Yukarıda anlatılan özgün araştırma, NSF hibe 0344630 tarafından desteklenen oldu.

Kanama ile ilgili at nalı yengeci anatomik özellikleri (Şekil 1) <img src="files/ftp_upload/old/958_2008_10_3_0/958_Figure-01.png" alt="Şekil 1" width="389" height="259" /> Şekil 1 <ol><li> Vücudun üç ana bölümden posterior anterior (P), zehir opisthosoma (O), ve telzon (T) 1. </li><li> Zehir anterior ve lateral kenar boşlukları flanş. </li><li> Telzon dile opisthosoma en arka girinti, terminal koy. </li><li> Zehir ve opisthosoma ifade eklemi menteşe (H). </li><li> Kalp prostoma ve opisthosoma 2 (Şekil 2) karapaksla altında, dorsal orta hat boyunca yer alır. <img src="files/ftp_upload/old/958_2008_10_3_1/958_Figure-02.png" alt="Şekil 2" width="329" height="414" /> Şekil 2 </li></ol> Genel hususlar, kısırlık ve lipopolisakkarid maruz kalmaktan koruma (endotoksin) <ol><li> Başarılı kanama en büyük düşmanı, hücre topaklanma, ekzositoz ve coagulin pıhtı oluşumu. Hücre agregasyonu ve ekzositoz lipopolisakkarid (aka, endotoksin, LPS), bir ürünü Gram-negatif bakteriler tarafından uyarılır. - LPS yıkanmış hücreleri ekzositoz için eşik konsantrasyonu 0.1 1 mg / ml plazma askıya hücreleri belirgin olarak düşük konsantrasyonlarda 3 aktive edilir . Basit bir otoklav tarafından inaktive Endotoksin ve yüzeyler üzerinde mevcut olması kabul edilebilir çözümleri ve endotoksin ücretsiz sertifikalı değildir reaktifler. </li><li> Kan toplama sırasında pıhtılaşma olasılığını azaltmak için, sadece mükemmel bir kanama, hasarsız hayvanlar seçin. 4 ° C oda hayvanlar 1-2 saat Pre-chill. Steril tekniği uygulayın. Endotoksin ile kirlenme kaçının. </li><li> LPS-free% 3 salin klinik tıp alanında kullanılan ve tıbbi tedarikçilerden satın alınabilir (özel reaktifler ve sarf malzemeleri tabloya bakınız). LPS 180 ° C&#39;de 4 saat inkübasyon cam ve metal çıkarılabilir. Steril tek kullanımlık enjektör iğneleri, Petri tarzı kültür yemekleri, ve vida kapaklı santrifüj tüplerine LPS-free ve uzun nedenle uygun steril tekniği uygulandığı gibi hiçbir değişikliğe gerek olmadan kullanılabilir. </li><li> Farklı hayvanların kan hücrelerinin istikrarı, hayvan büyük bir itina ile motora bile coagulin pıhtı oluşumu ile sonuçlanan spontan degranülasyonu geçiren bazı bireysel hayvan hücreleri ile farklıdır. Kan hücreleri, diğer bireysel at nalı yengeçleri uygun prosedürleri takip edilir, plazma hücreleri kanama ve ayırma sırasında tam taneli kalır anlamlı olarak daha istikrarlı ve. </li><li> Çeşitli ajanlar kanama da dahil olmak üzere kafein (LPS-free% 3 NaCl 0.25 hacim 10 mM kafein içine kanayarak) 4, propranolol (1 mM final konsantrasyon) 5, dimethylsülfoksit 6, kalsiyum katyon şelasyon (kan hücreleri, stabilize bildirilmiştir 0.1 M dekstroz, 0.03 M sodyum sitrat, 0,026 M sitrik asit, 10 mM disodyum ethylenediaminetetraacetic asit (Na 2 EDTA), pH 4.6) 7, G-protein ve fosfolipaz-C yollar inhibitörleri (kolera ve eşit bir hacim içine kanayarak pertussus toksinler, U73122) 8, klorür ikame İsethiyonat anyon 9, klorür kanal blokerleri 9, siklik-AMP antagonistleri 9, sülfidril reaktifler (5 mM N-etil maleimide, NEM) 5, ve membran-aktif deterjan Tween-20 ( 0,1 hacmi% 2 LPS-free 0.5 M NaCl Tween-20) yayılabilir. </li></ol> Sarf Malzemeleri ve at nalı yengeci kanama reaktifler: büyük miktarda kan toplama <ol><li> bir ya da daha büyük hasar at nalı yengeci </li><li> % 70 etanol içeren püskürtme şişesi </li><li> Kimwipes </li><li> 14 iğne </li><li> sağlam forseps </li><li> buz buz kovası </li><li> 50 ml vidalı kapaklı plastik tek kullanımlık santrifüj tüplerine </li><li> 50 ml tüpler tutmak için raf </li><li> karşı-üst santrifüj </li><li> steril 50 ml serolojik pipetler </li><li> ampul tipi pipet dolgu </li><li> tek kullanımlık steril filtre cihazı </li><li> vakum pompası </li><li> LPS-free% 3 NaCl (kan hücrelerinin toplanması için) </li><li> Tween-20 (kan hücrelerinin toplanması için) </li></ol> Büyük hacimli kanama için hazırlıklar <ol><li> Kanama, büyük, hasarsız hayvanlar kullanın. Hayvan kanama önce soğuk bir odada 1 saat soğutun. </li><li> Yaklaşık 0.3 metre yüksekliğinde (tek strafor koliyi, soğuk ya da dondurulmuş reaktifler e-posta için uygun) ve operatör için düşük bir sandalye, bir buz kovası için istikrarlı bir desteği ile rahat bir düzenleme oluşturulması. Buz kovası destek yapısı üzerine yerleştirilir ve sandalye çizilirBu birim. Dirseklerinizi uyluk üzerinde duran sandalyede bir süre için rahat bir oturma ve buz kova buz yatak dik propped kan alma tüpleri üzerine yerleştirilmiş bir mücadele at nalı yengeci tutan sol el ile olmalıdır. </li><li> Ön-chill 4 - 6 buz banyosu vida kapakları olan 50 ml tek kullanımlık plastik santrifüj tüplerine. Tüpler arasında buz banyosunda konteyner çevresinde buz dik olarak ayarlanır. Sadece kanayan işlemi başlamadan önce, steril tekniği bağlı kalarak, yandaki tabloya tüpleri ve yer kapakları kapaklarını çıkarın. </li><li> 14 ga iğne kapağını çıkarın ve iğne ile kol gevşetmek için sağlam forseps kullanımı, ancak kol iğne çıkarmayın. Sterilite BAKIMI. PARMAK İLE İĞNE HERHANGİ BİR KISIM TOUCH VERMEYİN. Yeri maruz popo iğne ile bitişik bir tezgahın üzerine iğne ile kol, sterilite korumak için herhangi bir yüzeye temas etmesinin yükselmiş. </li><li> Kimwipe% 70 etanol ile ıslatın. </li></ol> Hayvan Kanama (özellikle sağ elini kullanan operatör için) <ol><li> Zehir ön flanş ve kuyruk tabanı (terminal koy) opisthosma arka kısmı kavrama başparmak ile temas eden dört parmakları ile sol elin kavrama hayvan: Kanama Holding hayvan. Hayvan ventral elinizin avuç içi karşı karşıya. Telzon bilek üzerinden başparmak ve projelerin tabanı boyunca yatıyor. Hayvan, zehir ve opisthosoma başka bir (Şekil 3a) dik açı olduğunu nazikçe kadar esnetin. <img src="files/ftp_upload/old/958_2008_10_3_2/958_Figure-03.png" alt="Şekil 3" width="360" height="360" /> Şekil 3 </li><li> Uygulanan% 70 etanol ile maruz menteşe ortak bağlayan zehir ve opisthosoma temizleyin etanol-nemlendirilmiş Kimwipe (Şekil 3b). </li><li> 4 üst ve hayvan dorsal yüzey yukarı bakacak - 2 parmakları olduğu gibi sol döndürün. Sağ eli ile sol elin parmakları 2 ile 3 arasında, hala koruyucu kol, 14 ga şırınga iğnesi takın. Forseps sağ el atın ve koruyucu kol forseps (Şekil 3c) ile popo tutarak iğneyi çıkarın. Sol elin elin o sol, başparmak dorsal yüzleri ve işaret parmağı ve hayvan sağ el dönük sırt yüzeyi ile ters çevirin. Iğnenin sivri ucuna iğne mili dorsal orta hat (Şekil 3d) paralel olduğunu eklem ve menteşe işaret böylece 50 ml toplama tüpleri ve yönlendirmek hayvan ilk olarak yukarıda popo iğne yerleştirin. Iğne dorsal orta hatta paralel olarak konumlandırılmış ve orta hat ve hala toplama tüpünün açılışı üzerine yerleştirilmiş iğne popo ile eklenen tutarak, kalp lümenine menteşe eklem üzerinden iğnenin sivri ucunu takın. - Iğne yaklaşık 1 zehir kalp kısmı derinliklerine 2 cm eklenir. Kısa sürede kalp delinmiş gibi kan (Şekil 4a, ok) hızla akacaktır, bu yüzden şırınga iğne teslim sonunda bu ilk dalga kan toplamak için, toplama tüpünün ağız üzerine yerleştirilmiş olduğundan emin olmak için önemlidir. </li><li> 50 ml kan toplanmış, tek tek damla (Şekil 4b) yavaş - Kan, yaklaşık 30 sonra sürekli bir akış, başlangıçta kalp çıkacaktır. Kan akışını arttırmak için, yeniden yönlendirmek ucu hafifçe iğne için iyi bir politika olabilir. , Sol ya da sağ iğne kadar yatırın ya da aşağı; ucu kalbin derinliklerine slayt veya kan akışını optimize konumunu bulmak için ortak menteşe yakın çekin. Bu riskler hayvan zarar ve ekstravaze kan pıhtılaşması başlatmak için neden olabilir, çünkü, aşırı hayvan sıkıştırmak değil. <img src="files/ftp_upload/old/958_2008_10_3_3/958_Figure-04.png" alt="Şekil 4" width="360" height="360" /> Şekil 4 </li><li> Her bir toplama tüpüne kan ile dolduğu gibi, iğne teslim sonu altında bir sonraki boş tüp getirmek için buz banyosu döndürün. </li><li> Kanama yavaşlar gibi, iğne içine ve kalp içine retrograd yönde hava akışı olan riski çalıştırın. Hayvan düzleşir Bu, böylece kan basıncı azaltarak oluşabilir. Fleksiyon pozisyonunda hayvan sağlamak ya da sadece yavaş meydana doğrultma izin Bunu önlemek için deneyin. </li><li> Hayvan vererek kan durduğunda kalp kanama iğne çıkarın. Re-cap toplama tüpleri ve masa üstü santrifüj, 1000 RPM, 5 dakika hemen santrifüj. Kan hücreleri toplama tüpleri diplerinde kompakt pelet oluşturacaktır. Kan pıhtılaşması için tüm bileşenleri, kan hücrelerinin sekretuar veziküller içinde bulunduğundan, en kısa sürede plazma hücreleri ayrılırplazma pıhtılaşma riskini elimine edilir. </li><li> Ekstravaze kan pıhtılaşmasını önlemek için şarttır. Kan santrifüj hemen; hayvan nazik taşıma; kan şırınga iğnesi dışarı aktığı hızla azaltılması Ön soğutma hayvan ve bir buz banyosunda toplama tüpleri korumak: Aşağıdaki önlemler pıhtılaşma riskini azaltmak sonra toplama, iğneler ve endotoksin ile toplama tüpleri kirlenmesini kaçınma, steril prosedür bakım. Yukarıda da değinildiği gibi, bazı bireysel hayvanlar, bu önlemler uyulduğunda bile ekzositoz başlatmak, özellikle irritabl kan hücreleri vardır. </li><li> Santrifüj sonra, kan pıhtılaşması belirtileri, tüpleri incelemek hücreleri ve jelatinimsi bir pıhtı malzeme ipliklerini, tüp duvarları pıhtı üstündeki jelatinimsi malzeme, ya da içinde sıkışıp kalan kan hücreleri ile pıhtı kötüsü, büyük miktarlarda bağlı sıvı sütununda (Şekil 4c, ok). Bu tüpler malzeme, plazma, serum, ve kan hücrelerinden salgılanan ürünleri içerir. </li><li> 50 ml steril serolojik pipet ile steril tüplere plazma aktarın. Tüp alt hücre pelletini hücrelerin herhangi bir aspire önlemek için pipetleme zaman dikkatli olun. Pelet yukarıda plazma hücre pelletini rahatsız etmemek için birkaç mL bırakmak en iyisidir. </li><li> Yukarıda açıklanan prosedür, kan hücrelerinin salgı ürünleri kirlenmemiş plazma büyük miktarlarda toplamak için tasarlanmıştır. Geniş hacimli yıkanmış kan hücreleri toplamak için,% 2 Tween-20 0.1% 3 LPS-NaCl çözünmüş birimlere kan toplamak. Gevşek bir hücre pelet kurmak için 10 dakika boyunca hafifçe hücreleri Santrifüj LPS-free% 3 NaCl birkaç değişiklik ile, daha sonra hücrelerin yıkayın. Kan hücrelerinin sekretuar ürünleri içeren hücrelerin bir özü LPS-free distile suda yıkanmış hücrelerinin parçalanması tarafından hazırlanan olabilir. Bu lizat, çeşitli bir dizi anti-mikrobiyal bağışıklık 10,11 faaliyet proteinler ve peptitler içerir ve aynı zamanda coagulogen, ekstrasellüler kan pıhtısı yapısal protein zimojen formu ve coagulin için coagulogen dönüştürmek proteazların koleksiyonu içerir pıhtı 12 fibriller içine polimerize protein şeklinde. Bu ekstresi 13 lipopolisakkarid varlığı tahlil için kullanılan ticari bir ürün, Limulus amebocyte lizat veya LAL benzer. LPS 14 coagulin coagulogen proteolitik değişiklik sorumlu proteaz kaskad devreye girer. </li><li> Kanama sonrası hayvanların Bırakma. Yukarıda tanımlanan yöntemlerle yapılan Kanama hayvan tarafından iyi tolere edilir. Woods Hole Deniz Biyoloji Laboratuvarı çalışırken, ben, onlar hayatta kalmak edeceği beklentisi ile kanama sonra okyanus için hayvanların geri. Hayvanlar, at nalı yengeçleri normal aralığın uzak akvaryumundaki tutulur, onlar bir kez ya da ayda iki kez tekrar tekrar kanadı olabilir. Aşağıda açıklandığı gibi, esaret altında tutulan hayvanların sağlığını korumak için yüksek kaliteli su ve sık beslenme gerektirir. Ötenazi, dorsal orta hat gözler arasında yer almaktadır dorsal ganglion, imha yapılabilir. </li></ol> Plazma işlenmesi ve saklanması <ol><li> Proteazlar ile korunması. Plazma protein saflaştırılması için kullanılacak ise, hemen sonra proteaz inhibitörleri ile tedavi edilmelidir. 1 mM nihai konsantrasyonu phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) ekleyin. PMSF DMSO veya etanol 0.1 M stok solüsyonu olarak tutulur. Su 15 derece istikrarsız, böylece kalıcı koruma için dayanıyordu olamaz, ancak kan hücrelerinin plazma ayrılması hemen sonra ek hücreleri serbest bırakıldı olabilir proteazların küçük miktarlarda inaktive edecek. </li><li> Steril filtre: 0.22 mm gözenek filtresi ile donatılmış bir tek orta-filtrasyon cihazı ile vakum altında ultrafiltrasyon plazma sterilize edin. Bu filtreler tıkanmasına bir eğilim var. Bu sorunu azaltmak için filtreleme önce plazma santrifüj tavsiye edilir. Plazma geniş hacimli işlenir, sonra, ilk olarak 0.45 mm gözenek boyutu Millipore filtre ile 1 mm gözenek boyutu ile Millipore filtre kullanarak ön filtre, plazma önerilir. </li><li> Plazma NaN 3 nihai konsantrasyonu 0.2 mg / ml ekleyerek veya steril filtrasyon ya bakteriyel kontaminasyondan korunacaktır. Bir anestezi plazma, bir ya da bu anti-bakteriyel tedbirlerin alındığını olmadan 2 gün daha daha uzun süre saklanabilir asla. </li><li> Kanın pıhtılaşması. Limulus plazma memeli pıhtılaşma sisteminin aksine, kan pıhtılaşması için hiçbir unsurları içerir. Bunun yerine, pıhtı oluşumu, pıhtı yapısal protein (coagulogen) ve proteazlar sistemi için tüm makine süreci coagulogeçözünmez pıhtısı haline polimerize yetenekli hale n kan hücreleri (16) salgı granülleri bulunur. Ekzositoz geçmesi için bir şans var önce kan hücreleri kaldırılır eğer öyleyse, plazma pıhtılaşma için proteinlerin tamamen ücretsiz ve süresiz sıvı kalacaktır. </li><li> Proteinlerin saflaştırılması. Hemosiyanin 40 mg / ml plazmada bulunan ve 70 kDa altbirim 48-mer. Ultrasantrifügasyon (40.000 X g, 8 saat) veya jel filtrasyon BioGel A5m 17 gibi büyük bir gözenek boyutu dışlama reçine ile izole edilebilir. C-reaktif protein, 1 - 5 mg / ml ve bir kalsiyum şelasyon 18 elüsyon, phosphorylethanolamine-sepharose benzeşme izolasyonu ile izole edilebilir. Geniş spektrumlu bir proteaz inhibitörü, 2-macroglogulin 19, hemosiyanin ve C-reaktif protein kaldırıldı jel filtrasyon ile S-300 reçine sonra Sephacryl saflaştırılmış olmuştur. </li></ol> Hareketli kültür kan hücrelerinin mikroskobik inceleme <ol><li> In vitro amebocyte çimler Kurulması:% 3 NaCl LPS-steril plastik Petri tarzı kültür yemekleri (35 mm tabak, 60 mm yemek için 2.5 ml, 90 ml yemek için 6 ml için 1 ml) eklenir. Kan daha sonra yukarıda anlatılan yöntemi kullanarak kalp ponksiyonu ile elde edilen, ancak değişiklik ile 23 gauge steril bir enjektör iğnesi, 1 adet 14 gauge iğne yerine kullanılır. Kan 23 iğne damla damla akar ve 1 damla, 35 mm bulaşık, 60 mm çanak içine 3 damla ve 9 damla 100 mm çanak içine toplanır. Kan hücreleri daha sonra geri ve ileri, sonra dairesel bir desen nazik dönen ilk% 3 NaCl düzgün karıştırılır. Hazırlık, kan hücreleri çanak yüzey eklemek için izin oda T 5 dakika inkübe edilir, sonra başlangıç ​​serum fizyolojik tercih 3 tamponu ile değiştirilir . </li><li> Undegranulated bir durumda alt tabaka bağlı kan hücreleri korumak için istenirse, ilk tuzlu kan plazma karışımı taze LPS-free% 3 NaCl ile değiştirilir. Plazma LPS yokluğunda bile kan hücrelerinin spontan degranülasyonu hızlandırır ve kaldırma hücrelerin undegranulated durumu stabilize. </li><li> Ilk tuzlu su steril plazma ile değiştirilir ise, kan hücreleri dolaşımdaki kan hücresi (Şekil 5), oval şekle dönüştürmek ve alt tabaka üzerine düzleştirmek ve sonra degranülasyonu ve bir katman, coagulin ekstrasellüler kan pıhtısı oluşumunu başlatmak basık amebocytes 20 çim üzerinde. <img src="files/ftp_upload/old/958_2008_10_3_4/958_Figure-05.png" alt="Şekil 5" width="300" height="201" /> Şekil 5 </li><li> Toplu amebocytes eksplant kültürleri kurulması. Kan, steril LPS-koşullar altında toplanan olduğunda, kan hücreleri, doku gibi kitle oluşturmak için süspansiyon ve agrega yerleşmek. Bunun için uygun bir kap, 180 0 C&#39;de 4 saat süreyle inkübasyon LPS-free olarak sunulan cam embriyo yemektir 1 için 19 gauge iğne kullanılarak kardiyak ponksiyon bu kapta toplanan Kan inkübe - 2 saat sonra oda T, 1 mm kare amebocyte toplam 18 gauge steril bir şırınga iğnesi ile kesilmiş parçalar ve iki coverglasses veya arasında sıkışmış coverglass ve ayırıcılar olarak hareket etmek coverglasses parçaları ayrılmış bir slayt. Yaklaşık yarım saat sonra, faz kontrast ya da DIC optik 21 ile görülebilir (Şekil 6a), coverglass üzerine amebocytes eksplant çevreden göç başlar . Başlangıçta, göç hücreleri göç alt tabaka üzerinde genişletilmiş hiyalin pseudopods (Şekil 6b (m)) ile kompakt ve daha sonra temas yüzeyi ile indirdi ve ileriye doğru hareket pseudopod 22 granüler sitoplazma akışını içerir . Daha sonra, hücreler düzleştirmek (Şekil 6b (f)) ve degranülasyonu başlatmak (Şekil 6b (d)) ve lokomosyon 23 ateşkes. Burada açıklanan kültür odası, hücre motilite ve granül ekzositoz 9 üzerindeki etkilerini araştırmak amacıyla kültür odasına farklı deneysel ajanlar perfüzyon sağlar . 24 amebocyte kültür mikroskobik inceleme için uzun bir metodolojik gözden bulunabilir. <img src="files/ftp_upload/old/958_2008_10_3_5/958_Figure-06.png" alt="Şekil 6" width="480" height="327" /> Şekil 6 </li></ol> Akvaryumları yetişkin at nalı yengeçleri Bakım At nalı yengeçleri, yüksek kalite deniz suyu gerektiren ve partikül, havalandırma ve su 25 denitrifikasyon sağlayan bir su arıtma sistemi ile donatılmış akvaryumlarında korunabilir . Hayvanlar, karides, ıstakoz, balık veya kalamar haftada 2 veya 3 kez beslenmelidir. Beslenme, akvaryum, pla hayvan kaldırarak yapılırsırtında dans ediyorum, gıda ve ağzına yerleştirerek. Aç, hayvan yakında gıda yutma başlayacak. , Deniz suyu ayrı bir kapta defecates veya beslenme başladıktan sonra akvaryum iade edilebilir kadar deniz suyu sisteminin gelişmişliği bağlı olarak, bir saat ya da hayvan muhafaza edilmelidir. Uzun vadeli bakım için, hayvan karapaksla yüzeyi yeşil ya da mavi-yeşil alglerin gelişimini engellemek için ışıktan uzakta muhafaza edilmelidir. Algler karapaksla aşındırmak ve yetişkin molt olmadığından, bu 26 hayvanın ölümüne neden olacaktır. Vahşi hayvanların kısmen kuma gömülü zaman çok harcamak, ama akvaryum kum veya çakıl uzun vadeli bakım için temizlik önemli seviyede tutmak için bir zorluk sunuyor.

<ol>
	<li>Lochhead, J. H., Brown, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+Invertebrate+Types.">Selected Invertebrate Types.</a> , 360-381 (1950).</li><li>Shuster, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+circulatory+system+and+blood+of+the+horseshoe+crab+Limulus+polyphemus+L.:+a+review.">The circulatory system and blood of the horseshoe crab Limulus polyphemus L.: a review.</a> US Dept Energy, Fed Regul. Comm. , (1978).</li><li>Conrad, M. L., Pardy, R. L., Wainwright, N., Child, A., Armstrong, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+the+blood+clotting+system+of+the+American+horseshoe+crab,+Limulus+polyphemus,+to+a+novel+form+of+lipopolysaccharide+from+a+green+alga.">Response of the blood clotting system of the American horseshoe crab, Limulus polyphemus, to a novel form of lipopolysaccharide from a green alga.</a> Comp Biochem. Physiol A Mol. Integr. Physiol. , 144-423 (2006).</li><li>Nakamura, T., Morita, T., Iwanaga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+proclotting+enzyme+in+limulus+(Tachypleus+tridentatus)+hemocytes:+its+purification+and+properties.">Intracellular proclotting enzyme in limulus (Tachypleus tridentatus) hemocytes: its purification and properties.</a> J. Biochem. (Tokyo. 97, 1561-1574 (1985).</li><li>Levin, J., Ornberg, R. L., Cohen, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+Cells+of+Marine+Invertebrates:+Experimental+Systems+in+Cell+Biology+and+Comparative+Physiology.">Blood Cells of Marine Invertebrates: Experimental Systems in Cell Biology and Comparative Physiology.</a> , 259-260 (1985).</li><li>Liang, S. M., Liu, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+Limulus+coagulation+system:+inhibition+of+activation+of+the+proclotting+enzyme,+by+dimethyl+sulfoxide.">Studies on the Limulus coagulation system: inhibition of activation of the proclotting enzyme, by dimethyl sulfoxide.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 105, 553-559 (1982).</li><li>Soderhall, K., Smith, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+the+haemocyte+populations+of+Carcinus+maenas+and+other+marine+decapods,+and+prophenoloxidase+distribution.">Separation of the haemocyte populations of Carcinus maenas and other marine decapods, and prophenoloxidase distribution.</a> Dev. Comp Immunol. 7, 229-239 (1983).</li><li>Solon, E., Gupta, A. P., Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+during+exocytosis+in+Limulus+polyphemus+granulocytes.">Signal transduction during exocytosis in Limulus polyphemus granulocytes.</a> Dev. Comp. Immunol. 20, 307-321 (1996).</li><li>Armstrong, P. B., Rickles, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin-induced+degranulation+of+the+Limulus+amebocyte.">Endotoxin-induced degranulation of the Limulus amebocyte.</a> Exp. Cell Res. 140, 15-24 (1982).</li><li>Iwanaga, S., Kawabata, S., Shuster, C. N., Barlow, R. B., Berkman, L., Brockmann, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+phylogeny+of+defense+molecules+associated+with+innate+immunity+in+horseshoe+crab.">Evolution and phylogeny of defense molecules associated with innate immunity in horseshoe crab.</a> Front Biosci. 3, (1998).</li><li>Armstrong, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+American+Horseshoe+Crab.">The American Horseshoe Crab.</a> , 288-309 (2003).</li><li>Iwanaga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+limulus+clotting+reaction.">The limulus clotting reaction.</a> Curr. Opin. Immunol. 5, 74-82 (1993).</li><li>Levin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Limulus+amebocyte+lysate+test:+perspectives+and+problems.">The Limulus amebocyte lysate test: perspectives and problems.</a> Prog. Clin. Biol. Res. 231, 1-23 (1987).</li><li>Koshiba, T., Hashii, T., Kawabata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+perspective+on+the+interaction+between+lipopolysaccharide+and+factor+C,+a+receptor+involved+in+recognition+of+Gram-negative+bacteria.">A structural perspective on the interaction between lipopolysaccharide and factor C, a receptor involved in recognition of Gram-negative bacteria.</a> J. Biol. Chem. 282, 3962-3967 (2007).</li><li>James, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+the+protease+inhibitor+phenylmethylsulfonyl+fluoride+in+buffers.">Inactivation of the protease inhibitor phenylmethylsulfonyl fluoride in buffers.</a> Anal. Biochem. 86, 574-579 (1978).</li><li>Murer, E. H., Levin, J., Holme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+studies+of+the+granules+of+the+amebocytes+of+Limulus+polyphemus,+the+horseshoe+crab.">Isolation and studies of the granules of the amebocytes of Limulus polyphemus, the horseshoe crab.</a> J. Cell Physiol. 86, 533-542 (1975).</li><li>Decker, H., Ryan, M., Jaenicke, E., Terwilliger, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDS+induced+phenoloxidase+activity+of+hemocyanins+from+Limulus+polyphemus,+Eurypelma+californicum+and+cancer.">SDS induced phenoloxidase activity of hemocyanins from Limulus polyphemus, Eurypelma californicum and cancer.</a> , 276-17796 (2001).</li><li>Armstrong, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytolytic+function+for+a+sialic+acid-binding+lectin+that+is+a+member+of+the+pentraxin+family+of+proteins.">A cytolytic function for a sialic acid-binding lectin that is a member of the pentraxin family of proteins.</a> J. Biol. Chem. 271, 14717-14721 (1996).</li><li>Armstrong, P. B., Melchior, R., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humoral+immunity+in+long-lived+arthropods.">Humoral immunity in long-lived arthropods.</a> J. Insect Physiol. 42, 53-64 (1996).</li><li>Armstrong, P. B., Armstrong, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+decorated+clot:+Binding+of+agents+of+the+innate+immune+system+to+the+fibrils+of+the+limulus+blood+clot.">The decorated clot: Binding of agents of the innate immune system to the fibrils of the limulus blood clot.</a> Biol. Bull. 205, 201-203 (2003).</li><li>Armstrong, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+the+motile+blood+cells+of+the+horseshoe+crab,+Limulus.+Studies+on+contact+paralysis+of+pseudopodial+activity+and+cellular+overlapping+in+vitro.">Interaction of the motile blood cells of the horseshoe crab, Limulus. Studies on contact paralysis of pseudopodial activity and cellular overlapping in vitro.</a> Exp. Cell Res. 107, 127-138 (1977).</li><li>Armstrong, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motility+of+the+Limulus+blood+cell.">Motility of the Limulus blood cell.</a> J. Cell Sci. 37, 169-180 (1979).</li><li>Armstrong, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+and+spreading+of+Limulus+blood+cells+on+artificial+surfaces.">Adhesion and spreading of Limulus blood cells on artificial surfaces.</a> J. Cell Sci. 44, 243-262 (1980).</li><li>Armstrong, P. B., Cohen, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+Cells+of+Marine+Invertebrates.">Blood Cells of Marine Invertebrates.</a> Lab. Animal. , 253-258 (1985).</li><li>Smith, S. A., Berkson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+culture+and+maintenance+of+the+horseshoe+crab+(Limulus+polyphemus).">Laboratory culture and maintenance of the horseshoe crab (Limulus polyphemus).</a> Lab. Animal. 34, 27-34 (1980).</li><li>Leibovitz, L., Lewbart, G. A., Shuster, C. N., Barlow, R. B., Brockmann, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+American+Horseshoe+Crab.">The American Horseshoe Crab.</a> , 245-275 (2003).</li><li>Rudkin, D. M., Young, G. A., Nowlan, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oldest+horseshoe+crab:+a+new+xiphosurid+from+Late+Ordovician+Konservat-Lagerstatten+deposits.">The oldest horseshoe crab: a new xiphosurid from Late Ordovician Konservat-Lagerstatten deposits.</a> Palaeontology. 51, 1-9 (2008).</li><li>Shuster, C. N., Sekiguchi, K., Shuster, C. N., Barlow, R. B., Brockmann, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The American Horseshoe Crab. , 103-132 (2003).</li><li>Walls, E. A., Berkam, J., Smith, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+horseshoe+crab,+Limulus+polyphemus,+200+million+years+of+existence,+100+years+of+study.">The horseshoe crab, Limulus polyphemus, 200 million years of existence, 100 years of study.</a> Rev. Fisheries Sci. 10, 39-73 .</li><li>Patten, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Evolution+of+the+Vertebrates+and+Their+Kin.">The Evolution of the Vertebrates and Their Kin.</a> P. Blakiston's Son and Co. , 195-209 (1912).</li></ol>

At nalı yengeci, Kuzey Amerika&#39;nın doğu kıyıları ve Bengal Körfezi, Japonya bu aralıkta üç türün Limulus Polyphemus&#39;un dört tür vardır . Anatomik benzeri şekillerde 27 445 milyon yıl önce fosil olarak tespit edilmiştir, çünkü hayvan bir &quot;yaşayan fosil&quot; olarak tanımlanır. Olgunluğa ulaşması 13 yıl ve en az 20 yıl 28 yaşayan at nalı yengeci, 10 gerektiren, uzun ömürlü bir hayvan temsil eder. Amerikan at nalı yengeci, yılan balığı ve kabuklu balıkç?...

blood collection from the american horseshoe crab, limulus polyphemus

At nalı yengeci, herhangi bir uzun ömürlü omurgasız en iyi karakterize bağışıklık sistemine sahiptir. At nalı yengeçleri bağışıklık çalışma, büyük miktarda kan toplama kolaylığı ve kan basitlik kolaylaştırılmıştır. At nalı yengeçleri, genel dolaşımı, granül amebocyte sadece tek bir hücre tipi göstermektedir. Plazma, deniz suyunun tuz içeriğine sahiptir ve sadece üç bol miktarda protein, hemosiyanin, solunum protein, C-reaktif bakteri hücreleri de dahil olmak üzere, yabancı hücrelerin sitolitik imha işlevini proteinleri, ve α2-makroglobulin, proteazlar inhibe patojenlerin işgalci. Kan lipopolisakkarid (aka, endotoksin, LPS), Gram-negatif bakteriler bir ürün kontaminasyonu en aza indirecek koşullar altında doğrudan kalp ponksiyon tarafından toplanır. 400 mL kan büyük bir hayvan 200 verim alınabilir. Plazma, kan hücrelerinin çalışma için santrifüj ile plazmadan hemen kaldırılır ve plazma sonra kendisini oluşturan proteinleri içine fraksiyone olabilir. Rahatlıkla kan hücrelerinin LPS-izotonik tuzlu su (0,5 M NaCl) içine küçük miktarda kan kültürü çanak yüzeyinde daha fazla bir LPS-ücretsiz coverglasses koyarak direkt mikroskobik muayene izin koşullar altında toplayarak, daha sonra bu coverglasses montaj mikroskobik olarak incelenmiştir hücre eklenti aşağıdaki basit gözlem odalarında. Doğrudan gözlem için ikinci bir hazırlık toplamak için 3 - 5 ml kan LPS-embriyo çanak ve sonra bir odaya toplanmış amebocytes parçaları explanting bir slayt ve coverglass arasında sandviç doku. Bu hazırlık, hareketli amebocytes kolayca görülebilir coverglass yüzey üzerine göç ederler. Kanın pıhtılaşma sisteminde amebocytes agregasyonu ve kan hücrelerinin salgı granülleri salınan bir protein, coagulin ekstrasellüler bir pıhtı oluşumunu içerir. % 2 Tween-20, 0.5 M LPS-free NaCl, hücreler santrifüj tarafından takip ve 0.5 ile yıkanarak M 0.1 birimlere kan toplama gerçekleştirilebileceğini agregasyonu ve degranülasyonu oluşmaz, yıkanmış kan hücrelerinin biyokimyasal analiz gerektirir NaCl.

Watch this Scientific Journal Video about Blood Collection from the American Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus at JoVE.com

Blood Collection from the American Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus

Amerikan at nalı yengeci, Limulus Polyphemus&#39;un, tartışmalı, büyük miktarda herhangi bir omurgasız kan için en uygun bir kaynağıdır. Kan genel dolaşımı, granül amebocyte ve plazma, hemosiyanin, C-reaktif protein ve α2-makroglobulin sadece üç bol protein sadece tek bir hücre tipi, kompozisyon basit. Kan kalpten toplanır ve kan hücreleri ve plazma santrifüj ile ayrılır.

Amerikan Horseshoe Yengeç, Limulus Polyphemus&#39;un Kan Toplama

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate.  The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated ...

blood-collection-from-the-american-horseshoe-crab-limulus-polyphemus

Research

JoVE Journal

Biology

29.8K Görüntüleme.  University of California, Davis.  Amerikan at nalı yengeci, Limulus Polyphemus'un, tartışmalı, büyük miktarda herhangi bir omurgasız kan için en uygun bir kaynağıdır. Kan genel dolaşımı, granül amebocyte ve plazma, hemosiyanin, C-reaktif protein ve α2-makroglobulin sadece üç bol protein sadece tek bir hücre tipi, kompozisyon basit. Kan kalpten toplanır ve kan hücreleri ve plazma santrifüj ile ayrılır. 