Reseptör tirozin kinazlar ve memeli plazma zarı arasındaki etkileşimleri inceliyoruz. Lipid sallarının ve lipid asimetrisinin reseptör lokalizasyonunu, aktivasyonunu ve sinyalizasyonunu nasıl yönlendirdiğini bilmek istiyoruz. Küçük, dinamik ve sıcaklık koşullarına duyarlı oldukları için lipid sallarını doğrudan incelemek zordur.
Araştırmacılar genellikle etkileşimleri incelemek için büyük sipariş alanlarına sahip model sistemleri kullanmak zorundadır. Sentetik ve plazma zarı vezikülleri, lipid asimetrisi ve organellerden yoksun hücre zarlarının kusurlu temsilleridir. Canlı hücrelerle çalışarak, plazma zarının doğru bir temsilini elde ediyoruz.
Canlı hücreler bağlamında reseptör sinyalizasyonunun başlatılmasını vurgularlar. Bu, membran ortamlarının reseptörler ve bunların aşağı akış sinyal yolları üzerindeki etkisi hakkında fikir verir. Başlamak için, cam uçlu pozitif yer değiştirmeli bir pipet kullanarak lipit stoğunu bir borosilikat tüpe ayırın.
Borosilikat tüpünü yaklaşık 50 santigrat dereceye ayarlanmış bir ısıtma bloğuna yerleştirin ve görünen tüm kloroform buharlaşana kadar tüpe bir nitrojen gazı akışı uygulayın. Tüpü bir vakum odasına aktarın ve kalan çözücüyü çıkarmak için bir saat boyunca yüksek vakuma maruz bırakın. Daha sonra, 20 milimolar nihai konsantrasyona ulaşmak için kurutulmuş lipit filme serum içermeyen Ham'ın F-12 ortamını ekleyin.
Tüpü bir kapak veya Teflon bantla örtün ve 70 derecelik bir su banyosunda beş dakika ısıtın. Daha sonra, lipitleri askıya almak ve çok katmanlı veziküller veya MLV'ler oluşturmak için çözeltiyi girdaplayın. Ortam bulanıklaştıktan sonra, tüm hacmi bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve üç güne kadar dört santigrat derecede saklayın.
Hazırlanan MLV'leri metil alfa siklodekstrin ile 40 milimolar nihai konsantrasyona kadar karıştırın. Lipid karışımını 37 derece veya 55 derece Santigrat su banyosunda 30 dakika inkübe edin. Ortamın bulutludan açıklığa geçişini gözlemleyin.
Ardından, lipid değişim ortamının 30 ila 60 dakika oda sıcaklığına soğumasına izin verin. Litre başına 4,5 gram glikoz içeren takviye edilmiş DMEM'de 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitte büyütülen Çin hamster yumurtalık insülin reseptör hücreleri elde edin. 60 milimetrelik plakalarda altı hücrenin gücüne 1.5 kez 10 kez tohumlayın ve% 80 ila 90 birleşme elde etmek için bunları inkübe edin.
Ardından, hücreleri bir mililitre PBS ile üç kez yıkayın. Hücreleri gece boyunca iki mililitre serum içermeyen Ham'ın F-12 ortamında aç bırakın. Hücreleri PBS ile üç kez yıkadıktan sonra, hazırlanan değişim ortamından bir mililitre ekleyin.
Hücreleri oda sıcaklığında bir saat inkübe edin, değişim ortamına eşit şekilde maruz kalmanızı sağlamak için her 15 dakikada bir döndürün. Ardından, hücreleri bir mililitre PBS ile üç kez yıkayın. PBS'yi hücre kültürü plakasından tamamen çıkarın ve plakayı 10 dakika veya tamamen kuruyana kadar 45 derecelik bir açıyla ayarlayın.
Artık tamponu çıkardıktan sonra, kurutulmuş hücrelere bir mililitre hekzan izopropanol çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerinde 10 dakika inkübe edin. Şimdi çözeltiyi bir borosilikat tüpe aktarın. Tüpün üzerini örttükten sonra eksi 20 santigrat derecede saklayın.
Daha sonra, kalan hücre kalıntılarını 500 mikrolitre normal sodyum hidroksit kullanarak çözün. Tam çözünmeyi sağlamak için kabı oda sıcaklığında 10 dakika çalkalayın. Değişim verimliliğini kontrol etmek için, 100 mililitre kloroform metanol% 30 amonyum hidroksit çözeltisini bir cam ince tabaka kromatografi tankına dökün.
Depoyu sıkıca kapatın ve buharın en az bir saat dengelenmesini bekleyin. Lipid ekstrakt numunesini, organik çözücü buharlaşana kadar bir nitrojen gazı akışı altında düşük bir ayarda bir ısıtma bloğu üzerinde kurutun. Daha sonra, lipit filmi 50 mikrolitre bire bir kloroform metanol çözeltisi içinde çözün.
10 mikrolitrelik bir Hamilton şırınga kullanarak, bir ila 10 mikrolitre numuneyi silika yüksek performanslı bir TLC plakasına yükleyin. Numuneyi bir santimetrelik bantlar halinde uygulayın ve 20 santimetrelik plaka başına maksimum 10 bant yükleyin. TLC plakasını TLC tankına dik olarak yerleştirin ve çözücü ön kısmının fosfolipid türlerini ayırmak için sekiz santimetre hareket etmesine izin verin.
Daha sonra plakayı 10 dakika kurumaya bırakın ve üzerine sulu bir %3 bakır asetat ve %8 fosforik asit çözeltisi püskürtün. Plakayı oda sıcaklığında veya bir ısı tabancasıyla 30 dakika tekrar kurumaya bırakın. Plaka yarı saydam maviden opak beyaza dönmelidir.
Daha sonra, plakayı 180 ila 200 santigrat derecede temperlenmiş bir fırında 5 ila 10 dakika veya siyah lipit bantları görünür hale gelene kadar pişirin. İşlem görmüş hücreleri 500 mikrolitre 100 nanomolar insülin ile serum içermeyen ortamda oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Hücreleri buz gibi soğuk PBS ile yıkadıktan sonra, stimülasyonu durdurmak için buzun üzerine yerleştirin.
Daha sonra bir mililitre buz gibi soğuk PBS ekleyin ve bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri hasat edin. Hücreleri 3000 G'de dört santigrat derecede beş dakika boyunca peletleyin. Daha sonra, hücre peletine 100 ila 200 mikrolitre tam RIPA lizis tamponu ekleyin ve hücreleri parçalamak için 30 ila 40 kez yeniden süspanse edin.
Lizatı buz üzerinde 10 dakika inkübe ettikten sonra, kalıntıları ayırmak için dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 16.000 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı yeni bir tüpte toplayın. Protein konsantrasyonunu belirledikten sonra, lizatı beş kez laemmli tamponu ile karıştırın ve beş dakika boyunca 95 santigrat derecede ısıtın.
Elektroforez için bir sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel üzerine numune başına eşit miktarda protein yükleyin. Proteinler 100 ila 250 kilodalton arasında iyi bir şekilde çözülene kadar jeli çalışan bir tamponda 100 ila 150 voltta çalıştırın. Daha sonra, çözülen proteinleri bir transfer tamponu kullanarak bir poliviniliden florür membranına aktarın ve membranı uygun antikorlarla boyayın.
Çin hamster yumurtalık IR hücrelerindeki lipid değişimi, beyin sfingomiyelin değiş tokuş edildiğinde sfingomyelin bant yoğunluğunun artmasına ve fosfatidilkolin bant yoğunluğunun azalmasına neden oldu. Tersine, 1, 2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin veya DOPC değiş tokuş edildiğinde, fosfatidilkolin bant yoğunluğu artarken, sfingomiyelin bant yoğunluğu azaldı. DOPC ile değiş tokuş edilen hücreler, insüline bağımlı IR otofosforilasyonunda bir azalma gösterdi.
Buna karşılık, beyin sfingomyelin, IR fosforilasyonunu korudu veya orta derecede arttırdı. Normalize fosforilasyon seviyeleri, pYpY IR yoğunluğunun western blot verilerinden elde edilen IR beta yoğunluğuna bölünmesiyle belirlendi.
