with desirable characteristics such as specific tissue tropism or further reduced immunogenicity, which greatly enhances AAV&#39;s versatility as a viral vector for different indications9. These factors have made AAV a widely investigated gene therapy vector and led to the development of multiple FDA-approved AAV-based gene therapies10.
Mouse models are commonly used to test potential gene therapies in vivo and better understand the pathomechanisms of monogenic disorders. This is due to the mouse models&#39; recapitulation of the pathologies of different conditions, their genome&#39;s similarity to the human genome, and the relative ease of mouse handling, maintenance, and generation11,12,13. In vivo testing is particularly important when studying disorders that affect multiple systems or regions of the body, such as muscular dystrophies. For these disorders, in vitro testing might not be sufficient to comprehensively assess the safety, efficacy, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of therapeutics intended to reach different body regions after systemic administration14.
Various systemic administration routes can be used to deliver drugs. Each route has its advantages, drawbacks, and degree of compatibility with the animal model and drug being investigated15. Intravenous (IV) lateral tail-vein injection is a commonly used route for systemic delivery of AAV in mice16. Lateral tail-vein injections allow fast and direct administration of the injectate into the mouse bloodstream ensuring high drug bioavailability in systemic circulation17. They also require relatively simple and commonly available tools to be performed. However, mainly due to the small tail vein diameter and difficulty in locating the vein, lateral tail-vein injections are technically challenging and require a high degree of skill and constant practice to avoid failed injection attempts or incomplete dose delivery16,17,18,19. These can result in the loss of expensive reagents or inaccurate results, especially if the incomplete injection is not recognized while performing the injection. Our experience summarized here is based on protocols reported in well-documented articles that we have adapted for our use, optimizing various steps of the lateral tail-vein injection procedure to ensure consistently successful injections20,21,22,23,24,25,26,27.
Here, we describe this detailed optimized lateral tail-vein injection protocol to deliver AAV into unsedated 7-9-week-old mice using simple and commonly available tools. Additionally, we provide the protocols for methods used to assess AAV delivery and biodistribution. These protocols cover post injection tissue collection, tissue fixation, DNA extraction, and digital polymerase chain reaction (dPCR) vector genome per diploid genome (vg/dg) quantification. The IV injection protocol and pointers provided here aim to enhance the ease of successfully performing lateral tail-vein injections. This will potentially help reduce the time needed to master the injection skills while simultaneously improving the accuracy and consistency of injections.

Pleins feux sur l’auteur : Développer des thérapies géniques pour les dystrophies musculaires et les troubles neuromusculaires

Administration constante du virus adéno-associé par injection latérale dans la veine caudale chez des souris adultes

Des souris mâles âgées de sept à neuf semaines ont reçu une injection d’AAV par injection latérale dans la veine de la queue à 1,5 × 1012 vg par souris dans un volume d’injection de 150 à 200 μL. L’AAV ssDNA utilisé ici a délivré le transgène Cre recombinase piloté par le promoteur CMV. Les souris injectées étaient homozygotes pour l’allèle Cre reporter Ai14. Lorsqu’elles sont exposées à la recombinase Cre, les cellules contenant l’allèle Ai14 expriment la protéine fluorescente tdTomato. Étant donné que l’expression de tdTomato est causée par la recombinaison génomique induite par Cre, les cellules exprimant tdTomato indiquent des cellules qui ont été soit directement transduites par l’AAV, soit étaient des cellules de descendance de cellules transduites. Les données présentées ici concernent des souris auxquelles on a injecté de l’AAV9-CMV-Cre à 1,5 × 1012 vg/souris administrées dans 160 μL (5,8-5,9 × 1013 vg/kg). Les souris ont été sacrifiées 28 jours après l’injection, et les tissus ont été prélevés comme décrit ci-dessus. Quelques muscles squelettiques et lobes hépatiques ont été digérés, et leurs cellules ont été collectées à l’aide de FACS. Quelques lobes du foie ont été congelés immédiatement à l’aide de méthylbutane prérefroidi pour l’extraction des acides nucléiques. Quelques muscles squelettiques et lobes hépatiques ont été congelés pour l’imagerie histologique de la tomate td fluorescente. tdTomato a été exprimé de manière diffuse dans le foie (figure 2A) et le quadriceps (figure 2C), ce qui indique que l’AAV9 a largement atteint et transduit différentes régions des deux tissus.
L’ADN extrait de foie fraîchement congelé et de cellules triées par FACS a été utilisé pour quantifier vg/dg à l’aide de la dPCR. La quantification Vg/dg peut être utilisée pour évaluer la cohérence de l’injection et l’efficacité de transduction de l’AAV dans l’échantillon analysé. Les diagrammes de dispersion des gouttelettes 1D de l’échantillon de tissu hépatique fraîchement congelé et des cellules triées par FACS ont été utilisés pour garantir la validité du test (figures 3A, C). Le nuage de points a montré la présence de partitions positives et négatives, une séparation claire entre les partitions positives et négatives qui permet une détermination précise du seuil de détection, et la présence de gouttelettes peu ou pas nombreuses entre les partitions positives et négatives, ce qui peut réduire la précision du test dPCR. Le fait de répondre à tous ces critères indiquait que les résultats de l’essai dPCR étaient valides. Le nombre de copies du gène Polr2a dans chaque échantillon a été quantifié pour déterminer le nombre de génomes diploïdes de souris (2 copies du gène Polr2a/génome diploïde de souris), et des amorces/sondes contre la séquence du transgène de la recombinase Cre ont été utilisées pour quantifier le génome viral (1 copie de transgène/génome viral, tableau 1). La valeur vg/dg a été quantifiée pour l’échantillon de tissu hépatique fraîchement congelé et les cellules triées par FACS et a montré la présence de 187,7 vg/dg et 4,7 vg/dg dans chaque échantillon, respectivement (figures 3B,D). Des échantillons de souris injectées de PBS et de témoins non matriciels ne contenant pas d’acides nucléiques ont été utilisés comme témoins négatifs.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig01.jpg"> Figure 1 : Vue d’ensemble de la station d’injection intraveineuse. (A) Outils nécessaires pour effectuer l’injection IV. On y voit (1) la minuterie, (2) le dispositif de retenue du tube de souris, (3) les cônes de retenue en plastique non coupés et (4) coupés, (5) le tampon d’alcool, (6) la boîte d’embouts de pipette vide utilisée comme plate-forme pour élever le dispositif de retenue du tube de souris, (7) les tampons absorbants jetables, (8) le tube conique de 15 ml avec de l’eau chaude, (9) le porte-tube de 15 ml, (10) la gaze et (11) la seringue à insuline. (B) La souris est d’abord placée à l’intérieur du tube de retenue. Ensuite, le cône de retenue coupé est inséré pour créer un manchon de retenue autour de la souris, si la souris est trop petite pour être retenue par le tube de retenue uniquement. Assurez-vous que la respiration de la souris n’est pas obstruée par les dispositifs de contention. Le tube de retenue est placé sur le dessus de la plate-forme surélevée pour permettre le placement de la queue de souris dans de l’eau chaude. (C) Positionnement de la queue de souris et angle de maintien de l’aiguille immédiatement avant d’effectuer l’injection. Tirez sur la queue pour que la queue soit étirée et que le site d’injection soit complètement horizontal. L’aiguille est parallèle à la queue et à la veine, et le biseau est tourné vers le haut. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig02.jpg"> Figure 2 : Détection de la protéine rapporteure fluorescente après l’injection IV. Des souris mâles âgées de sept à neuf semaines hébergeant l’allèle rapporteur Cre Ai14 ont reçu par voie intraveineuse soit AAV9-CMV-Cre à 1,5 × 1012 vg/souris administrées dans 160 μL (5,8-5,9 × 1013 vg/kg) ou PBS. Images représentatives de fluorescence de coupes du foie (A) ou du quadriceps (C) de souris après l’injection de Cre IV par AAV9. (B) Des coupes du foie ou (D) du quadriceps de souris injectées de PBS ont été imagées pour servir de témoins négatifs. Les tissus ont été prélevés et congelés 28 jours après l’injection IV. Après l’exposition Cre, la protéine tdTomato fluorescente est exprimée dans les cellules transduites et les cellules de descendance des cellules transduites. Des coupes de 10 μm d’épaisseur ont été imagées à un grossissement de 10x. Barres d’échelle = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig03.jpg"> Figure 3 : Quantification du génome du vecteur par génome diploïde (vg/dg). Nuage de points 1D de la quantification des génomes des vecteurs dPCR dans (A) le tissu hépatique ou (C) les cellules triées par FACS prélevées sur des souris injectées avec AAV9-CMV-Cre ou PBS. Les nuages de points montrent les partitions dPCR positives et négatives, ainsi que le seuil de détection indiqué par la ligne horizontale traversant les échantillons. Quantification (B,D) vg/dg après quantification des génomes diploïdes de souris et des génomes de vecteurs dans le tissu hépatique (B) ou (D) des échantillons de cellules triés par FACS. Les résultats présentés ici proviennent d’une seule souris injectée d’AAV9 et d’une seule souris injectée de PBS avec un duplicata technique dPCR pour chaque souris. Les barres d’erreur indiquent l’intervalle de confiance à 95 % pour chaque échantillon. Abréviations : NTC = Non-template control ; dPCR = PCR numérique ; FACS = tri cellulaire activé par fluorescence. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Amorce</td>
			<td>Séquence</td>
		</tr><tr><td>Cre apprêt avant</td>
			<td>CTGACGGTGGGAGAATGTTAAT</td>
		</tr><tr><td>Apprêt inversé Cre</td>
			<td>CATCGCTCGACCAGTTTAGTT</td>
		</tr><tr><td>Sonde Cre </td>
			<td>/56-FAM/CGCAGGTGT/ZEN/AGAGAAGGCACTTAGC/3IABkFQ/</td>
		</tr><tr><td>Apprêt avant Polr2a </td>
			<td>GACTCCTTCACTCACTGTCTTC</td>
		</tr><tr><td>Amorce inversée Polr2a </td>
			<td>TCTTGCTAGGCAGTCCATTATC</td>
		</tr><tr><td>Sonde Polr2a </td>
			<td>/5HEX/ACGAGATGC/ZEN/TGAAAGAGCCAAGGT/3IABkFQ/</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Séquences d’amorces et de sondes utilisées pour la quantification vg/dg. Des amorces et une sonde Cre ont été utilisées pour quantifier le génome du vecteur. Des amorces et une sonde Polr2a ont été utilisées pour quantifier le génome diploïde de la souris.

Nous détaillons ici un protocole optimisé pour l’injection latérale de la veine caudale chez la souris afin d’administrer systématiquement le virus adéno-associé (AAV) chez les souris adultes. De plus, nous décrivons les protocoles des tests couramment utilisés pour évaluer la transduction des AAV.

Many disorders affect multiple organs or involve different regions of the body, so it is critical to deliver therapeutics systemically to target the ...

consistent-delivery-adeno-associated-virus-via-lateral-tail-vein

Research

JoVE Journal

Medicine

Consistent Delivery of Adeno-Associated Virus via Lateral Tail-Vein Injection in Adult Mice

604 vues.  National Institutes of Health. Nous travaillons au développement de thérapies géniques pour les dystrophies musculaires congénitales et précoces et les troubles neuromusculaires. Et pour ce faire, nous utilisons différentes modalités de thérapie génique pour nous attaquer aux causes génétiques sous-jacentes de ces troubles. Le développement continu de vecteurs de thérapie génique viraux et non viraux a été très important dans notre domaine.Comme les nouveaux vecteur...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Développer des thérapies géniques pour les dystrophies musculaires et les troubles neuromusculaires

Many disorders affect multiple organs or involve different regions of the body, so it is critical to deliver therapeutics systemically to target the affected cells located in different sites. Intravenous injection is a widely used systemic delivery route in preclinical studies that assess treatments intended for body-wide administration. In adult mice, it involves the intravenous administration of the therapeutic agent into the mouse&#39;s lateral tail veins. When mastered, tail-vein injections are safe and fast, and only require simple and commonly available tools. However, tail-vein injections are technically challenging and require extensive training and continuous practice to ensure the accurate delivery of the intended dose.
Here we describe a detailed, optimized, lateral tail-vein injection protocol that we have developed based on our experience and on recommendations that had been previously reported by other groups. Other than the mouse restrainers and insulin syringes, this protocol requires only reagents and equipment that are readily available in most labs. We found that following this protocol results in consistently successful intravenous delivery of adeno-associated virus (AAV) into the tail veins of unsedated 7-9 week-old mice. Additionally, we describe the optimized protocols for the histological detection of fluorescent reporter proteins and vector genome per diploid genome (vg/dg) quantification used to assess AAV transduction and biodistribution. The goal of this protocol is to aid experimenters in easily performing tail-vein injections successfully and consistently, which can reduce the practice time needed to master the technique.

Here we detail an optimized protocol for mouse lateral tail-vein injection to systemically administer adeno-associated virus (AAV) in adult mice. Additionally, we describe protocols of commonly used assays to assess AAV transduction.