Aynı drosophila beyninde birden fazla in situ hibridizasyon turunun gerçekleştirilebildiği ve birçok farklı genin ekspresyon modellerinin görselleştirilmesini sağlayan sağlam bir protokol geliştirdik. Sinek beynini bir hidrojel içine gömmek, birden fazla hibridizasyon turunda mükemmel doku bütünlüğü ve mRNA stabilitesi sağlar. Ayrıca görüntüleme sırasında optik netliği önemli ölçüde artırır.
EASI-FISH, sinek beynindeki hücre tiplerinin gen ekspresyon profillerini tanımlamak için konfokal veya ışık tabakası mikroskobu olan herhangi bir laboratuvar tarafından kullanılabilir. Başlamak için, yüksüz bir slaytı bir RNA dekontaminasyon reaktifi ile silin. Yapıştırıcıyı silikon contadan koruyan opak filmi çıkarın.
Ardından, dört hazneye kadar içeren contayı kızağa yapıştırın. Her hazne yüzeyini bir mikrolitre polilisin ile kaplamak için bir P20 pipeti kullanın. Daha sonra, tüp başına dört adede kadar drosophila beynini 0.2 mililitrelik bir PCR tüpüne aktarın.
Beyinleri% 0.1 Triton X-100 içeren 150 mikrolitre PBS'de rehidre edin ve ardından PBS izleyin. Her hazneye 40 mikrolitre PBS ekleyin. Bir çift ince cımbızla, beyinleri odanın ortasına arka arkaya nazikçe yerleştirin ve aralarında biraz boşluk bırakın.
PBS'yi hazneden çıkarın ve hemen 50 mikrolitre 20 milimolar MOPS tamponu ekleyin. Beyinler MOPS tamponunda dengelenirken, eşit hacimde çözülmüş Melphalan-X'i eşit hacimli MOPS tamponuna sahip bir tüpe pipetleyin. Ardından bir ile 100 arasında bir oranda Ac-X stok çözeltisi ekleyin.
Çözeltiyi girdaplayın ve toplamak için kısaca döndürün. Tüm MOPS tamponunu odalardan çıkarın ve 50 mikrolitre Melphalan-X Ac-X solüsyonu ekleyin. Sızdırmazlık için conta yapıştırıcısı kullanmadan her haznenin üzerine bir kapak sürgüsü yerleştirin.
Ardından odayı nemlendirilmiş bir kutuya yerleştirin. Ertesi gün, kapak fişini dikkatlice çıkarın ve Melphalan-X Ac-X solüsyonunu aspire edin. Monte edilmiş beyinleri 100 mikrolitre% 0.1 PBT'de iki kez yıkayın, ardından 100 mikrolitre PBS ile yıkayın.
Çözülmüş TREx-1000 4-Hidroksi-TEMPO, TEMED ve amonyum persülfat çözeltilerini buzun üzerine yerleştirin. Çökelti olmadığından emin olmak için TREx-1000 solüsyonunu girdaplayın. Buzlanmadan önce bir jel çözeltisi ve girdap hazırlamak için çözeltileri karıştırın.
Bir pipet ucuyla PBS'yi hazneden çıkarın ve kalan sıvıyı tüy bırakmayan bir mendille uzaklaştırın. Hemen her odadaki beyinlerin üzerine 40 mikrolitre jel solüsyonu ekleyin. Odaları 10 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.
Şimdi jel çözeltisini hazneden çıkarın. Ardından conta yüzeyi yapıştırıcısından şeffaf koruyucu filmi soyun. Son bir 45 mikrolitre taze jel çözeltisi ekleyin.
Haznenin üzerine nazikçe bir kapak fişi yerleştirin ve dört santigrat derecede 10 dakika daha inkübe etmeden önce hazneyi kapatmak için kapak fişine bastırın. Jeli polimerize etmek için odayı 37 santigrat derecede 1.5 saat inkübe edin. Jelleri bir tezgahta soğuttuktan sonra, kapak kızağını ve silikon contayı dikkatlice çıkarmak için bir tıraş bıçağı kullanın.
Jeli dikdörtgen bir şekle kesin ve numune yönünü belirtmek için sağ üst köşeyi kesin. Ardından, jelleri slayttan dikkatlice kaldırmak için az miktarda Pro K tamponu ile nemlendirilmiş ince bir boya fırçası kullanın. Her jeli ayrı ayrı iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
500 mikrolitre Pro K tamponu ve beş mikrolitre Proteinaz K enzimini karıştırın ve karışımı her bir jele ekleyin. Gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, tamponu ince esnek bir pipetle çıkarın ve ardından jelleri PBS'de her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
Jelleri 37 santigrat derecede bir mililitre DNASE1 tamponunda 30 dakika inkübe edin. 50 mikrolitre DNASE1 enzimini 450 mikrolitre DNASE1 tamponu ile karıştırın. Girdap yapmadan yavaşça karıştırın.
Her bir jeli 500 mikrolitre DNASE1 çözeltisi içinde 37 santigrat derecede iki saat inkübe edin. Daha sonra, jelleri oda sıcaklığında bir mililitre PBS ile 15 dakika boyunca dört kez yıkayın. Şimdi, jelleri 500 mikrolitre çözülmüş hibridizasyon tamponunda problar olmadan 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Probları hibridizasyon tamponunda bir ila 100 oranında seyreltin ve jel başına 300 mikrolitre hazırlayın. Jelleri, gece boyunca 37 santigrat derecede problar içeren hibridizasyon tamponu ile inkübe edin. Ertesi gün, jelleri önce prob yıkama tamponunda, ardından PBS'de yıkayın.
Hibridizasyon zincir reaksiyonu için, jele 500 mikrolitre amplifikasyon tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Floresan saç tokalarını bir PCR makinesinde 95 santigrat derecede 90 saniye ısıtın ve çözeltiyi 30 dakika boyunca 25 santigrat dereceye soğutun. Her prob için, eşleşen saç tokası çiftlerini amplifikasyon tamponunda bir ila 50 oranında seyreltin ve jel başına 300 mikrolitre hazırlayın.
Karışımı girdapladıktan sonra, karışımı jellere ekleyin ve inkübe edin. Jeli hafif tabaka görüntüleme için monte etmek için, bir jel tutucunun jel bağlantı yüzeyini iki kez bir mikrolitre polilisin ile kaplayın ve katlar arasında 37 santigrat derecede kurumasını bekleyin. Ardından, jeli, kesim sol tarafta olacak şekilde bir kapak fişi üzerine yerleştirin.
Bir boya fırçası kullanarak, jeli tek bir hareketle işlenmiş yüzeye aktarın. Nörotransmitter ile ilişkili genler ve nöropeptit genleri, yetişkin drosophila beyninde farklı ekspresyon paternleri sergiledi. VGluT ve Gad1, aynı hibridizasyon turunda birlikte tespit edildi ve örtüşmeyen ifade desenleri gösterdi.
AstA, optik lobda güçlü ekspresyon ve santral komplekste daha zayıf ekspresyon gösterdi. Crz, pars lateralis'te yüksek oranda eksprese edilirken, optik lob nöronlarında daha düşük ekspresyon seviyeleri gözlendi. Tk, Mer-GFP ekspresyonu ile tanımlanan H delta D nöronlarında, ışık tabakası veya konfokal mikroskopi ile spesifik bir bölünmüş GAL4 çizgisi kullanılarak tespit edildi.
Mer-GFP ile işaretlenmiş PFG nöronlarında FMRFamid yoktu, ancak çevredeki nöronlarda tespit edildi. FB4K nöronlarının yüksek çözünürlüklü görüntülemesi, VGluT ve ChAT/VAChT transkriptlerinin uzamsal dağılımını doğruladı. AstA ve Crz gibi nöropeptitler, bazı hücrelerde o kadar yüksek oranda eksprese edilir ki, tek transkriptleri temsil eden bireysel floresan noktalar artık ayrılamaz.
