Os autores gostariam de agradecer à equipe da unidade de cuidados com animais do NINDS por seu apoio. Este trabalho foi apoiado pela Divisão de Pesquisa Intramural do NIH, NINDS (Relatório Anual Número 1ZIANS003129). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

Terapias baseadas em AAV via injeção intravenosa em modelos pré-clínicos de camundongos

<ol>
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Os autores não têm divulgações que sejam relevantes para o trabalho publicado neste artigo.

As terapias baseadas em AAV têm grande potencial para distúrbios monogênicos devido à versatilidade do AAV como vetor de terapia gênica, o que torna possível personalizar os AAVs para atender às várias necessidades de entrega de diferentes distúrbios 4,5,7,9. Os AAVs são comumente administrados por injeção intravenosa em modelos de camundongos pré-clínicos para testar a segurança e a eficácia de possíveis terapias16. Como diferentes doses de AAV injetadas podem resultar em diferenças marcantes nos resultados experimentais, é fundamental que os experimentadores sejam capazes de injetar consistentemente a dose de AAV pretendida para garantir a validade e robustez dos dados in vivo gerados28. As injeções intravenosas são amplamente utilizadas, mas são tecnicamente desafiadoras, exigindo treinamento extensivo e prática contínua para desenvolver e manter um nível de habilidade que garanta injeções consistentemente bem-sucedidas 16,17,18,19. Além de injetar corretamente o AAV, geralmente é desejado usar ensaios para avaliar a biodistribuição do AAV injetado e a eficiência de entrega aos tecidos ou células-alvo29,30.
Este protocolo visa ajudar os experimentadores a realizar facilmente injeções IV com sucesso e consistência, descrevendo minuciosamente os detalhes de um protocolo de injeção IV otimizado para administrar AAV em camundongos não sedados de 7 a 9 semanas de idade. É importante notar que camundongos marcadamente menores ou maiores do que camundongos selvagens na faixa etária usada aqui podem apresentar um desafio maior devido a uma visibilidade reduzida das veias ou incompatibilidade com os contentores usados neste método. Foi relatado anteriormente que as injeções intravenosas de cauda não são apropriadas para administrar reagentes por via intravenosa em camundongos com menos de 6 semanas de idade devido ao pequeno tamanho do vaso31. Embora possível, pode ser difícil injetar consistentemente camundongos com peso inferior a 22,0 g. com sucesso. Os investigadores que usam camundongos de tamanho atípico podem precisar fazer adaptações no procedimento. Este protocolo também descreve vários ensaios que podem ser usados para avaliar a biodistribuição e a eficiência de transdução do AAV.
Alguns pontos críticos precisam ser lembrados ao seguir este protocolo. Durante a injeção, as agulhas 29 G proporcionam maior resistência se a agulha não estiver dentro da veia. Isso reduz o volume perdido pela injeção perivascular acidental da solução durante tentativas de injeção malsucedidas. As seringas de insulina têm volumes mortos menores do que as seringas comuns. Se estiver usando uma seringa e/ou agulha diferente das listadas aqui, pode ser necessário preparar um volume injetado adicional nas etapas 1.1.3.3 do protocolo para levar em conta um volume maior de espaço morto (por exemplo, adicionar 30 μL à dose pretendida em vez de 15 μL).
Se forem formadas bolhas de ar finas causadas por aspiração nas laterais da seringa durante a aspiração da dose de AAV para a seringa, puxe lentamente o injetado para cima na seringa. Isso removerá a maioria das pequenas bolhas de ar. Carregue pelo menos 10-15 μL adicionais de AAV no volume pretendido a ser injetado. Este volume adicional é para contabilizar qualquer volume que possa ser perdido durante a expulsão de bolhas de ar ou possíveis tentativas de injeção malsucedidas. (por exemplo, se o volume alvo a ser injetado for de 150 μL, carregue 165 μL na seringa (a meio caminho entre as marcas de 160 μL e 170 μL na escala da seringa). Se a agulha for colocada corretamente dentro da veia e o volume na seringa estiver em 165 μL imediatamente antes da tentativa de injeção bem-sucedida, administre o reagente até que restem 15 μL na seringa (a meio caminho entre as marcas de 10 μL e 20 μL), fornecendo assim 150 μL (165 μL - 150 μL = 15 μL)). O alinhamento do lúmen chanfrado (chanfro voltado para cima) com a escala da seringa permite rastrear o volume fornecido durante a injeção.
Alguns experimentadores podem preferir colocar o mouse de lado para que uma de suas veias fique reta e facilmente acessível em comparação com um mouse em pé. No entanto, a cauda de um rato de lado será inclinada em ângulos diferentes, dependendo do tamanho do rato, exigindo um ajuste do ângulo de injeção ao injetar ratos de tamanhos diferentes. Isso pode afetar negativamente a consistência do sucesso do procedimento. Durante as tentativas iniciais de prática, os experimentadores podem tentar ambas as orientações de restrição do mouse para determinar sua abordagem preferida. Ter o mouse nos pés permite acesso rápido e fácil a ambas as veias laterais da cauda. Isso reduz o tempo de restrição quando o acesso a ambas as veias é necessário no caso de várias tentativas de injeção malsucedidas.
Se injetar a veia lateral perto da base da cauda (mais perto do corpo do camundongo) (especialmente para camundongos pesando >30 g.), ajuste o ângulo de injeção de paralelo à veia para 5 ° -10 ° para a veia, pois a veia na base da cauda é ligeiramente mais profunda do que distalmente.
Os protocolos de digestão de RNase e verificação de contaminação por RNA listados aqui foram verificados em amostras de DNA isoladas de tecidos hepáticos frescos congelados contendo um total de 175-700 ng de ácidos nucléicos em 20 μL. O protocolo de digestão de RNase também foi testado em amostras de DNA isoladas de tecidos hepáticos recém-congelados e células classificadas por FACS para confirmar a presença do genoma do vetor e do genoma do camundongo após a digestão da RNase. Os resultados foram visualizados usando eletroforese em gel de agarose da amplificação por PCR dos amplicons alvo.
Seguir a metodologia descrita pode reduzir o tempo de treinamento e prática necessário para dominar as injeções IV e resultar em uma maior taxa de injeção bem-sucedida, o que economizaria reagentes. Este protocolo utiliza ferramentas simples e comumente usadas sem a necessidade de equipamentos ou configurações avançadas que podem não estar prontamente disponíveis. Além disso, as etapas de injeção IV listadas aqui podem ser aplicadas a uma ampla gama de injetados que precisam ser administrados por via intravenosa, como oligonucleotídeos antisense (ASOs), com as modificações apropriadas feitas nas etapas de preparação do injetado, dependendo do injetado.

As doenças monogênicas representam 80% das doenças raras, que afetam coletivamente 300 milhões de indivíduos em todo o mundo 1,2. Atualmente, não há terapias curativas aprovadas para a maioria dessas doenças raras altamente debilitantes 1,2,3. No entanto, os distúrbios monogênicos são candidatos ideais para terapias gênicas que podem substituir, suplementar, corrigir ou silenciar genes disfuncionais 4,5. Atualmente, vários vetores estão sendo desenvolvidos e usados para fornecer terapias gênicas a tipos específicosde células 4,6. Um desses vetores é o vírus adeno-associado (AAV). O AAV é um parvovírus não patogênico que está sendo cada vez mais usado como vetor de terapia gênica7. Em comparação com outros vetores virais, o AAV tem menor imunogenicidade, menor potencial de integração ao genoma do hospedeiro e capacidade de transduzir eficientemente células em divisão e não divisão em vários tecidos 7,8. Além disso, várias abordagens foram desenvolvidas para projetar e identificar AAVs com características desejáveis, como tropismo tecidual específico ou imunogenicidade ainda mais reduzida, o que aumenta muito a versatilidade do AAV como vetor viral para diferentes indicações9. Esses fatores tornaram o AAV um vetor de terapia gênica amplamente investigado e levaram ao desenvolvimento de várias terapias genéticas baseadas em AAV aprovadas pela FDA10.
Modelos de camundongos são comumente usados para testar possíveis terapias genéticas in vivo e entender melhor os mecanismos patológicos de distúrbios monogênicos. Isso se deve à recapitulação dos modelos de camundongos das patologias de diferentes condições, à semelhança de seu genoma com o genoma humano e à relativa facilidade de manuseio, manutenção e geração de camundongos 11,12,13. O teste in vivo é particularmente importante ao estudar distúrbios que afetam vários sistemas ou regiões do corpo, como distrofias musculares. Para esses distúrbios, os testes in vitro podem não ser suficientes para avaliar de forma abrangente a segurança, eficácia, farmacocinética e farmacodinâmica da terapêutica destinada a atingir diferentes regiões do corpo após administração sistêmica14.
Várias vias de administração sistêmica podem ser usadas para administrar medicamentos. Cada via tem suas vantagens, desvantagens e grau de compatibilidade com o modelo animal e o medicamento investigado15. A injeção intravenosa (IV) da veia da cauda lateral é uma via comumente usada para a administração sistêmica de AAV em camundongos16. As injeções laterais nas veias da cauda permitem a administração rápida e direta do injetado na corrente sanguínea do camundongo, garantindo alta biodisponibilidade do medicamento na circulação sistêmica17. Eles também exigem ferramentas relativamente simples e comumente disponíveis para serem executadas. No entanto, principalmente devido ao pequeno diâmetro da veia da cauda e à dificuldade de localização da veia, as injeções laterais da veia da cauda são tecnicamente desafiadoras e requerem um alto grau de habilidade e prática constante para evitar tentativas fracassadas de injeção ou administração incompleta da dose 16,17,18,19. Isso pode resultar na perda de reagentes caros ou resultados imprecisos, especialmente se a injeção incompleta não for reconhecida durante a injeção. Nossa experiência resumida aqui é baseada em protocolos relatados em artigos bem documentados que adaptamos para nosso uso, otimizando várias etapas do procedimento de injeção da veia da cauda lateral para garantir injeções consistentemente bem-sucedidas 20,21,22,23,24,25,26,27.
Aqui, descrevemos este protocolo detalhado de injeção de veia da cauda lateral otimizado para administrar AAV em camundongos não sedados de 7 a 9 semanas usando ferramentas simples e comumente disponíveis. Além disso, fornecemos os protocolos para métodos usados para avaliar a entrega e a biodistribuição de AAV. Esses protocolos abrangem coleta de tecido pós-injeção, fixação de tecido, extração de DNA e genoma vetorial de reação em cadeia da polimerase digital (dPCR) por quantificação do genoma diplóide (vg/dg). O protocolo de injeção IV e as dicas fornecidas aqui visam aumentar a facilidade de realizar com sucesso injeções laterais na veia da cauda. Isso ajudará potencialmente a reduzir o tempo necessário para dominar as habilidades de injeção e, ao mesmo tempo, melhorar a precisão e a consistência das injeções.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGVM33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3 mL insulin syringes with 29G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>324702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL microcentrifuge&#160; tube</td>
			<td>Crystalgen</td>
			<td>23-2051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% EtOH</td>
			<td>The Warner Graham Company</td>
			<td>201096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td>Used to prepare 1x PBS for tissue fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube holder</td>
			<td>Multiple sources</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190 proof ethyl alcohol</td>
			<td>The Warner Graham Company</td>
			<td>6810-01-113-7320</td>
			<td>Used to prepare 70% ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x sterile PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microcentrifuge tissue storage tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022363344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>157-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adeno-associated virus (AAV)</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Single-stranded DNA (ssDNA) AAV was packaged to deliver Cre recombinase as the transgene driven by CMV promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swab</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead lysis tube</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>GREENE5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsuRI (HaeIII) restriction enzyme</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ER0151&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet blender</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BBX24B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ai14-derived mice from JAX 007914 strain (genetic background: C57BL/6J)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Mice containing Ai14 Cre-reporter allele were purchased from JAX (catalog number: 007914)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable absorbent pads</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1420662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T)</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T)</td>
			<td>14085-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA degradation reagent (DNAZap)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-Extraction RNase A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td>For RNA digestion during nucleic acid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase-free RNase for DNA cleanup</td>
			<td>&#160;F. Hoffmann-La Roche</td>
			<td>11119915001</td>
			<td>For RNA digestion after nucleic acid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPCR Probe PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>250102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPCR software&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>N/A&#160;</td>
			<td>QIAcuity Software Suite&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevated platform</td>
			<td>Multiple sources</td>
			<td>N/A</td>
			<td>An empty pipette tips box was used to elevate the mouse restrainer during tail warming up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Multiple sources</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model used here: Nikon Eclipse Ti</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope software&#160;</td>
			<td>Multiple sources&#160;</td>
			<td>N/A&#160;</td>
			<td>Software used here: NIS-Elements&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>9022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Thermomixer 5350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal container</td>
			<td>Vollrath</td>
			<td>80125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylbutane</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>Q223-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular grade water</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-029-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse tube restrainer</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>TV-RED-150-STD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myfuge mini centrifuge</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase chain reaction thermal cycler</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1851148</td>
			<td>Model: C1000 Touch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>7552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAcuity dPCR Nanoplate 26k 24-well</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>250001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAcuity One dPCR system</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>911020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td>Used for DNA extraction from tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen QIAamp DNA Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>56304</td>
			<td>Used for cleanup of genomic DNA, and the isolation of DNA from small volumes of blood prtocotol was used for DNA extraction from FACS-sorted cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent restrainer cone</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>MDC-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>72212663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam box</td>
			<td>Multiple sources</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface cleaner and disinfectant</td>
			<td>Peroxigard</td>
			<td>29101&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Multiple sources</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T)</td>
			<td>91113-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Daigger &#38; Company</td>
			<td>22220A</td>
			<td>Model: Daigger Vortex Genie 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

consistent delivery of adeno-associated virus via lateral tail-vein injection in adult mice

Muitos distúrbios afetam vários órgãos ou envolvem diferentes regiões do corpo, por isso é fundamental fornecer terapêutica sistemicamente para atingir as células afetadas localizadas em diferentes locais. A injeção intravenosa é uma via de administração sistêmica amplamente utilizada em estudos pré-clínicos que avaliam tratamentos destinados à administração em todo o corpo. Em camundongos adultos, envolve a administração intravenosa do agente terapêutico nas veias laterais da cauda do camundongo. Quando dominadas, as injeções nas veias da cauda são seguras e rápidas e requerem apenas ferramentas simples e comumente disponíveis. No entanto, as injeções nas veias da cauda são tecnicamente desafiadoras e exigem treinamento extensivo e prática contínua para garantir a entrega precisa da dose pretendida.
Aqui descrevemos um protocolo detalhado, otimizado, de injeção de veia da cauda lateral que desenvolvemos com base em nossa experiência e em recomendações que haviam sido relatadas anteriormente por outros grupos. Além dos aparelhos de retenção de camundongos e seringas de insulina, este protocolo requer apenas reagentes e equipamentos que estão prontamente disponíveis na maioria dos laboratórios. Descobrimos que seguir este protocolo resulta em uma entrega intravenosa consistentemente bem-sucedida de vírus adeno-associado (AAV) nas veias da cauda de camundongos de 7 a 9 semanas de idade não sedados. Além disso, descrevemos os protocolos otimizados para a detecção histológica de proteínas repórter fluorescentes e quantificação do genoma vetorial por genoma diplóide (vg / dg) usados para avaliar a transdução e biodistribuição de AAV. O objetivo deste protocolo é ajudar os experimentadores a realizar facilmente injeções nas veias da cauda com sucesso e consistência, o que pode reduzir o tempo de prática necessário para dominar a técnica.

Monogenic disorders make up 80% of rare diseases, which collectively affect 300 million individuals worldwide1,2. There are currently no approved curative therapies for the majority of these greatly debilitating rare disorders1,2,3. However, monogenic disorders are ideal candidates for gene therapies that can replace, supplement, correct, or silence dysfunctional genes4,5. Currently, multiple vectors are being developed and used to deliver gene therapies to specific cell types4,6. One of those vectors is adeno-associated virus (AAV). AAV is a non-pathogenic parvovirus that is increasingly being used as a gene therapy vector7. Compared to other viral vectors, AAV has lower immunogenicity, lower potential to integrate into the host genome, and the ability to efficiently transduce dividing and non-dividing cells in various tissues7,8. Additionally, multiple approaches have been developed to engineer and identify AAVs with desirable characteristics such as specific tissue tropism or further reduced immunogenicity, which greatly enhances AAV&#39;s versatility as a viral vector for different indications9. These factors have made AAV a widely investigated gene therapy vector and led to the development of multiple FDA-approved AAV-based gene therapies10.
Mouse models are commonly used to test potential gene therapies in vivo and better understand the pathomechanisms of monogenic disorders. This is due to the mouse models&#39; recapitulation of the pathologies of different conditions, their genome&#39;s similarity to the human genome, and the relative ease of mouse handling, maintenance, and generation11,12,13. In vivo testing is particularly important when studying disorders that affect multiple systems or regions of the body, such as muscular dystrophies. For these disorders, in vitro testing might not be sufficient to comprehensively assess the safety, efficacy, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of therapeutics intended to reach different body regions after systemic administration14.
Various systemic administration routes can be used to deliver drugs. Each route has its advantages, drawbacks, and degree of compatibility with the animal model and drug being investigated15. Intravenous (IV) lateral tail-vein injection is a commonly used route for systemic delivery of AAV in mice16. Lateral tail-vein injections allow fast and direct administration of the injectate into the mouse bloodstream ensuring high drug bioavailability in systemic circulation17. They also require relatively simple and commonly available tools to be performed. However, mainly due to the small tail vein diameter and difficulty in locating the vein, lateral tail-vein injections are technically challenging and require a high degree of skill and constant practice to avoid failed injection attempts or incomplete dose delivery16,17,18,19. These can result in the loss of expensive reagents or inaccurate results, especially if the incomplete injection is not recognized while performing the injection. Our experience summarized here is based on protocols reported in well-documented articles that we have adapted for our use, optimizing various steps of the lateral tail-vein injection procedure to ensure consistently successful injections20,21,22,23,24,25,26,27.
Here, we describe this detailed optimized lateral tail-vein injection protocol to deliver AAV into unsedated 7-9-week-old mice using simple and commonly available tools. Additionally, we provide the protocols for methods used to assess AAV delivery and biodistribution. These protocols cover post injection tissue collection, tissue fixation, DNA extraction, and digital polymerase chain reaction (dPCR) vector genome per diploid genome (vg/dg) quantification. The IV injection protocol and pointers provided here aim to enhance the ease of successfully performing lateral tail-vein injections. This will potentially help reduce the time needed to master the injection skills while simultaneously improving the accuracy and consistency of injections.

Autor em destaque: Desenvolvimento de terapias genéticas para distrofias musculares e distúrbios neuromusculares

Entrega consistente de vírus adeno-associado por injeção lateral na veia da cauda em camundongos adultos

Camundongos machos de sete a nove semanas de idade foram injetados com AAV por meio de injeção lateral na veia da cauda a 1,5 × 1012 vg / camundongo administrados em 150-200 μL de volume injetado. O ssDNA AAV usado aqui entregou o transgene Cre recombinase impulsionado pelo promotor do CMV. Os camundongos injetados eram homozigotos para o alelo Cre reporter Ai14. Quando expostas à Cre recombinase, as células contendo o alelo Ai14 expressam a proteína fluorescente tdTomato. Como a expressão de tdTomato é causada pela recombinação genômica induzida por Cre, as células que expressam tdTomato indicam células que foram transduzidas diretamente pelo AAV ou eram células de progênie de células transduzidas. Os dados mostrados aqui são de camundongos injetados com AAV9-CMV-Cre a 1,5 × 1012 vg / camundongo administrados em 160 μL (5,8-5,9 × 1013 vg / kg). Os camundongos foram sacrificados 28 dias após a injeção e os tecidos foram coletados conforme descrito acima. Alguns músculos esqueléticos e lobos hepáticos foram digeridos e suas células foram coletadas usando FACS. Alguns lobos do fígado foram congelados imediatamente usando metilbutano pré-resfriado para extração de ácido nucleico. Alguns músculos esqueléticos e lobos hepáticos foram congelados fixos para imagens histológicas de tdTomato fluorescente. O tdTomato foi expresso difusamente em todo o fígado (Figura 2A) e quadríceps (Figura 2C), indicando que o AAV9 atingiu e transduziu amplamente diferentes regiões de ambos os tecidos.
O DNA extraído do fígado fresco congelado e das células classificadas por FACS foi usado para quantificar vg/dg usando dPCR. A quantificação Vg/dg pode ser usada para avaliar a consistência da injeção e a eficiência de transdução do AAV na amostra analisada. Os gráficos de dispersão de gotículas 1D da amostra de tecido hepático recém-congelado e das células classificadas por FACS foram usados para garantir a validade do ensaio ( Figura 3A , C ). O gráfico de dispersão mostrou a presença de partições positivas e negativas, separação clara entre as partições positiva e negativa que permite a determinação precisa do limiar de detecção e a presença de gotículas entre as partições positivas e negativas, o que pode reduzir a precisão do ensaio de dPCR. O cumprimento de todos esses critérios indicou que os resultados do ensaio de dPCR eram válidos. O número de cópias do gene Polr2a em cada amostra foi quantificado para determinar o número de genomas diplóides de camundongo (2 cópias do gene Polr2a/genoma diplóide de camundongo), e primers/sonda contra a sequência do transgene Cre recombinase foram usados para quantificar o genoma viral (1 cópia do transgene/genoma viral, Tabela 1). O valor vg/dg foi quantificado para a amostra de tecido hepático fresco congelado e células classificadas por FACS e mostrou a presença de 187,7 vg/dg e 4,7 vg/dg em cada amostra, respectivamente (Figura 3B,D). Amostras de camundongos injetados com PBS e controles não molde sem ácidos nucléicos foram usados como controles negativos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig01.jpg"> Figura 1: Visão geral da estação de injeção intravenosa. (A) Ferramentas necessárias para realizar a injeção intravenosa. Aqui é mostrado o (1) temporizador, (2) limitador de tubo de mouse, (3) cones de retenção de plástico não cortados e (4) cortados, (5) cotonete com álcool, (6) caixa de pontas de pipeta vazia usada como plataforma para elevar o limitador de tubo de mouse, (7) almofadas absorventes descartáveis, (8) tubo cônico de 15 mL com água morna, (9) suporte de tubo de 15 mL, (10) gaze e (11) seringa de insulina. (B) O mouse é colocado primeiro dentro do limitador do tubo. Em seguida, o cone de retenção cortado é inserido para criar uma luva de retenção ao redor do mouse, se o mouse for muito pequeno para ser restringido apenas pelo limitador de tubo. Certifique-se de que a respiração do mouse não seja obstruída pelos sistemas de contenção. O limitador de tubos é colocado no topo da plataforma elevada para permitir a colocação da cauda do rato em água morna. (C) Posicionamento da cauda do rato e ângulo de retenção da agulha imediatamente antes de realizar a injeção. Puxe a cauda para trás para que a cauda fique esticada e o local da injeção fique completamente horizontal. A agulha é paralela à cauda e à veia, e o chanfro está voltado para cima. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig02.jpg"> Figura 2: Detecção de proteína repórter fluorescente após injeção IV. Camundongos machos de sete a nove semanas de idade com o alelo Cre repórter Ai14 foram injetados por via intravenosa com AAV9-CMV-Cre a 1,5 × 1012 vg/camundongo entregues em 160 μL (5,8-5,9 × 1013 vg/kg) ou PBS. Imagens de fluorescência representativas de seções de fígado de camundongo (A) ou quadríceps (C) após AAV9 administrando injeção de Cre IV. (B) Seções de fígado ou (D) quadríceps de camundongos injetados com PBS foram fotografadas para servir como controles negativos. Os tecidos foram coletados e fixados em congelamento 28 dias após a injeção intravenosa. Pós-exposição a Cre, a proteína fluorescente tdTomato é expressa em células transduzidas e células de progênie de células transduzidas. Seções de 10 μm de espessura foram fotografadas com ampliação de 10x. Barras de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig03.jpg"> Figura 3: Quantificação do genoma vetorial por genoma diplóide (vg/dg). Gráfico de dispersão 1D da quantificação de genomas vetoriais de dPCR em (A) tecido hepático ou (C) células classificadas por FACS coletadas de camundongos injetados com AAV9-CMV-Cre ou PBS. Os gráficos de dispersão mostram as partições de dPCR positivas e negativas, bem como o limite de detecção indicado pela linha horizontal entre as amostras. (B,D) quantificação de vg/dg após quantificar os genomas diplóides de camundongo e genomas vetoriais no (B) tecido hepático ou (D) amostras de células classificadas por FACS. Os resultados mostrados aqui são de um único camundongo injetado com AAV9 e um único camundongo injetado com PBS com uma duplicata técnica de dPCR para cada camundongo. As barras de erro indicam o intervalo de confiança de 95% para cada amostra. Abreviaturas: NTC= Controle sem modelo; dPCR = PCR digital; FACS = classificação de células ativadas por fluorescência. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Cartilha</td>
			<td>Seqüenciar</td>
		</tr><tr><td>Primer Cre para a frente</td>
			<td>CTGACGGTGGGAGAATGTTAAT</td>
		</tr><tr><td>Cre primer reverso</td>
			<td>CATCGCTCGACCAGTTTAGTT</td>
		</tr><tr><td>Sonda Cre </td>
			<td>/56-FAM/CGCAGGTGT/ZEN/AGAGAAGGCACTTAGC/3IABkFQ/</td>
		</tr><tr><td>Primer direto Polr2a </td>
			<td>GACTCCTTCACTCACTGTCTTC</td>
		</tr><tr><td>Primer reverso Polr2a </td>
			<td>TCTTGCTAGGCAGTCCATTATC</td>
		</tr><tr><td>Sonda Polr2a </td>
			<td>/5HEX/ACGAGATGC/ZEN/TGAAAGAGCCAAGGT/3IABkFQ/</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Sequências de primers e sondas usadas para quantificação de vg/dg. Primers e sonda Cre foram usados para quantificar o genoma do vetor. Primers e sonda Polr2a foram usados para quantificar o genoma diplóide de camundongo.

Aqui, detalhamos um protocolo otimizado para injeção de veia da cauda lateral de camundongo para administrar sistemicamente o vírus adeno-associado (AAV) em camundongos adultos. Além disso, descrevemos protocolos de ensaios comumente usados para avaliar a transdução de AAV.

Many disorders affect multiple organs or involve different regions of the body, so it is critical to deliver therapeutics systemically to target the ...

consistent-delivery-adeno-associated-virus-via-lateral-tail-vein

Research

JoVE Journal

Medicine

Consistent Delivery of Adeno-Associated Virus via Lateral Tail-Vein Injection in Adult Mice

604 visualizações.  National Institutes of Health. Trabalhamos no desenvolvimento de terapias genéticas para distrofias musculares congênitas e de início precoce e distúrbios neuromusculares. E para conseguir isso, usamos diferentes modalidades de terapia genética para abordar as causas genéticas subjacentes desses distúrbios. O desenvolvimento contínuo de vetores de terapia gênica virais e não virais tem sido muito importante para o nosso campo.Como os novos vetores de terapia gênica viral ...

Vídeo: Autor em destaque: Desenvolvimento de terapias genéticas para distrofias musculares e distúrbios neuromusculares

Many disorders affect multiple organs or involve different regions of the body, so it is critical to deliver therapeutics systemically to target the affected cells located in different sites. Intravenous injection is a widely used systemic delivery route in preclinical studies that assess treatments intended for body-wide administration. In adult mice, it involves the intravenous administration of the therapeutic agent into the mouse&#39;s lateral tail veins. When mastered, tail-vein injections are safe and fast, and only require simple and commonly available tools. However, tail-vein injections are technically challenging and require extensive training and continuous practice to ensure the accurate delivery of the intended dose.
Here we describe a detailed, optimized, lateral tail-vein injection protocol that we have developed based on our experience and on recommendations that had been previously reported by other groups. Other than the mouse restrainers and insulin syringes, this protocol requires only reagents and equipment that are readily available in most labs. We found that following this protocol results in consistently successful intravenous delivery of adeno-associated virus (AAV) into the tail veins of unsedated 7-9 week-old mice. Additionally, we describe the optimized protocols for the histological detection of fluorescent reporter proteins and vector genome per diploid genome (vg/dg) quantification used to assess AAV transduction and biodistribution. The goal of this protocol is to aid experimenters in easily performing tail-vein injections successfully and consistently, which can reduce the practice time needed to master the technique.

Here we detail an optimized protocol for mouse lateral tail-vein injection to systemically administer adeno-associated virus (AAV) in adult mice. Additionally, we describe protocols of commonly used assays to assess AAV transduction.