Teitell 연구실에서 인간 배아 줄기 세포 연구는 재생 의료에 대한 캘리포니아 연구소 (CIRM) 씨앗 부여 RS1 - 00313에 의해 지원됩니다. 우리는 UCLA, 특히 박사 Amander 클라크 박사 제롬 잭, 우리의 연구들의 지원 UCLA 브로드 연구소 줄기 세포 핵심 시설의 멤버에 재생 의료 및 줄기 세포 연구의 브로드 센터의 회원을 감사드립니다.

Matrigel에서 Matrigel을 분리 hESCs 보통 Matrigel에 hESCs의 합류 6 잘 판은 우물이 4-5일 분리 후 다시 합류되기와 다른 Matrigel 판에 1시 5분에서 1시 3분까지 분할 수 있습니다. <ol><li> 분할하기 전에 위에서 설명한 CM과 Matrigel 플레이트는 준비가되어 있습니다. </li><li> 분할 당일, × 1 분리를위한 PBS, pH7.4를 각각 잘 씻어 각각 잘하는 1mg/ml Dispase (DMEM/F12 매체와 희석 5mg/ml 재고 솔루션)의 1ml을 추가하고, 37 품어 ° C 3 분. </li><li> 1 각 잘 세 번 씻어 × PBS, pH7.4은, bFGF없이 ES 미디어 1ml를 추가 우물의 바닥에서 식민지를 긁어 세포 스크레이퍼를 사용하여 50ml 팔콘 튜브의 정지 hESCs를 수집하고, 원심 분리에 의해 펠릿 200g에 상온에서 5 분. </li><li> 다시 타석으로 Matrigel 플레이트에 hESCs 먼저 DMEM/F12과 Matrigel 접시를 씻어 잘 당 10ng/ml bFGF와 보충 CM의 2.5ml를 추가합니다. 10ng/ml bFGF, 피펫 세포 현탁액 위, 아래로 세 번 함께 보충 CM의 적절한 볼륨에 hESC 펠렛을 Resuspend. (참고 : 분리를위한 hESCs가 Matrigel 접시에서 온 때, 대단히 짧은 휴식을 매우 쉽게 않으므로 pipetting 3 번을 충분하고 더 식민지를 오버 방해와 단일 세포를 만들 수 있습니다 pipetting.) 나누어지는은 당 hESC의 대단히 짧은 시간 서스펜션 0.5 ML 잘 6 잘 Matrigel 판의 최종 볼륨으로 당 3ml 잘 달성하기 위해. 37 ° C 배양기에서 접시를 놓습니다. </li></ol> immunofluorescence 현미경에 의해 pluripotency 마커 감지 Immunofluorescence 현미경은 culturing 동안 hESC pluripotency 마커 월 4 SSEA - 4의 표현을 확인하는 데 사용됩니다. <ol><li> 잘 하나에서 미디어를 기음과 1 × PBS 세척, 산도 7.4. 10 분에 대한 수정을 잘하기 위해 3.7 %의 포름 알데히드 2ml를 추가합니다. </li><li> 두 분 -20에서 잘과 장소 ° C에 2ml 메탄올을 추가 1xPBS, pH를 7.4로 씻어. </li><li> 5 분 알부민 0.2 % 소 serume (BSA)의 1ml와 1xPBS, 산도 7.4, 그리고 블록 린스. </li><li> 월 4 anti-h/mSSEA-4 항체 (0.2 % BSA에 1:200 희석)의 1ml을 추가하고, 1 시간 또는 4 ° C에서 하룻밤 실온에서 알을 품다. (참고 : SSEA - 4 염색법을위한 6 단계로 바로 진행합니다) </li><li> , 1xPBS, pH를 7.4로 세 번 씻어 FITC - 복합 토끼 IgG (0.2 % BSA에 1:500 희석), 그리고 1 시간에 대한 실온에서 부화를 추가합니다. </li><li> 1xPBS, 산도 7.4 3 번 씻어하고 잘의 중심에 (핵 시각화가 원하는 경우 DAPI를 포함할 수 있습니다) 장착 솔루션의 한 방울을 넣어. 매니큐어와 인감, 세포의 상단에 coverslip을 넣어, 그리고 immunofluorescence 현미경에 의해 평가합니다. </li></ol> 인간 배아 줄기 세포 영수증 ES 미디어 (배아의 줄기 세포 미디어) : DMEM/F12 - 400ml 마네 세럼 Replacer - 100ml 비 - 필수 아미노산 - 5ml 200mM GlutaMax / BME 솔루션 - 5ml 페니실린 / 스트렙토 마이신 - 5ml 4 잘 섞어 500ml 병의 최종 hESC 문화 미디어를 저장 ° C. 2 주간 최대 좋아. MEF 문화 미디어 : DMEM - 1000ml FBS - 100ml 비 - 필수 아미노산 - 10ml 글루타민 - 10ml Penicllin / 스트렙토 마이신 - 10ml 잘 믹스 4에서 최종 MEF 문화 미디어를 저장 ° C. 200mM Glutamax / BME 솔루션 : Glutamax - 100ml β - 메르 캅 토 에탄올 (14.3M에 증권 솔루션) - 140 μ1 이 잘 그리고 솔루션 나누어지는의 10ml의 일부를 섞는다. -20 ° C.에 aliquots 유지 bFGF 솔루션 (재고의 최종 농도 : 10 마이크로 그램 / ML) : bFGF (FGF2) - 50 μg 1xPBS에 0.​​1 % BSA, 산도 7.4 - 5ml 10 μg / ML 주식을하기 위해 5ml 0.1 % BSA에 bFGF 50 마이크로 그램을 디졸브. 500 μl 부분으로 나누어지는. -80에서 보관 ° C. Collagenase IV 솔루션 (1mg/ml) : Collagenase IV - 50mg DMEM/F12 미디어 - 50ml 50ml 팰컨 튜브에 collagenase IV 가루를 추가합니다. 후드에서 무균 DMEM/F12 미디어 50ml에 섞는다. &lt;1 분 소용돌이 솔루션입니다. 가루가 해산되어 있는지 확인합니다. 후드에서 새 살균 50ml 팔콘 튜브에 필터 0.22 μm의 통과. 이 솔루션은 4 저장된 이주의 최대 ° C.에 좋습니다 Dispase 솔루션 (1mg/ml) : Dispase 5mg/ml - 2ml DMEM/F12 미디어 - 8ml -20 ° C.에서 나누어지는 상업 5mg/ml의 Dispase 솔루션과 저장 DMEM/F12를 사용 1mg/ml로 dispase을 희석. 이 솔루션은 4에서 1 주일 동안 보관 가능 ° C.

<ol>
	<li>Thomson, J. a. m. e. s. A., Itskovitz-Eldor, J. o. s. e. p. h., Shapiro, S. a. n. d. e. r. S., Waknitz, M. i. c. h. e. l. l. e. A., Swiergiel, J. e. n. n. i. f. e. r. J., Marshall, V. i. v. i. e. n. n. e. S., Jones, J. e. f. f. r. e. y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts+.">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts .</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Xu, C. h. u. n. h. u. i., Inokuma, M. a. r. g. a. r. e. t. S., Denham, J. e. r. r. o. d., Golds, K. a. t. h. a. l. e. e. n., Kundu, P. r. a. t. i. m. a., Gold, J. o. s. e. p. h. D., Carpenter, M. e. l. i. s. s. a. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells+Nature+Biotechnology+19."> Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells Nature Biotechnology 19.</a> Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).</li></ol>

3 동영상이 시리즈는 (MEF) 피더 세포 (비디오 1) 어떻게 통로를 피더 셀 - 무료 접시 (비디오 2) Matrigel을하고, 방법을 유지하기 위해 마우스 배아 fibroblast에서 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)를 성장하는 방법을 보여줍니다 Matrigel 피더 셀 무료 조건 (동영상 3) passaging하여 hESCs. 많은 이전의 연구는 실용적, undifferentiated hESCs의 유지 보수가 inactivated MEF 피더 세포에 대한 문화를 필요로했다. 그러나 대부분의 실험, 피더 세?...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Knockout Serum Replacer (KSR)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>10828-028</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>11330-057</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td> Non-essential Amino Acids</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>11140-050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GlutaMax </td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>35050-061</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>11995-065</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Clontech</td>
<td>631107</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>25030-081</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BME</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP176-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>bFGF</td>
<td>Reagent</td>
<td>R&D Systems</td>
<td>233-FB-025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase IV</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>17104-019</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dispase</td>
<td>Reagent</td>
<td>Stem Cell Technologies</td>
<td>17105-041</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin / Streptomycin </td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gelatin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Chemicon</td>
<td>ES-006-B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Matrigel</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>354277</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oct-4 antibody</td>
<td>Reagent</td>
<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
<td>SC-9081</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>anti-h/mSSEA-4 Phycoerythrin Conjugated Mouse IgG3</td>
<td>Reagent</td>
<td>R&D Systems</td>
<td>FAB1435P</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FITCI-conjugated antirabbit IgG</td>
<td>Reagent</td>
<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories. Inc.</td>
<td>715-095-152</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
			<div>
					</div>

from mefs to matrigel 3: passaging hescs from matrigel onto matrigel

이 동영상은 피더 세포가없는 조건에서 어떻게 피더에서 연속 통과 hESCs 세포가없는 조건에 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)의 성장을 유지하는 방법을 보여줍니다. hESC의 확인은 pluripotency immunofluorescence 현미경으로 피더 셀없는 조건을 재배도 증명됩니다.

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From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

이 동영상은 피더 세포가없는 조건에서 어떻게 피더에서 연속 통과 hESCs 세포가없는 조건에 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)의 성장을 유지하는 방법을 보여줍니다. hESC의 확인은 pluripotency immunofluorescence 현미경으로 피더 셀없는 조건을 재배도 증명됩니다. 3 부 3.

MEFs에서 Matrigel 3 : Matrigel에 Matrigel에서 Passaging hESCs

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage ...

from-mefs-to-matrigel-3-passaging-hescs-from-matrigel-onto-matrigel

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13.7K 조회수.  University of California, Los Angeles. 이 동영상은 피더 세포가없는 조건에서 어떻게 피더에서 연속 통과 hESCs 세포가없는 조건에 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)의 성장을 유지하는 방법을 보여줍니다. hESC의 확인은 pluripotency immunofluorescence 현미경으로 피더 셀없는 조건을 재배도 증명됩니다. 3 부 3.