Kriyojen numune hazırlama, özellikle eşit olmayan partikül dağılımı olmak üzere etkinliğini sınırlayabilecek zorluklarla karşı karşıyadır. Bu sorun genellikle yeni inşa edilmiş protein yapılarında düşük çözünürlüğe ve düşük doğruluğa yol açar. Eşit olmayan partikül dağılımının üstesinden gelmek için, numuneye deterjan veya membran taklitleri eklemek, ızgara destek filmini değiştirmek ve veri toplama sırasında belirli aşamayı eğmek dahil olmak üzere çeşitli deneysel yaklaşımlar kullanılır.
Bu protokol, numune hazırlama optimizasyonu yoluyla eşit olmayan parçacık dağılımını ele almak için basit bir pratik yöntemi analiz eder ve araştırmacılara kriyojen kullanarak makromolekül yapılarını verimli bir şekilde göstermeleri için referansımızı sağlar. Başlamak için, MJ küçük ısı şoku proteini 16.5 içeren havuzlanmış protein fraksiyonlarını toplayın. Fraksiyonları dört santigrat derecede yaklaşık 65 miligrama konsantre etmek için 50 kilodalton moleküler ağırlık kesimine sahip santrifüjlü filtreler kullanın.
Konsantrasyondan sonra, agregaları çıkarmak için numuneyi 16.000 G'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanın 50 mikrolitre hacmini 0.2 mililitre ince duvarlı PCR tüplerine ekleyin. Transmisyon elektron mikroskobu için, iki donmuş protein tüpünü buz üzerinde çözdürün.
Çözüldükten sonra, karıştırmak için tüpü birkaç kez hafifçe vurun. Daha sonra agregaları çıkarmak için protein çözeltisini 16.000 G'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı bir boyut dışlama kromatografi kolonuna enjekte edin ve 0.5 mililitre elüsyon fraksiyonları toplayın.
280 nanometrede en yüksek ultraviyole absorbansını sergileyen zirveye karşılık gelen elucian fraksiyonlarını toplayın. Tampon değişimi için, bir makasla diyaliz membranını 30 x 30 milimetrelik parçalar halinde kesin. Parçaları dengelemek için damıtılmış su veya tampon çözeltilerde inkübe edin.
Daha sonra, 50 mikrolitre mikrodiyaliz düğmesi olan bir odaya 55 mikrolitre protein çözeltisi ekleyin. Diyaliz membranını forseps kullanarak dikey olarak tutun ve fazla sıvıyı boşaltmak için membranın bir kenarını kağıt mendile hafifçe dokundurun. Mikrodiyaliz düğmesini membran ile dikkatlice kapatın.
O-ringi diyaliz membranının üzerine yerleştirin ve yavaşça düğmenin kenarındaki oluğa yuvarlayın. Her diyaliz düğmesini, membran tarafı yukarı bakacak şekilde hedef tamponu içeren ayrı bir behere daldırın. Membranı dikkatlice delmek ve protein çözeltisini mikrodiyaliz odasından geri kazanmak için ince iğneli bir şırınga kullanın.
Mililitre başına 20 ila 120 nanogram konsantrasyonda beş mikrolitre numuneyi bir kızdırma deşarj ızgarasına yükleyin. Bir parafin film tabakasına her biri 50 mikrolitrelik üç su damlası hazırlayın. Numuneyi yıkamak için ızgara yüzeyini su damlalarına sürtün.
Şimdi ızgaraya beş mikrolitre filtrelenmiş %1'lik pisuar asetat çözeltisi yükleyin ve pisuar asetat çözeltisini hemen pipetleyin. Izgaraya beş mikrolitre pisuar asetat çözeltisi daha yükleyin. Fazla leke solüsyonunu çıkarmak için ızgaranın cımbız tarafına filtre kağıdıyla hafifçe dokunun ve ızgaranın kurumasını bekleyin.
Cımbızı ve kızdırma deşarj ızgarası tertibatını cihaza monte edin. Ardından, numunenin dört mikrolitresini ızgaranın karbon tarafına yükleyin. Daldırmalı dondurma işlemini başlatın.
Izgaraları transmisyon elektron mikroskobuna veya TEM'e yüklenmeye hazırlamak için, önce otomatik ızgara montaj istasyonuna vitrifiye ızgaralar içeren bir ızgara kutusu yerleştirin ve vitrifiye ızgaralar içeren bir ızgara kutusunun kapağını sökün. Otomatik ızgara halkasını montaj istasyonunda belirlenen kesme alanına yerleştirin. Vitrifiye ızgarayı ızgara kutusundan dikkatlice hareket ettirin ve otomatik ızgara halkasının içine sığdırın.
Şimdi dairesel açıklığı otomatik ızgara halkasının ve ızgara düzeneğinin üzerine yerleştirmek için diski hizalayın. Izgarayı otomatik ızgara halkasına sabitlemek için, C klipsi yerleştirme aracını ızgaranın üzerine yerleştirin ve C klipsini içine sabitlemek için hafifçe aşağı bastırın. Diski geri döndürün ve monte edilmiş ızgaraları otomatik ızgara saklama kutusuna taşıyın.
Kaset yükleme istasyonunu monte edin ve sıvı nitrojen ile soğutun. Otomatik ızgara saklama kutusunu yükleme istasyonuna yerleştirin. Izgara aksamını otomatik ızgara saklama kutusundan kasete taşıyın.
Kaseti otomatik yükleyici kapsülüne yerleştirmek için kolu kullanın. Serbest hareketini onaylamak ve donmadığından emin olmak için otomatik yükleyicideki pimi kontrol edin. Dizilerde parçacık birikimi, tampon koşullarından veya yüzey yükü modifikasyonlarından bağımsız olarak test edilen tüm ızgaralarda gözlendi.
Dokuz milimolar mobstress, 50 milimolar sodyum klorür ve 0.1 milimolar EDTA tamponunda negatif yüklü ızgaralarla birleştirilen daha yüksek bir protein konsantrasyonu, ızgara delikleri içinde tek parçacıkların istenen dağılımına neden oldu ve protein dizisi oluşumunu azalttı. Bu optimize edilmiş durum, 0,80'lik yüksek bir konik FSC alan oranı değerine ve 0,859'luk bir SCF değerine yol açarak düzgün bir partikül dağılımını doğruladı.
