Embrionali umane studi sulle cellule staminali in laboratorio Teitell sono supportati da una California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) sementi concedere RS1-00313. Ringraziamo i membri del Centro di Medicina Rigenerativa Broad e ricerca sulle cellule staminali presso la UCLA, in particolare il Dott. Amander Clark, il Dr. Jerome Zack, e membri del Fondo per la UCLA Stem Cell Institute Broad core per il loro sostegno dei nostri studi.

HESC scissione da Matrigel a Matrigel Di solito un confluenti 6 pozzetti di hESC su Matrigel possono essere divisi 1:03-01:05 ad un altro piatto Matrigel, con i pozzi di diventare confluenti ancora 4-5 giorni dopo la divisione. <ol><li> CM e le piastre Matrigel sono preparati come descritto in precedenza prima di sciogliersi. </li><li> Il giorno della scissione, lavare i pozzetti per la scissione con 1 × PBS, pH7.4, aggiungere 1 ml di 1mg/ml dispasi (soluzione madre diluita 5mg/ml con DMEM/F12 media) in ciascun pozzetto e incubare a 37 ° C per 3 min. </li><li> Lavare i pozzetti tre volte con 1 × PBS, pH7.4, aggiungere 1 ml di ES media senza bFGF, usare un raschietto colonie di cellule per raschiare dal fondo del pozzo, raccogliere le hESC sospeso in un tubo da 50 ml falco, e pellet per centrifugazione a 200g per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Per ri-targhetta del hESC su piastre Matrigel, prima lavare i piatti con Matrigel DMEM/F12 e aggiungere 2,5 ml di CM integrata con 10ng/ml bFGF per bene. Risospendere il pellet in hESC un volume adeguato di CM integrata con 10ng/ml bFGF, pipetta la sospensione cellulare su e giù per tre volte. (NOTA: quando hESC per suddividere provengono da piastre Matrigel, le macchie sono molto facili da rompere, quindi tre cicli di pipettaggio è sufficiente e più pipettaggio può over-disturbare le colonie e fare singole cellule.) Aliquota 0,5 ml di sospensione hESC grumi per bene del 6-pozzetti Matrigel per ottenere 3 ml per oltre un volume finale. Porre la piastra in un incubatore a 37 ° C. </li></ol> Individuazione di marcatori di pluripotenza microscopia di immunofluorescenza Microscopia a immunofluorescenza è utilizzato per esaminare l&#39;espressione di marcatori hESC pluripotenza Oct-4 e SSE-4 durante la coltura. <ol><li> Aspirare multimediali da un pozzetto e lavare con 1 × PBS, pH 7,4. Aggiungere 2 ml di 3,7% di formaldeide al pozzo di correzione per 10 min. </li><li> Risciacquare con 1xPBS, pH 7,4, aggiungere 2 ml di metanolo al pozzo e posto a -20 ° C per 2 min. </li><li> Risciacquare con 1xPBS, pH 7,4, e blocco con 1 ml di 0,2% serume albumina bovina (BSA) per 5 min. </li><li> Aggiungere 1 ml di anticorpo Oct-4 o anti-h/mSSEA-4 (1:200 diluizione nel 0,2% di BSA), e incubare a temperatura ambiente per 1 ora oppure a 4 ° C per una notte. (NOTA: per SSE-4 macchie, passare direttamente al punto 6) </li><li> Lavare tre volte con 1xPBS, pH 7,4, aggiungere FITC-coniugato IgG di coniglio (1:500 diluizione nel 0,2% di BSA), e incubare a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Lavare 3 volte con 1xPBS, pH 7,4, e mettere una goccia di soluzione di montaggio (può contenere DAPI visualizzazione nucleare se si vuole) al centro del pozzo. Mettere coprioggetto sopra delle celle, sigillare con smalto, e valutare al microscopio immunofluorescenza. </li></ol> Cellule staminali embrionali umane ricevute ES media (mezzi di cellule staminali embrionali): DMEM/F12 - 400ml Knockout siero Replacer - 100ml Aminoacidi non essenziali - 5ml 200mm GlutaMax / BME Solution - 5ml Penicillina / streptomicina - 5ml Mescolare bene e conservare finale Media Cultura hESC in bottiglie da 500ml a 4 ° C. Buono per un massimo di due settimane. MEF Cultura Media: DMEM - 1000ml FBS - 100ml Aminoacidi non essenziali - 10ml Glutammina - 10ml Penicllin / streptomicina - 10ml Mescolare bene e conservare finale Media Cultura MEF a 4 ° C. 200mm Glutamax / BME Soluzione: Glutamax - 100ml β-mercaptoetanolo (Soluzione madre a 14,3 milioni) - 140 μ1 Mescolare due soluzioni bene e poi porzioni da 10 ml aliquota. Mantenere aliquote a -20 ° C. bFGF Soluzione (concentrazione finale di magazzino: 10 microgrammi / ml): bFGF (FGF2) - 50 mcg BSA 0,1% nel 1xPBS, pH 7,4 - 5 ml Sciogliere 50 microgrammi bFGF in 5ml BSA 0,1% per fare un 10 mcg / ml di brodo. Aliquotare in porzioni da 500 microlitri. Conservare a -80 ° C. Collagenasi IV Soluzione (1mg/ml): Collagenasi IV - 50mg DMEM/F12 Media - 50ml Aggiungere la polvere di collagenasi IV in una provetta da 50 ml falco. Nel cofano, mescolare in 50ml di sterili DMEM/F12 media. Vortex la soluzione per &lt;1 min. per assicurarsi che la polvere è sciolta. Nel cofano, passare attraverso un filtro di 0,22 micron in un nuovo tubo sterile da 50ml falco. Questa soluzione è buona per un massimo di 2 settimane conservato a 4 ° C. Dispasi Soluzione (1mg/ml): Dispasi 5mg/ml - 2ml Media DMEM/F12 - 8ml Aliquota commerciale 5mg/ml soluzione dispasi e conservare a -20 ° C. Diluire dispasi a 1mg/ml utilizzando DMEM/F12. Questa soluzione può essere conservata per 1 settimana a 4 ° C.

<ol>
	<li>Thomson, J. a. m. e. s. A., Itskovitz-Eldor, J. o. s. e. p. h., Shapiro, S. a. n. d. e. r. S., Waknitz, M. i. c. h. e. l. l. e. A., Swiergiel, J. e. n. n. i. f. e. r. J., Marshall, V. i. v. i. e. n. n. e. S., Jones, J. e. f. f. r. e. y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts+.">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts .</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Xu, C. h. u. n. h. u. i., Inokuma, M. a. r. g. a. r. e. t. S., Denham, J. e. r. r. o. d., Golds, K. a. t. h. a. l. e. e. n., Kundu, P. r. a. t. i. m. a., Gold, J. o. s. e. p. h. D., Carpenter, M. e. l. i. s. s. a. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells+Nature+Biotechnology+19."> Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells Nature Biotechnology 19.</a> Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).</li></ol>

Questa serie di 3 video dimostra come far crescere cellule staminali embrionali umane (hESC) su fibroblasti embrionali di topo (MEF), le cellule di alimentazione (video 1), come passaggio a Matrigel cell-free alimentatore piastre (video 2), e come mantenere hESC da passaging in alimentatore Matrigel condizioni cell-free (video 3). Numerosi studi precedenti hanno mostrato che il mantenimento della vitali, hESC indifferenziato richiede cultura sulle cellule inattivate alimentatore MEF. Tuttavia, per molti esperimenti, una popolazione pura di ...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Knockout Serum Replacer (KSR)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>10828-028</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>11330-057</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td> Non-essential Amino Acids</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>11140-050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GlutaMax </td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>35050-061</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>11995-065</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Clontech</td>
<td>631107</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>25030-081</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BME</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP176-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>bFGF</td>
<td>Reagent</td>
<td>R&D Systems</td>
<td>233-FB-025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase IV</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>17104-019</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dispase</td>
<td>Reagent</td>
<td>Stem Cell Technologies</td>
<td>17105-041</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin / Streptomycin </td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gelatin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Chemicon</td>
<td>ES-006-B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Matrigel</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>354277</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oct-4 antibody</td>
<td>Reagent</td>
<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
<td>SC-9081</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>anti-h/mSSEA-4 Phycoerythrin Conjugated Mouse IgG3</td>
<td>Reagent</td>
<td>R&D Systems</td>
<td>FAB1435P</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FITCI-conjugated antirabbit IgG</td>
<td>Reagent</td>
<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories. Inc.</td>
<td>715-095-152</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
			<div>
					</div>

from mefs to matrigel 3: passaging hescs from matrigel onto matrigel

Questo video dimostra come mantenere la crescita delle cellule staminali embrionali umane (hESC) in cellule di alimentazione priva di condizioni e modalità di continuo passaggio in hESC alimentatore cellulare senza condizioni. Conferma di hESC pluripotenza delle cellule coltivate in alimentatore senza condizioni al microscopio immunofluorescenza è anche dimostrata.

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From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

Questo video dimostra come mantenere la crescita delle cellule staminali embrionali umane (hESC) in cellule di alimentazione priva di condizioni e modalità di continuo passaggio in hESC alimentatore cellulare senza condizioni. Conferma di hESC pluripotenza delle cellule coltivate in alimentatore senza condizioni al microscopio immunofluorescenza è anche dimostrata. Parte 3 di 3.

Dal MEF per Matrigel 3: hESC Passaging da Matrigel su Matrigel

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage ...

from-mefs-to-matrigel-3-passaging-hescs-from-matrigel-onto-matrigel

Research

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Biology

13.7K Views.  University of California, Los Angeles. Questo video dimostra come mantenere la crescita delle cellule staminali embrionali umane (hESC) in cellule di alimentazione priva di condizioni e modalità di continuo passaggio in hESC alimentatore cellulare senza condizioni. Conferma di hESC pluripotenza delle cellule coltivate in alimentatore senza condizioni al microscopio immunofluorescenza è anche dimostrata. Parte 3 di 3.