Gli autori desiderano ringraziare il personale della struttura per la cura degli animali NINDS per il loro supporto. Questo lavoro è stato supportato dalla Divisione di Ricerca Intramurale del NIH, NINDS (Rapporto Annuale Numero 1ZIANS003129). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health.

Terapie basate su AAV tramite iniezione endovenosa in modelli murini preclinici

<ol>
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A., Feustel, P. J., Lamar, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+use+of+tail+vein+metastasis+assays+and+real-time+in+vivo+imaging+to+quantify+breast+cancer+metastatic+colonization+and+burden+in+the+lungs.">Combined use of tail vein metastasis assays and real-time in vivo imaging to quantify breast cancer metastatic colonization and burden in the lungs.</a> J Vis Exp. (154), 60687 (2019).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lab Animal Research. Compound administration I. , (2023).</li><li>UCSF Office of Research, Institutional Animal Care and Use Program. 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Gli autori non hanno alcuna divulgazione rilevante per il lavoro pubblicato in questo articolo.

Le terapie a base di AAV hanno un grande potenziale per le malattie monogeniche grazie alla versatilità dell'AAV come vettore di terapia genica, che consente di personalizzare gli AAV per soddisfare le varie esigenze di somministrazione di diverse malattie 4,5,7,9. Gli AAV sono comunemente somministrati tramite iniezione endovenosa in modelli murini preclinici per testare la sicurezza e l'efficacia di potenziali terapie16. Poiché diverse dosi iniettate di AAV possono comportare marcate differenze nei risultati sperimentali, è fondamentale che gli sperimentatori siano in grado di iniettare costantemente la dose di AAV prevista per garantire la validità e la robustezza dei dati in vivo generati 28. Le iniezioni endovenose sono ampiamente utilizzate, ma sono tecnicamente impegnative e richiedono una formazione approfondita e una pratica continua per sviluppare e mantenere un livello di abilità che garantisca iniezioni costantemente efficaci 16,17,18,19. Oltre a iniettare correttamente l'AAV, di solito si desidera utilizzare saggi per valutare la biodistribuzione dell'AAV iniettato e l'efficienza di consegna ai tessuti o alle cellule bersaglio29,30.
Questo protocollo mira ad aiutare gli sperimentatori a eseguire facilmente iniezioni endovenose con successo e in modo coerente, descrivendo accuratamente i dettagli di un protocollo di iniezione endovenosa ottimizzato per somministrare AAV in topi di 7-9 settimane non sedati. È importante notare che i topi che sono marcatamente più piccoli o più grandi dei topi di tipo selvatico nella fascia di età qui utilizzata possono presentare una sfida maggiore a causa di una ridotta visibilità delle vene o dell'incompatibilità con i sistemi di contenzione utilizzati in questo metodo. È stato precedentemente riportato che le iniezioni endovenose della coda non sono appropriate per la somministrazione di reagenti per via endovenosa in topi di età inferiore alle 6 settimane a causa delle piccole dimensioni del vaso31. Sebbene possibile, potrebbe essere difficile iniettare costantemente topi di peso inferiore a 22,0 g. con successo. Gli investigatori che utilizzano topi di dimensioni atipiche potrebbero dover apportare adattamenti alla procedura. Questo protocollo delinea anche diversi saggi che possono essere utilizzati per valutare la biodistribuzione e l'efficienza di trasduzione dell'AAV.
Alcuni punti critici devono essere tenuti a mente mentre si segue questo protocollo. Durante l'iniezione, gli aghi da 29 G forniscono una maggiore resistenza se l'ago non si trova all'interno della vena. Ciò riduce il volume perso dall'iniezione perivascolare accidentale della soluzione durante i tentativi di iniezione falliti. Le siringhe da insulina hanno volumi morti inferiori rispetto alle siringhe normali. Se si utilizza una siringa e/o un ago diversi da quelli elencati qui, potrebbe essere necessario preparare un volume di iniezione aggiuntivo nelle fasi del protocollo 1.1.3.3 per tenere conto di un volume di spazio morto maggiore (ad esempio, aggiungere 30 μl alla dose prevista invece di 15 μl).
Se durante l'aspirazione della dose di AAV nella siringa si formano bolle d'aria fini causate dall'aspirazione, tirare lentamente l'iniettato più in alto nella siringa. Questo rimuoverà la maggior parte delle piccole bolle d'aria. Caricare almeno altri 10-15 μl di AAV al volume previsto per l'iniezione. Questo volume aggiuntivo serve a tenere conto di qualsiasi volume che potrebbe essere perso durante l'espulsione di bolle d'aria o potenziali tentativi di iniezione falliti. (ad esempio, se il volume target da iniettare è 150 μL, caricare 165 μL nella siringa (a metà strada tra i segni 160 μL e 170 μL sulla scala graduatoria). Se l'ago è posizionato correttamente all'interno della vena e il volume nella siringa è di 165 μL immediatamente prima del tentativo di iniezione riuscito, erogare il reagente fino a quando non rimangono 15 μL nella siringa (a metà strada tra i segni di 10 μL e 20 μL), erogando così 150 μL (165 μL - 150 μL= 15 μL)). L'allineamento del lume smussato (smusso rivolto verso l'alto) con la scala della siringa consente di tracciare il volume erogato durante l'iniezione.
Alcuni sperimentatori potrebbero preferire posizionare il topo su un fianco in modo che una delle sue vene sia dritta e facilmente accessibile rispetto a un topo in piedi. Tuttavia, la coda di un topo su un lato sarà inclinata ad angoli diversi a seconda delle dimensioni del mouse che richiedono una regolazione dell'angolo di iniezione quando si iniettano topi di dimensioni diverse. Ciò potrebbe influire negativamente sulla coerenza del successo della procedura. Durante i tentativi di pratica iniziali, gli sperimentatori possono provare entrambi gli orientamenti di restrizione del mouse per determinare il loro approccio preferito. Avere il mouse sui piedi consente un accesso rapido e facile a entrambe le vene laterali della coda. Ciò riduce il tempo di trattenuta quando è necessario l'accesso a entrambe le vene in caso di più tentativi di iniezione falliti.
Se si inietta la vena laterale vicino alla base della coda (più vicino al corpo del topo) (soprattutto per i topi di peso >30 g), regolare l'angolo di iniezione da parallelo alla vena a 5°-10° rispetto alla vena poiché la vena alla base della coda è leggermente più profonda di quanto non lo sia distalmente.
I protocolli di digestione dell'RNasi e di controllo della contaminazione da RNA qui elencati sono stati verificati su campioni di DNA isolati da tessuti epatici freschi congelati contenenti un totale di 175-700 ng di acidi nucleici in 20 μL. Il protocollo di digestione della RNasi è stato testato anche su campioni di DNA isolati da tessuti epatici freschi congelati e cellule selezionate con FACS per confermare la presenza del genoma del vettore e del genoma del topo dopo la digestione della RNasi. I risultati sono stati visualizzati utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio dell'amplificazione PCR dell'endpoint degli ampliconi bersaglio.
Seguire la metodologia descritta può ridurre il tempo di formazione e pratica necessario per padroneggiare le iniezioni endovenose e portare a una maggiore velocità di iniezione di successo, che farebbe risparmiare reagenti. Questo protocollo utilizza strumenti semplici e di uso comune senza la necessità di attrezzature o configurazioni avanzate che potrebbero non essere prontamente disponibili. Inoltre, le fasi di iniezione endovenosa qui elencate possono essere applicate a un'ampia gamma di iniettati che devono essere somministrati per via endovenosa, come gli oligonucleotidi antisenso (ASO), con le opportune modifiche apportate alle fasi di preparazione dell'iniettato a seconda dell'iniettato.

Le malattie monogeniche costituiscono l'80% delle malattie rare, che colpiscono complessivamente 300 milioni di individui in tutto il mondo 1,2. Attualmente non esistono terapie curative approvate per la maggior parte di queste malattie rare altamente debilitanti 1,2,3. Tuttavia, i disturbi monogenici sono candidati ideali per le terapie geniche che possono sostituire, integrare, correggere o silenziare i geni disfunzionali 4,5. Attualmente, più vettori sono in fase di sviluppo e utilizzati per fornire terapie geniche a specifici tipi di cellule 4,6. Uno di questi vettori è il virus adeno-associato (AAV). L'AAV è un parvovirus non patogeno che viene sempre più utilizzato come vettore di terapia genica7. Rispetto ad altri vettori virali, l'AAV ha una minore immunogenicità, un minore potenziale di integrazione nel genoma dell'ospite e la capacità di trasdurre in modo efficiente le cellule in divisione e non in divisione in vari tessuti 7,8. Inoltre, sono stati sviluppati diversi approcci per ingegnerizzare e identificare AAV con caratteristiche desiderabili come il tropismo tissutale specifico o l'immunogenicità ulteriormente ridotta, il che migliora notevolmente la versatilità dell'AAV come vettore virale per diverse indicazioni9. Questi fattori hanno reso l'AAV un vettore di terapia genica ampiamente studiato e hanno portato allo sviluppo di molteplici terapie geniche basate su AAV approvate dalla FDA10.
I modelli murini sono comunemente usati per testare potenziali terapie geniche in vivo e comprendere meglio i meccanismi patologici delle malattie monogeniche. Ciò è dovuto alla ricapitolazione dei modelli murini delle patologie di diverse condizioni, alla somiglianza del loro genoma con il genoma umano e alla relativa facilità di manipolazione, manutenzione e generazione dei topi 11,12,13. I test in vivo sono particolarmente importanti quando si studiano disturbi che colpiscono più sistemi o regioni del corpo, come le distrofie muscolari. Per questi disturbi, i test in vitro potrebbero non essere sufficienti per valutare in modo completo la sicurezza, l'efficacia, la farmacocinetica e la farmacodinamica delle terapie destinate a raggiungere diverse regioni del corpo dopo la somministrazione sistemica14.
Varie vie di somministrazione sistemica possono essere utilizzate per somministrare farmaci. Ogni percorso ha i suoi vantaggi, svantaggi e grado di compatibilità con il modello animale e il farmaco oggetto di studio15. L'iniezione endovenosa (IV) della vena di coda laterale è una via comunemente usata per la somministrazione sistemica di AAV nei topi16. Le iniezioni laterali della vena caudale consentono la somministrazione rapida e diretta dell'iniettato nel flusso sanguigno del topo, garantendo un'elevata biodisponibilità del farmaco nella circolazione sistemica17. Richiedono anche strumenti relativamente semplici e comunemente disponibili per essere eseguiti. Tuttavia, principalmente a causa del piccolo diametro della vena caudale e della difficoltà di localizzare la vena, le iniezioni laterali della vena caudale sono tecnicamente impegnative e richiedono un alto grado di abilità e pratica costante per evitare tentativi di iniezione falliti o l'erogazione incompleta della dose 16,17,18,19. Questi possono comportare la perdita di reagenti costosi o risultati imprecisi, soprattutto se l'iniezione incompleta non viene riconosciuta durante l'esecuzione dell'iniezione. La nostra esperienza qui riassunta si basa su protocolli riportati in articoli ben documentati che abbiamo adattato per il nostro utilizzo, ottimizzando vari passaggi della procedura di iniezione laterale della vena di coda per garantire iniezioni costantemente di successo 20,21,22,23,24,25,26,27.
Qui, descriviamo questo protocollo dettagliato e ottimizzato di iniezione della vena di coda laterale per somministrare AAV in topi di 7-9 settimane non sedati utilizzando strumenti semplici e comunemente disponibili. Inoltre, forniamo i protocolli per i metodi utilizzati per valutare la somministrazione e la biodistribuzione di AAV. Questi protocolli coprono la raccolta dei tessuti dopo l'iniezione, la fissazione dei tessuti, l'estrazione del DNA e la quantificazione del genoma del vettore della reazione a catena della polimerasi digitale (dPCR) per genoma diploide (vg/dg). Il protocollo di iniezione endovenosa e i suggerimenti forniti qui mirano a migliorare la facilità di esecuzione con successo delle iniezioni laterali della vena di coda. Ciò contribuirà potenzialmente a ridurre il tempo necessario per padroneggiare le abilità di iniezione, migliorando contemporaneamente l'accuratezza e la coerenza delle iniezioni.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGVM33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3 mL insulin syringes with 29G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>324702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL microcentrifuge&#160; tube</td>
			<td>Crystalgen</td>
			<td>23-2051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% EtOH</td>
			<td>The Warner Graham Company</td>
			<td>201096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td>Used to prepare 1x PBS for tissue fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube holder</td>
			<td>Multiple sources</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190 proof ethyl alcohol</td>
			<td>The Warner Graham Company</td>
			<td>6810-01-113-7320</td>
			<td>Used to prepare 70% ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x sterile PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microcentrifuge tissue storage tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022363344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>157-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adeno-associated virus (AAV)</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Single-stranded DNA (ssDNA) AAV was packaged to deliver Cre recombinase as the transgene driven by CMV promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swab</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead lysis tube</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>GREENE5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsuRI (HaeIII) restriction enzyme</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ER0151&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet blender</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BBX24B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ai14-derived mice from JAX 007914 strain (genetic background: C57BL/6J)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Mice containing Ai14 Cre-reporter allele were purchased from JAX (catalog number: 007914)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable absorbent pads</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1420662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T)</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T)</td>
			<td>14085-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA degradation reagent (DNAZap)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-Extraction RNase A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td>For RNA digestion during nucleic acid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase-free RNase for DNA cleanup</td>
			<td>&#160;F. Hoffmann-La Roche</td>
			<td>11119915001</td>
			<td>For RNA digestion after nucleic acid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPCR Probe PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>250102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPCR software&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>N/A&#160;</td>
			<td>QIAcuity Software Suite&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevated platform</td>
			<td>Multiple sources</td>
			<td>N/A</td>
			<td>An empty pipette tips box was used to elevate the mouse restrainer during tail warming up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Multiple sources</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model used here: Nikon Eclipse Ti</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope software&#160;</td>
			<td>Multiple sources&#160;</td>
			<td>N/A&#160;</td>
			<td>Software used here: NIS-Elements&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>9022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Thermomixer 5350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal container</td>
			<td>Vollrath</td>
			<td>80125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylbutane</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>Q223-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular grade water</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-029-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse tube restrainer</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>TV-RED-150-STD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myfuge mini centrifuge</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase chain reaction thermal cycler</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1851148</td>
			<td>Model: C1000 Touch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>7552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAcuity dPCR Nanoplate 26k 24-well</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>250001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAcuity One dPCR system</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>911020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td>Used for DNA extraction from tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen QIAamp DNA Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>56304</td>
			<td>Used for cleanup of genomic DNA, and the isolation of DNA from small volumes of blood prtocotol was used for DNA extraction from FACS-sorted cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent restrainer cone</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>MDC-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>72212663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam box</td>
			<td>Multiple sources</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface cleaner and disinfectant</td>
			<td>Peroxigard</td>
			<td>29101&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Multiple sources</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T)</td>
			<td>91113-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Daigger &#38; Company</td>
			<td>22220A</td>
			<td>Model: Daigger Vortex Genie 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

consistent delivery of adeno-associated virus via lateral tail-vein injection in adult mice

Molti disturbi colpiscono più organi o coinvolgono diverse regioni del corpo, quindi è fondamentale somministrare terapie a livello sistemico per colpire le cellule colpite situate in siti diversi. L'iniezione endovenosa è una via di somministrazione sistemica ampiamente utilizzata negli studi preclinici che valutano i trattamenti destinati alla somministrazione in tutto il corpo. Nei topi adulti, comporta la somministrazione endovenosa dell'agente terapeutico nelle vene laterali della coda del topo. Una volta padroneggiate, le iniezioni della vena caudale sono sicure e veloci e richiedono solo strumenti semplici e comunemente disponibili. Tuttavia, le iniezioni della vena caudale sono tecnicamente impegnative e richiedono una formazione approfondita e una pratica continua per garantire l'erogazione accurata della dose prevista.
Qui descriviamo un protocollo di iniezione della vena di coda laterale dettagliato e ottimizzato che abbiamo sviluppato sulla base della nostra esperienza e delle raccomandazioni precedentemente riportate da altri gruppi. Oltre ai sistemi di contenzione per topi e alle siringhe per insulina, questo protocollo richiede solo reagenti e attrezzature prontamente disponibili nella maggior parte dei laboratori. Abbiamo scoperto che seguendo questo protocollo si ottiene una somministrazione endovenosa costantemente efficace di virus adeno-associato (AAV) nelle vene caudali di topi non sedati di 7-9 settimane. Inoltre, descriviamo i protocolli ottimizzati per la rilevazione istologica delle proteine reporter fluorescenti e la quantificazione del genoma del vettore per genoma diploide (vg/dg) utilizzati per valutare la trasduzione e la biodistribuzione dell'AAV. L'obiettivo di questo protocollo è aiutare gli sperimentatori a eseguire facilmente iniezioni di vena caudale con successo e costanza, il che può ridurre il tempo di pratica necessario per padroneggiare la tecnica.

Monogenic disorders make up 80% of rare diseases, which collectively affect 300 million individuals worldwide1,2. There are currently no approved curative therapies for the majority of these greatly debilitating rare disorders1,2,3. However, monogenic disorders are ideal candidates for gene therapies that can replace, supplement, correct, or silence dysfunctional genes4,5. Currently, multiple vectors are being developed and used to deliver gene therapies to specific cell types4,6. One of those vectors is adeno-associated virus (AAV). AAV is a non-pathogenic parvovirus that is increasingly being used as a gene therapy vector7. Compared to other viral vectors, AAV has lower immunogenicity, lower potential to integrate into the host genome, and the ability to efficiently transduce dividing and non-dividing cells in various tissues7,8. Additionally, multiple approaches have been developed to engineer and identify AAVs with desirable characteristics such as specific tissue tropism or further reduced immunogenicity, which greatly enhances AAV&#39;s versatility as a viral vector for different indications9. These factors have made AAV a widely investigated gene therapy vector and led to the development of multiple FDA-approved AAV-based gene therapies10.
Mouse models are commonly used to test potential gene therapies in vivo and better understand the pathomechanisms of monogenic disorders. This is due to the mouse models&#39; recapitulation of the pathologies of different conditions, their genome&#39;s similarity to the human genome, and the relative ease of mouse handling, maintenance, and generation11,12,13. In vivo testing is particularly important when studying disorders that affect multiple systems or regions of the body, such as muscular dystrophies. For these disorders, in vitro testing might not be sufficient to comprehensively assess the safety, efficacy, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of therapeutics intended to reach different body regions after systemic administration14.
Various systemic administration routes can be used to deliver drugs. Each route has its advantages, drawbacks, and degree of compatibility with the animal model and drug being investigated15. Intravenous (IV) lateral tail-vein injection is a commonly used route for systemic delivery of AAV in mice16. Lateral tail-vein injections allow fast and direct administration of the injectate into the mouse bloodstream ensuring high drug bioavailability in systemic circulation17. They also require relatively simple and commonly available tools to be performed. However, mainly due to the small tail vein diameter and difficulty in locating the vein, lateral tail-vein injections are technically challenging and require a high degree of skill and constant practice to avoid failed injection attempts or incomplete dose delivery16,17,18,19. These can result in the loss of expensive reagents or inaccurate results, especially if the incomplete injection is not recognized while performing the injection. Our experience summarized here is based on protocols reported in well-documented articles that we have adapted for our use, optimizing various steps of the lateral tail-vein injection procedure to ensure consistently successful injections20,21,22,23,24,25,26,27.
Here, we describe this detailed optimized lateral tail-vein injection protocol to deliver AAV into unsedated 7-9-week-old mice using simple and commonly available tools. Additionally, we provide the protocols for methods used to assess AAV delivery and biodistribution. These protocols cover post injection tissue collection, tissue fixation, DNA extraction, and digital polymerase chain reaction (dPCR) vector genome per diploid genome (vg/dg) quantification. The IV injection protocol and pointers provided here aim to enhance the ease of successfully performing lateral tail-vein injections. This will potentially help reduce the time needed to master the injection skills while simultaneously improving the accuracy and consistency of injections.

Autore in primo piano: Sviluppo di terapie geniche per le distrofie muscolari e i disturbi neuromuscolari

Somministrazione costante di virus adeno-associato tramite iniezione laterale della vena di coda in topi adulti

We work on developing gene therapies for congenital and early onset muscular dystrophies and neuromuscular disorders. And to accomplish this, we use different gene therapy modalities to address the underlying genetic causes of those disorders. The continuous development of viral and non-viral gene therapy vectors has been very important to our field.As the new improved viral and non-viral gene therapy vectors allow safer and more efficient gene therapies to be developed, this in turn enhances the safety and reduces the time to get those therapies ready for the patients. In this protocol, we provide thorough and detailed optimized steps of performing mouse lateral tail vein injections, and the aim of this protocol is to assist experimenters in consistently performing the injection procedures successfully.

Topi maschi di età compresa tra sette e nove settimane sono stati iniettati con AAV tramite iniezione laterale della vena di coda a 1,5 × 1012 vg/topo erogati in 150-200 μL di volume iniettato. L'ssDNA AAV utilizzato qui ha fornito il transgene Cre ricombinasi guidato dal promotore del CMV. I topi iniettati erano omozigoti per l'allele Cre reporter Ai14. Quando esposte alla Cre ricombinasi, le cellule contenenti l'allele Ai14 esprimono la proteina fluorescente tdTomato. Poiché l'espressione di tdTomato è causata dalla ricombinazione genomica indotta da Cre, le cellule che esprimono tdTomato indicano cellule che sono state trasdotte direttamente dall'AAV o erano cellule progenie di cellule trasdotte. I dati qui riportati sono di topi iniettati con AAV9-CMV-Cre a 1,5 × 1012 vg/topo somministrati in 160 μl (5,8-5,9 × 1013 vg/kg). I topi sono stati sacrificati 28 giorni dopo l'iniezione e i tessuti sono stati raccolti come descritto sopra. Alcuni muscoli scheletrici e lobi del fegato sono stati digeriti e le loro cellule sono state raccolte utilizzando FACS. Alcuni lobi del fegato sono stati congelati immediatamente utilizzando metilbutano prerefrigerato per l'estrazione dell'acido nucleico. Alcuni muscoli scheletrici e lobi epatici sono stati fissati e congelati per l'imaging istologico del tdTomato fluorescente. tdTomato è stato espresso diffusamente in tutto il fegato (Figura 2A) e nel quadricipite (Figura 2C), indicando che AAV9 ha ampiamente raggiunto e trasdotto diverse regioni di entrambi i tessuti.
Il DNA estratto da fegato fresco congelato e cellule selezionate con FACS è stato utilizzato per quantificare vg/dg utilizzando la dPCR. La quantificazione Vg/dg può essere utilizzata per valutare la consistenza dell'iniezione e l'efficienza di trasduzione di AAV nel campione analizzato. Per garantire la validità del test sono stati utilizzati i grafici a dispersione di gocce 1D dal campione di tessuto epatico fresco congelato e le cellule selezionate da FACS (Figura 3A, C). Il grafico a dispersione ha mostrato la presenza di partizioni positive e negative, una chiara separazione tra le partizioni positive e negative che consente una determinazione accurata della soglia di rilevamento e la presenza di poche goccioline tra le partizioni positive e negative, che possono ridurre l'accuratezza del test dPCR. Il soddisfacimento di tutti questi criteri ha indicato che i risultati del test dPCR erano validi. Il numero di copie del gene Polr2a in ciascun campione è stato quantificato per determinare il numero di genomi diploidi di topo (2 copie del gene Polr2a /genoma diploide di topo) e sono stati utilizzati primer/sonda contro la sequenza del transgene Cre ricombinasi per quantificare il genoma virale (1 copia del transgene/genoma virale, Tabella 1). Il valore vg/dg è stato quantificato per il campione di tessuto epatico fresco congelato e per le cellule selezionate con FACS e ha mostrato la presenza di 187,7 vg/dg e 4,7 vg/dg in ciascun campione, rispettivamente (Figura 3B, D). Come controlli negativi sono stati utilizzati campioni di topi iniettati con PBS e controlli non modello privi di acidi nucleici.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig01.jpg"> Figura 1: Panoramica della stazione di iniezione endovenosa. (A) Strumenti necessari per eseguire l'iniezione endovenosa. Qui sono mostrati (1) il timer, (2) il sistema di ritenuta del tubo del topo, (3) i coni di contenimento in plastica non tagliati e (4) tagliati, (5) il tampone imbevuto di alcol, (6) la scatola vuota dei puntali delle pipette utilizzata come piattaforma per sollevare il sistema di contenimento del tubo del topo, (7) i tamponi assorbenti monouso, (8) la provetta conica da 15 ml con acqua calda, (9) il supporto della provetta da 15 ml, (10) la garza e (11) la siringa da insulina. (B) Il topo viene prima posizionato all'interno del fermatubi. Quindi, il cono di contenimento tagliato viene inserito per creare un manicotto di contenimento attorno al mouse, se il mouse è troppo piccolo per essere trattenuto solo dal fermatore del tubo. Assicurarsi che la respirazione del mouse non sia ostruita dai sistemi di ritenuta. Il sistema di ritenuta del tubo è posizionato sulla parte superiore della piattaforma rialzata per consentire il posizionamento della coda del topo in acqua calda. (C) Posizionamento della coda del mouse e angolo di tenuta dell'ago immediatamente prima di eseguire l'iniezione. Tira indietro la coda in modo che la coda sia tesa e il sito di iniezione sia completamente orizzontale. L'ago è parallelo alla coda e alla vena e lo smusso è rivolto verso l'alto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig02.jpg"> Figura 2: Rilevamento della proteina reporter fluorescente dopo l'iniezione IV. Topi maschi di età compresa tra sette e nove settimane che ospitavano l'allele Cre reporter Ai14 sono stati iniettati per via endovenosa con AAV9-CMV-Cre a 1,5 × 1012 vg/topo somministrati in 160 μl (5,8-5,9 × 10,13 vg/kg) o PBS. Immagini di fluorescenza rappresentative di sezioni di fegato o quadricipite (C) di topo dopo AAV9 che eroga l'iniezione di Cre IV. (B) Le sezioni del fegato o (D) del quadricipite di topi iniettati con PBS sono state sottoposte a imaging per fungere da controlli negativi. I tessuti sono stati raccolti e fissati congelati 28 giorni dopo l'iniezione endovenosa. Dopo l'esposizione a Cre, la proteina fluorescente tdTomato è espressa nelle cellule trasdotte e nelle cellule progenie delle cellule trasdotte. Le sezioni spesse 10 μm sono state riprodotte con un ingrandimento 10x. Barre di scala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig03.jpg"> Figura 3: Quantificazione del genoma vettoriale per genoma diploide (vg/dg). Grafico a dispersione 1D della quantificazione dei genomi dei vettori dPCR in (A) tessuto epatico o (C) cellule selezionate FACS raccolte da topi iniettati con AAV9-CMV-Cre o PBS. I grafici a dispersione mostrano le partizioni dPCR positive e negative, nonché la soglia di rilevamento indicata dalla linea orizzontale che attraversa i campioni. Quantificazione (B,D) vg/dg dopo aver quantificato i genomi diploidi di topo e i genomi vettori in (B) tessuto epatico o (D) campioni di cellule selezionate FACS. I risultati mostrati qui provengono da un singolo topo iniettato con AAV9 e da un singolo topo iniettato con PBS con un duplicato tecnico di dPCR per ciascun topo. Le barre di errore indicano l'intervallo di confidenza del 95% per ogni campione. Abbreviazioni: NTC= Controllo non modello; dPCR = PCR digitale; FACS = smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Abbecedario</td>
			<td>Sequenza</td>
		</tr><tr><td>Primer Cre forward</td>
			<td>CTGACGGTGGGAATGTTAAT</td>
		</tr><tr><td>Primer inverso Cre</td>
			<td>CATCGCTCGACCAGTTTAGTT</td>
		</tr><tr><td>Sonda Cre </td>
			<td>/56-FAM/CGCAGGTGT/ZEN/AGAGAAGGCACTTAGC/3IABkFQ/</td>
		</tr><tr><td>Primer in avanti Polr2a </td>
			<td>GACTCCTTCACTCACTGTCTTC</td>
		</tr><tr><td>Primer inverso Polr2a </td>
			<td>TCTTGCTAGGCAGTCCATTATC</td>
		</tr><tr><td>Sonda Polr2a </td>
			<td>/5HEX/ACGAGATGC/ZEN/TGAAAGAGCCAAGGT/3IABkFQ/</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Sequenze di primer e sonde utilizzate per la quantificazione vg/dg. I primer e la sonda Cre sono stati utilizzati per quantificare il genoma del vettore. I primer e la sonda Polr2a sono stati utilizzati per quantificare il genoma diploide del topo.

Qui descriviamo in dettaglio un protocollo ottimizzato per l'iniezione laterale della vena di coda nel topo per somministrare sistemicamente il virus adeno-associato (AAV) nei topi adulti. Inoltre, descriviamo i protocolli dei saggi comunemente usati per valutare la trasduzione di AAV.

Many disorders affect multiple organs or involve different regions of the body, so it is critical to deliver therapeutics systemically to target the ...

consistent-delivery-adeno-associated-virus-via-lateral-tail-vein

Research

JoVE Journal

Medicine

Consistent Delivery of Adeno-Associated Virus via Lateral Tail-Vein Injection in Adult Mice

503 Views.  National Institutes of Health. Lavoriamo allo sviluppo di terapie geniche per le distrofie muscolari congenite e ad esordio precoce e le malattie neuromuscolari. E per raggiungere questo obiettivo, utilizziamo diverse modalità di terapia genica per affrontare le cause genetiche alla base di tali disturbi. Il continuo sviluppo di vettori di terapia genica virali e non virali è stato molto importante per il nostro settore.Poiché i nuovi vettori di terapia genica virali e non virali...