Teitell laboratuar İnsan embriyonik kök hücre çalışmaları California Rejeneratif Tıp Enstitüsü (CIRM) tohum hibe RS1-00313 tarafından desteklenmektedir. Geniş, UCLA, özellikle Dr. Amander Clark, Dr Jerome Zack ve verdikleri destek için çalışmalarımız UCLA Broad Enstitüsü Kök Hücre Çekirdek Tesis üyeleri Rejeneratif Tıp ve Kök Hücre Araştırma Merkezi üyelerine teşekkür ederiz.

Matrigel Matrigel için Yarma hESC Genellikle Matrigel üzerinde hESC bir konfluent 6 plaka, kuyu, yarma, 4-5 gün sonra tekrar konfluent olma, başka bir Matrigel plaka 1:5 için 1:3 bölünmüş olabilir. <ol><li> Yarma önce yukarıda açıklandığı gibi, CM ve Matrigel plakaları hazırlanır. </li><li> Bölme gününde, × 1 ile bölme PBS, pH7.4 her iyi yıkayın iyi 1mg/ml Dispase (DMEM/F12 medya ile seyreltilmiş 5mg/ml stok solüsyonu) 1 ml ve 37 inkübe ° C 3 dk. </li><li> 1 ile her iyi üç kez yıkayın × PBS, pH7.4,, ES medya, 1ml bFGF olmadan eklemek iyi alt kapalı koloniler kazımak için bir hücre kazıyıcı, 50ml şahin tüp askıya hESC toplamak ve santrifüj yoluyla pelet 200g oda sıcaklığında 5 dakika. </li><li> Matrigel plakalar üzerinde yeniden plakalı hESC, ilk DMEM/F12 ile Matrigel tabak yıkama ve başına 10 ng bFGF ile desteklenmiş CM 2.5ml ekleyin. 10 ng bFGF, pipet hücre süspansiyonu yukarı ve aşağı üç kez ile desteklenmiş CM uygun bir hacmi hESC pelletini tekrar. (NOT: yarma için hESC Matrigel plakaları geldiğinde, yığınları kırmak için çok kolay, bu nedenle üç tur pipetleme yeterli ve daha koloniler üzerinde bozabilir ve tek hücre yapabilir pipetleme.) Temsili miktar 0.5 ml ortalama hESC kümeleri süspansiyon 6-iyi Matrigel plaka nihai bir birim olarak ortalama 3ml ulaşmak için. 37 ° C inkübatör plaka koyun. </li></ol> Immünofloresan mikroskopi pluripotency belirteçlerin saptanması İmmünofloresan mikroskopi, kültür sırasında hESC pluripotency belirteçlerinin Ekim-4 ve SSEA-4 ifadesi incelemek için kullanılır. <ol><li> Iyi bir medya aspire ve 1 ile yıkayın × PBS, pH 7.4. 10 dakika düzeltmek için iyi,% 3.7 formaldehit 2ml ekle. </li><li> 2 dakika süreyle iyi yer ve -20 ° C 2 ml metanol eklemek, 1xPBS pH 7.4 ile durulayın. </li><li> 5 dakika süreyle% 0.2 sığır serume albumin (BSA) 1ml 1xPBS, pH 7.4 ve blok ile durulayın. </li><li> Ekim-4 veya anti-h/mSSEA-4 antikor (% 0,2 BSA 1:200 dilüsyon) 1 ml ekleyin ve 1 saat veya 4 ° C&#39;de gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. (NOT: SSEA-4 boyama, doğrudan 6. adıma gidin) </li><li> 1xPBS, pH 7.4 ile üç kez durulayın FITC-konjuge tavşan IgG (% 0,2 BSA 1:500 dilüsyon), ve 1 saat oda sıcaklığında inkübe ekleyin. </li><li> 1xPBS, pH 7.4 ile 3 kez durulayın ve iyi merkezi montaj çözümü bir damla koymak (nükleer görselleştirme isteniyorsa DAPI içerebilir). Oje mühür, hücrelerin üstüne lamel koyun, ve immünofloresan mikroskobu ile değerlendirmek. </li></ol> İnsan embriyonik kök hücre makbuzlar ES medya (Embriyonik Kök hücre ortam): DMEM/F12 - 400ml Nakavt Serum Replacer - 100ml Non-Essential Amino Asitler - 5ml 200mm GlutaMax / BME Çözüm - 5ml Penisilin / Streptomisin - 5ml 4 iyice karıştırınız ve 500ml şişelerde son hESC Kültür Medya saklamak ° C En fazla bir iki hafta iyi. MEF Kültür Medya: DMEM - 1000ml FBS - 100ml Non-Essential Amino Asitler - 10ml Glutamin - 10ml Penicllin / Streptomisin - 10ml İyice karıştırın ve 4 final MEF Kültür Medya saklamak ° C. 200mm Glutamax / BME Çözüm: Glutamax - 100ml β-mercaptoethanol (14.3M Stok çözelti) - 140 μ1 Iki ve sonra çözümler kısım 10ml bölümlerini karıştırın. -20 ° C&#39;de alikotları tutun bFGF Çözümü (stok nihai konsantrasyonu: 10 mikrogram / ml): bFGF (FGF2) - 50 mikrogram 1xPBS% 0,1 BSA, pH: 7.4 - 5ml 10 mg / ml stok yapmak için 50 mikrogram olarak 5ml% 0.1 BSA bFGF eritin. 500 ul parçaya kısım. -80 ° C saklayınız Kollajenaz IV Çözümü (1mg/ml): Kollajenaz IV - 50mg DMEM/F12 Medya - 50ml 50ml şahin tüp kollajenaz IV tozu ekleyin. Kaput, 50ml steril DMEM/F12 medya karıştırın. &lt;1 dakika vorteksleyin çözüm. toz çözülmüş olduğundan emin olun. Kaputu, yeni bir steril 50ml şahin tüp içine filtresi 0.22 mikron geçmesi. Bu çözüm için iyi saklanan 2 hafta, 4 ° C maksimum Dispase Çözüm (1mg/ml): Dispase 5mg/ml - 2ml DMEM/F12 Medya - 8 ml -20 ° C&#39;de kısım ticari, 5mg/ml Dispase çözüm ve mağaza DMEM/F12 kullanarak 1mg/ml dispase sulandırınız. Bu çözüm, 1 hafta, 4 tutulmalıdır ° C.

<ol>
	<li>Thomson, J. a. m. e. s. A., Itskovitz-Eldor, J. o. s. e. p. h., Shapiro, S. a. n. d. e. r. S., Waknitz, M. i. c. h. e. l. l. e. A., Swiergiel, J. e. n. n. i. f. e. r. J., Marshall, V. i. v. i. e. n. n. e. S., Jones, J. e. f. f. r. e. y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts+.">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts .</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Xu, C. h. u. n. h. u. i., Inokuma, M. a. r. g. a. r. e. t. S., Denham, J. e. r. r. o. d., Golds, K. a. t. h. a. l. e. e. n., Kundu, P. r. a. t. i. m. a., Gold, J. o. s. e. p. h. D., Carpenter, M. e. l. i. s. s. a. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells+Nature+Biotechnology+19."> Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells Nature Biotechnology 19.</a> Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).</li></ol>

Bu dizi 3 video (MEF) besleyici hücreler (video 1), geçit onları besleyici hücre-levhalar (Video 2) Matrigel nasıl ve ne kadar korumak için fare embriyonik fibroblast insan embriyonik kök hücreleri (hESC) büyümeye nasıl gösterir Matrigel besleyici hücre koşulları (video 3) Pasajlanması hESC. Birçok önceki çalışmalar, bu bakım yaşayabilir, farklılaşmamış hESC inaktive MEF besleyici hücreler kültür gerektirir gösterdi. Ancak, pek çok deney, besleyici hücre kontaminasyon ücretsiz hESC saf bir nüfus gerekmekte...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Knockout Serum Replacer (KSR)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>10828-028</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>11330-057</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td> Non-essential Amino Acids</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>11140-050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GlutaMax </td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>35050-061</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>11995-065</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Clontech</td>
<td>631107</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>25030-081</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BME</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP176-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>bFGF</td>
<td>Reagent</td>
<td>R&D Systems</td>
<td>233-FB-025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase IV</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>17104-019</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dispase</td>
<td>Reagent</td>
<td>Stem Cell Technologies</td>
<td>17105-041</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin / Streptomycin </td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gelatin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Chemicon</td>
<td>ES-006-B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Matrigel</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>354277</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oct-4 antibody</td>
<td>Reagent</td>
<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
<td>SC-9081</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>anti-h/mSSEA-4 Phycoerythrin Conjugated Mouse IgG3</td>
<td>Reagent</td>
<td>R&D Systems</td>
<td>FAB1435P</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FITCI-conjugated antirabbit IgG</td>
<td>Reagent</td>
<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories. Inc.</td>
<td>715-095-152</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
			<div>
					</div>

from mefs to matrigel 3: passaging hescs from matrigel onto matrigel

Bu video, besleyici, hücre koşullarda ve ne kadar besleyici sürekli geçit hESC hücre koşulları, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) büyümesini nasıl koruyacağınızı gösteriyor. HESC, Onay pluripotency immünofloresan mikroskobu ile besleyici, hücre koşullarda yetiştirilen da gösterilmiştir.

Watch this Scientific Journal Video about From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel at JoVE.com

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

Bu video, besleyici, hücre koşullarda ve ne kadar besleyici sürekli geçit hESC hücre koşulları, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) büyümesini nasıl koruyacağınızı gösteriyor. HESC, Onay pluripotency immünofloresan mikroskobu ile besleyici, hücre koşullarda yetiştirilen da gösterilmiştir. 3 Bölüm 3

Matrigel MEFS Matrigel 3: Matrigel üzerine gelen Pasajlanması hESC

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage ...

from-mefs-to-matrigel-3-passaging-hescs-from-matrigel-onto-matrigel

Research

JoVE Journal

Biology

13.7K Görüntüleme.  University of California, Los Angeles. Bu video, besleyici, hücre koşullarda ve ne kadar besleyici sürekli geçit hESC hücre koşulları, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) büyümesini nasıl koruyacağınızı gösteriyor. HESC, Onay pluripotency immünofloresan mikroskobu ile besleyici, hücre koşullarda yetiştirilen da gösterilmiştir. 3 Bölüm 3