Yazarlar ile ona yardım için bu video makale üreten Dr. Birgit Werner kabul etmek istiyorum. Bu araştırma, bir NSF KARİYER Ödülü tarafından finanse edildi.

Bölüm 1: Deneysel Hazırlık At nalı yengeçleri üzerinde yapılan deneysel prosedürleri Boston Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır. Hayvanlar düzenlenmiş bir ışık-karanlık döngüsüne maruz kalan bir oda Deniz Biyoloji Laboratuarları (Woods Hole, MA) veya başka bir satıcı satın alınan ve gazlı bir tuzlu su tankı ev sahipliği yapmaktadır. Aydınlatma rejimi yengeç sirkadiyen saat sürükleyici ve gündüz ve gece devletler arasındaki günlük göz bisiklet için önemlidir. Iki paslanmaz çelik zehir yerleştirilen vida ve opisthosoma iki hareketi yavaşladı ve daha sonra tahta bir platform sağlanana kadar hemen hiçbir invaziv işlemler başlamadan önce, hayvan, 10-15 dakika süreyle bir buz kovası soğuk. Su lavabolar, böylece platform granit altında ağırlıklı. Terminal deneylerden sonra hayvan yine buz bulamaç içine çeker ve bir neşter ile ağız yukarıda yer alan beyin, pithing tarafından ötenazi. Bölüm 2: Çözümler Limulus Zil Kullanıcı çözümü 430 mm NaCl, 9.56 mM KCl, 9.52 mM CaCl2, 9.97 mM MgCl2, 21.05 mM MgSO4, 50μM TES, 50μM Hepes, ve 10 ml / L Kalem-Strep mix (Penisilin-Streptomisin, 10000 birimleri / ml) oluşur . Bölüm 3: elektroretinogram Kaydı Bu prosedür için gerekli araçlar, tornavida, vazelin, Ringer solüsyonu, bir transfer pipeti yeşil bir LED, bir kayıt odası, paslanmaz çelik vida ve bir pamuklu çubukla. <ol><li> Bir el yapımı oda ERG (Şekil 1A) kaydetmek için kullanılır. Odasına vücut, göz ile temas halinde tuzlu su rezervuar tutmak için tasarlanmıştır. Kapak, bir LED barındıracak büyüklükte bir amplifikatör ve küçük bir delik iletken çözüm bağlamak için gümüş klorür tel içerir. 520Nm çevresinde tepe emisyon LED bir yanabilme Ultraparlak iyi çalışır. </li><li> Başlatmak için, odanın alt vazelin ile kaplı ve iki adet vida ile göz üzerinde güvenli bir. </li><li> Odasına sonra tuzlu su ile doldurulur ve kapak ile kapatılmış. </li><li> Odasına eklenti sonra yengeç, solungaçları üzerinde deniz suyu ile doldurulmuş bir tank bir ışık geçirmez kafes yerleştirilir. </li><li> LED kablo haznesi kapağının içine eklenir. </li><li> Sinyal kurşun klorür tel kırpılır ve referans kurşun implante vidalar kırpılır. </li><li> Her iki yol açar sinyal amplifikasyonu ve amplifikatör filtresi 10Hz altındaki frekanslarda geçmek için yüksek empedans diferansiyel amplifikatör başkanı evre (X-cell 3x4, FHC Inc.) Bağlanır. </li><li> Amplifikatör çıkışı görüntülemek için bir osiloskop ve bilgisayar analizi ve depolanması için bir veri toplama kuruluna beslenir. </li><li> Kurulumundan sonra kafes kapı, oda ışığında hayvan ulaşmasını engellemek için kapalı. </li><li> Veri LabView yazılmış özel bir program ile toplanır. Programı, LED yanıp söner, uyarılmış ERG sinyal kayıtları, ve tepeden-tepeye tepki genlik önlemler. Flaş paradigmanın seçim deneysel hedef bağlıdır. Örneğin, kısa bir 5V (100ms) darbe, uygulanan her 10 dakikada bir LED ışık uyum etkileri göz hassasiyeti sirkadiyen değişiklikleri izleme önler. </li></ol> Bölüm 4: Optik sinir kayıt Bu işlem için gerekli araçlar, bir tornavida, iplik, trefin, Ringer solüsyonu, rongeurs, vannas makas, bir kayıt odası, kavisli bir forseps, ince iğne probları, sıkıcı bir neşter, cerrahi makas ve bir emme elektrot içerir. <ol><li> Bir el yapımı oda, optik sinir yanıtları (Şekil 1B) kaydetmek için kullanılır. Odasının iç sinir karşılamak ve onu çevreleyen doku izole alt duvarında ince bir yarım daire oluklu açılış 2cm çaplı açık kuyu. </li><li> 16-gauge iğne oda takmadan önce kalbin içine menteşe kaslar arasındaki eklenir ve kan ~ 20cc hayvan boşaltılır. Exsanguination gerekli değil ama optik sinir diseksiyonu kolaylaştırır. </li><li> Optik sinir konumu karapaksta lateral ve median gözler arasında hafif kavisli bir çizgi çizerek tahmin edilmektedir. </li><li> Dairesel bir delik daha sonra bir trefin karapaksta kesilir. Delik de oda olarak aynı çapa. 2-3 cm lateral göz ve sinir iyi ventral kısmı boyunca uzanan hat böylece biraz dorsal anterior deliğin merkezi yer almaktadır. </li><li> Bağ dokusu, sinir tamamen görünür ve çevresindeki doku ve altta yatan ücretsiz kadar temizlenir. </li><li> Thread bir iplikçik sinir çevresinde dolanmıştı ve altındaki yuvası ile odasına çekilir. Bu aynı açıklıktan sinir hafifçe dize çekerek odasına yönlendirilir. Aynı zamanda odanın deliğe sokulur. Odasının karapaksta sonra yapıştırılmıştırvida ve iyi Ringer solüsyonu ile doludur. </li><li> Odasına eklenti sonra hayvan, solungaçları üzerinde deniz suyu ile doldurulmuş bir tank bir ışık geçirmez kafes yerleştirilir. </li><li> Kuyu Stereoskop (SMZ-168, Jed Pella Inc) ve pamuk odasının içine ya da dışına ve tuzlu kan sızıntısını önlemek için alt açılış etrafında doldurulur altında görüntülenmiştir. </li><li> Artık sinir çevresinde bağ dokusu ince makas ve cımbız ile kaldırılır ve oda taze Ringer solüsyonu ile doldurulur. </li><li> Bir nick bu açıklıktan sinir dikkatle, ince makas, cımbız, iğne probları kullanarak uzunluğu boyunca desheathed, sinir kapsüller ve kan damarı yapılır. </li><li> Küçük bir elyaf demeti, afferent lif kayıt için göz uzak sonunda ve efferent lif kayıt için göze yakın sonunda prob ve kesme kullanarak sinir ayrılır. Video afferent lif kayıtları için son kesilir. </li><li> Zil çözümü ile dolu bir microsuction elektrot (AM Sistemleri A.Ş.), optik sinir kayıt için kullanılır. Elektrot ucu 1mm çapında borosilikat cam sonuna kapiller parlatma yangın sinir demetine takılmıştır. </li><li> Elektrot ucu manuel manipülatör (TEFE A.Ş.) ile de odasına indirdi ve kesik elyaf demeti ucu içine çekilir. Emme boru üzerinden elektrot bağlı bir Gilmont şırınga tarafından sağlanmaktadır. </li><li> Bir BNC bağlantısı sinyal yol sağlar ve gürültüyü azaltmak için elektrot sarılı bir gümüş klorür tel referans kurşun sağlar. İki yol açan sinyal amplifikasyon ve gürültü filtreleme (X-cell 3x4, FHC Inc.) Için bir diferansiyel amplifikatör başkanı sahneye bağlanır. Amplifikatör çıkışı bir osiloskop bilgisayar analizi ve depolama için görüntüleme ve veri toplama kartı gönderilir. </li><li> Veri LabView yazılmış özel bir program ile toplanır. Program, bir dijital video işlemcisi ile hafif uyaranlara kontrol (Bit + +, Cambridge Araştırma Sistemleri A.Ş.) ve başak trenler kayıtları dijital başak discriminator (APM, FHC A.Ş.) arayüzleri. Işık, bir fiber optik ışık borusu yoluyla ya da tüm göz göz, bilgisayar kontrollü bir video ekranı üzerinden tek hücrelere teslim edilebilir. </li></ol> Bölüm 5: İntraretinal kayıt Bu prosedür için gerekli araçlar, bir tornavida, dişli vida delikleri ile L şeklinde Lucite platformu, bir cam pipet ile mikroelektrot tutucu, paslanmaz çelik vidalar, cımbız, ve ince bir neşter. <ol><li> Lucite, önceden ayarlanmış vida deliklerini bir el yapımı tabak intrasellüler yanıtları kaydetmek için kullanılır. Delikleri motorlu mikromanipülatör (PPM5000, TEFE Inc) montaj için aralıklı. Plaka tarafta iki vida ve üstüne bir hayvan eklenir. </li><li> Plaka eklenti sonra hayvan, solungaçları üzerinde deniz suyu ile doldurulmuş bir tank bir ışık geçirmez kafes yerleştirilir. </li><li> Micropositioner gözün üzerine dizilen hareketli kol ile plaka içine vidalanır. </li><li> 1-mm OD borosilikat cam, cam mikropipetler bir parti çekti ve ipuçları 3M KCl çözeltisi küçük bir flakon mikropipetler koyarak kapiller eylem yoluyla yeniden toprakla. </li><li> Pipetler geri kalanı daha sonra elle tuz çözeltisi ile doldurulur ve bir elektrot tutucu içine yerleştirilir. </li><li> Elektrot tutucu micropositioner koluna iliştirilmiş bir hücre içi amplifikatör başkanı evre (IR-283, Cygnus Technology Inc) bağlıdır. </li><li> Retinanın küçük bir bölümü (yaklaşık 1mm2), bir jilet ile kornea arayüzü keserek maruz kalmaktadır. </li><li> Kurumasını önlemek ve mikropipet ucu retina dokusunun içine açıklığından ileri bir damla Ringer çözeltisi maruz retina üzerine yerleştirilir. </li><li> Ucu çözüm girdiğinde, hücre içi amplifikatör mevcut enjeksiyon modu devreye girer ve elektrot empedansı ölçülür. 20-70 MW aralığının dışında empedansı ile mikropipetler atılır. Bu aralıkta olanlar mikron adım ileri, elektronik ya da mekanik pipet titreşimli hücre içine kazığa. </li><li> Üç tip hücrelerin göz karşılaştı olabilir. Retinular hücreleri sadece ışığa karşı bir depolarizan tepki gösterir, eksantrik hücreleri depolarize yanıt sürme aksiyon potansiyelleri bir tren ve pigment hücreleri hiç ışık tepki gösteriyor. </li><li> Veri Labview yazılmış özel bir program ile toplanır. Programı, bir dijital video işlemci (Bit + +, Cambridge Araştırma Sistemleri) ile hafif uyaranlara kontrol eder. Uyaranlar, bir fiber optik boru veya video gösterimi ile kazığa hücrelerine teslim edilir. Voltaj yanıtları osiloskop gözlenen ve bilgisayar programı tarafından sayısallaştırılmış. </li></ol> Bölüm 6: Temsilci Sonuçlar Bir temsilci ERG Şekil 2A gösterilecek. Dalga özetlenebilir elektrik temsil ederöncelikle photoreceptive retinular hücrelerin ışığa tepki, büyük ölçüde eksantrik hücreleri sayıca daha fazla ve elektrikle akuple. Memeli ERG gibi farklı retinal hücre tipleri birden fazla dalga şekli bileşenleri yoktur. Limulus beyinde bir saat Sirkadiyen geribildirim, günlük bazda retina hücrelerinin zaman içinde değişebilir (1) ERG genlik ve zaman içerisinde neden fizyolojik özellikleri modüle eder. Şekil 2B gösterildiği gibi, ERG genlik öznel gün boyunca hayvan öznel gece ve en düşük sırasında en yüksek olduğu. , Işık tek bir optik sinir lifi yanıtı bir temsilcisi iz Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. Eksantrik hücreleri sürekli bir seviyeye bir çürüme tarafından takip başak deşarj oranı geçici bir artış göstererek, kabaca aynı şekilde davranır. Oranı çürüme, ışık uyum ve başak bağımlı self-inhibisyon eksantrik hücreleri (2) birleşik eylem yansıtır. Işık bağımlı oranı azalır gibi diğer başak desen, Limulus beyin görülen ama göz değil (3). Pigment hücresi, retinular hücre ve eksantrik bir hücrenin ışığa gerilim yanıt Temsilcisi izleri Şekil 4&#39;te gösterilmiştir. Sadece son iki retinal hücre tipleri görsel. Tepki genlik ve zaman ders kayıt kalitesi ve elektrot hücre içindeki yerini bağlıdır. Genellikle, elektrot, büyüklüğü ve sayısı nedeniyle pigment hücreleri veya retinular hücreleri nüfuz eder. Ikincisi, sürdürülebilir bir seviyeye çürükleri geçici bir depolarizasyon kaydedilir. Çürüme retinular hücreleri tarafından hafif adaptasyon (2) kaynaklanmaktadır. Elektrot eksantrik hücre girerse, büyük aksiyon potansiyelleri, akson (40-70mV) ve soma (&lt;25mV) yakın bir depolarizan dalga şekli sürme küçük aksiyon potansiyelleri kaydedilir. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 elektroretinogram kayıt (A) ve optik sinir kayıt (B) için kullanılan odaların şematik diyagramları. Bar 7mm eşittir B. A ve 5mm <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Örnek bir 100ms tarafından uyarılmış bir Limulus ERG izleme karanlıkta 5V nabız (A) ve sürekli karanlıkta zamanla ERG genlik tepe tepe dalgalanması (B) LED. Karanlık beyaz üçgen tarafından belirtilen süre başlandı. ERG genlik siyah üçgen tarafından belirtilen zaman içinde büyüme ışık adaptasyon, karanlıkta göz hassasiyetini artırır. ERG genlik siklik değişkenlik bundan sonra hayvanın iç sirkadiyen saat nedeniyle. B Zaman her 5min. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 Örnek bir optik sinir lifi yanıt iz, tek bir ommatidial reseptör parladı ışık . Iz üzerinde Waveform uyaran zamanlama gösterir. Aksonlar sinir lifleri doğuran Eksantrik hücreler, tüm aydınlatma koşulları altında deney (toplam karanlıkta 5sn flaş) bu kadar ateş benzer bir model göstermektedir. Retina kodlama ile ani bir özellik Limulus diğer omurgasızlar aksine, memeliler ile ortak. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4 gerilim yanıt Örnek izleri Limulus lateral göz bulunan üç hücre tiplerinin ışık: pigment hücresi (A), retinular hücre (B) ve eksantrik hücre (C) . Ilk hücre görsel olmayan. Son iki ışık yanıp üzerine depolarize. Işık transduce ve eksantrik bir hücreye gap junction ile sinyal göndermek için depolarizasyon yol boyunca bazı kaybı, retinular hücreler için büyük. Eksantrik hücre, akson tarafından ateş aksiyon potansiyelleri soma içine başak geri yayılım nedeniyle depolarizasyon sürme görülür. Aksiyon potansiyellerinin genlik depolarizan potansiyeli daha iyi görüntüleme için bu rakam zayıflatılmış olmuştur. Hücrelerin dinlenme potansiyeli-50mV.

<ol>
	<li>Barlow, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+in+the+Limulus+visual+system.">Circadian rhythms in the Limulus visual system.</a> J. Neurosci. 3, 856-870 (1983).</li><li>Passaglia, C. L., Dodge, F. A., Barlow, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+based+model+of+the+Limulus+lateral+eye.">Cell based model of the Limulus lateral eye.</a> J. Neurophysiol. 80, 1800-1815 (1998).</li><li>Snodderly, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+visual+inputs+by+the+brain+of+Limulus.">Processing of visual inputs by the brain of Limulus.</a> J. Neurophysiol. 34, 588-611 (1971).</li><li>Passaglia, C., Dodge, F., Herzog, E., Jackson, S., Barlow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+a+neural+code+for+vision.">Deciphering a neural code for vision.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 12649-12654 (1997).</li><li>Barlow, R. B., Kaplan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limulus+lateral+eye:+properties+of+receptor+units+in+the+unexcised+eye.">Limulus lateral eye: properties of receptor units in the unexcised eye.</a> Science. 174, 1027-1029 (1971).</li><li>Bolbecker, A. R., Lewis, A. R., Swan, A. A., Carlson, K., Fleet, J. R., Beck, K. E., Wasserman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Bellows+Cup+Electrode+Demonstrates+Low-frequency+Properties+of+Long-term+Electroretinographic+Recordings+in+the+Limulus+Lateral+Eye.">Stable Bellows Cup Electrode Demonstrates Low-frequency Properties of Long-term Electroretinographic Recordings in the Limulus Lateral Eye.</a> J. Neurosci. Meth. 159, 252-260 (2007).</li></ol>

Biz, ERG kayıtları, optik sinir kayıtları ve in vivo olarak at nalı yengeçleri intraretinal kayıtları nasıl gerçekleştirebileceğimizi gösterdi var. Kayıt teknikleri her nöral temeline ilişkin vizyon, farklı bakış açıları sağlamak ve hepsi yengeç büyük gözleri ve sert karapaksla canlı hayvanlar sayesinde retina fonksiyonunu incelemek için kullanılabilir. Optik sinir aktivitesi elektrot uygun inşaat (4) ile özgürce okyanus hayvanları davranmaya bile kaydedilebilir. Bu teknikler, aynı zam...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>LED</td>
<td>Light source</td>
<td>Newark Inc</td>
<td>33C1292</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Suction electrode</td>
<td>Electrode</td>
<td>A-M Systems, Inc</td>
<td>573000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XCell 3*4-Channel Extracellular Amplifier</td>
<td>Amplifier</td>
<td>FHC Inc.</td>
<td>40-40-8B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Intracellular Recording</td>
<td>Amplifier</td>
<td>Cygnus</td>
<td>IR-283A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>APM</td>
<td>Neural Spike Discriminator</td>
<td>FHC Inc.</td>
<td>APM</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bits++</td>
<td>Video Board</td>
<td>Cambridge Research Systems Inc</td>
<td>Bits++</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Piezopatch Manipulator</td>
<td>Micropositioner</td>
<td>WPI Inc</td>
<td>PPM5000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Square Pulse Stimulator</td>
<td>Nerve Stimulator</td>
<td>Grass Instrument Division, Astro-Med, Inc.</td>
<td>Model S48</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P-97</td>
<td>Micropipette Puller</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>Model P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate Glass Capillary</td>
<td>Electrode glass</td>
<td>WPI Inc</td>
<td>1B150-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Horseshoe crab (Limulus polyphemus)</td>
<td>Animal</td>
<td>Marine Biological Laboratories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micropipette Puller</td>
<td>Glass Puller</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zoom Stereoscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>Jed Pella Inc.</td>
<td>SMZ-168</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

using the horseshoe crab, limulus polyphemus, in vision research

Amerikan at nalı yengeci, Limulus Polyphemus&#39;un, dünyanın en eski canlıların biridir ve hayvan biyomedikal araştırma vazgeçilmez bir rol oynamaya devam etmektedir . Onların kan değil, sadece bilim adamları ilaçların bacteriotoxins algılamak için kullandığı özel hücreler içeren, ama onların gözleri de ışık adaptasyon ve yanal inhibisyonu gibi fizyolojik süreçleri, görsel sistem faaliyet hakkında daha fazla fikir sağlanan bir sinir ağı yapar. At nalı yengeci, hayvan, büyük ve cesur bir omurgasız olduğundan, retinal nöronların büyük ve kolayca erişilebilir görme araştırma için çekici bir model olmaya devam ediyor, görme sistemi, kompakt ve yoğun çalışılan ve görsel davranış iyi tanımlanmıştır. Ayrıca, gözlerin yapısı ve fonksiyonu, hayvanın beyninde bir sirkadiyen saat bir günlük bazda modüle. Kısacası, at nalı yengeçleri görme sistemi yeterince basit ama ilginç olacak kadar karmaşık anlaşılmalıdır. Bu video Limulus in vivo olarak yapılabilir görme nöral temelini araştırmak için üç elektrofizyolojik paradigmalar sunuyoruz. Onlar elektroretinogram kayıt, optik sinir kayıt ve intraretinal kayıt. Bir yüzeye sahip elektroretinografi (ERG) kayıtları tedbir, tüm hücreleri bir ışık yanıp sönmeye göz özetlenebilir elektriksel tepki elektrodudur. Onlar zaman uzatmak süreler için göz genel duyarlılığı izlemek için kullanılabilir. Optik sinir kayıtları ekstraselüler microsuction elektrot ile tek sinir liflerinin spike aktivitesini ölçmek. Göz, beyin gibi beyin göz geri beslenen sirkadiyen saat mesajları iletilir görsel mesajları okumak için kullanılabilir. Intrasellüler mikroelektrot İntraretinal kayıtları önlem voltaj dalgalanmaları göz bireysel hücrelerin ışık ile indüklenen. Onlar retina işleme hücresel mekanizmaları aydınlatmak için kullanılabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research at JoVE.com

Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research

Bu videoda, Amerikalı at nalı yengeci elektroretinogram kayıt, optik sinir kayıt ve intraretinal kayıt gerçekleştirmek<em&gt; Limulus Polyphemus&#39;un</em&gt;. Bu elektrofizyolojik paradigmalar, bir araştırma veya öğretim laboratuvar görme nöral temeli soruşturma için kullanılabilir.

Horseshoe Yengeç kullanarak, Limulus Polyphemus&#39;un Vizyon Araştırma

The American horseshoe crab, Limulus Polyphemus is one of the oldest creatures on earth, and the animal continues to play an indispensable role in ...

using-the-horseshoe-crab-limulus-polyphemus-in-vision-research

Research

JoVE Journal

Biology

Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research

14.2K Görüntüleme.  Boston University. Bu videoda, Amerikalı at nalı yengeci elektroretinogram kayıt, optik sinir kayıt ve intraretinal kayıt gerçekleştirmek Limulus Polyphemus'un. Bu elektrofizyolojik paradigmalar, bir araştırma veya öğretim laboratuvar görme nöral temeli soruşturma için kullanılabilir.

Video: Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research

Blood Collection from the American Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate. The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated by the ease in collecting large volumes of blood and from the simplicity of the blood. Horseshoe crabs show only a single cell type in the general circulation, the granular amebocyte. The plasma has the salt content of sea water and only three abundant proteins, hemocyanin, the respiratory protein, the C-reactive proteins, which function in the cytolytic destruction of foreign cells, including bacterial cells, and &alpha;2-macroglobulin, which inhibits the proteases of invading pathogens. Blood is collected by direct cardiac puncture under conditions that minimize contamination by lipopolysaccharide (a.k.a., endotoxin, LPS), a product of the Gram-negative bacteria. A large animal can yield 200 - 400 mL of blood. For the study of the plasma, blood cells are immediately removed from the plasma by centrifugation and the plasma can then be fractionated into its constituent proteins. The blood cells are conveniently studied microscopically by collecting small volumes of blood into LPS-free isotonic saline (0.5 M NaCl) under conditions that permit direct microscopic examination by placing one of more LPS-free coverglasses on the culture dish surface, then mounting those coverglasses in simple observation chambers following cell attachment. A second preparation for direct observation is to collect 3 - 5 mL of blood in a LPS-free embryo dish and then explanting fragments of aggregated amebocytes to a chamber that sandwiches the tissue between a slide and a coverglass. In this preparation, the motile amebocytes migrate onto the coverglass surface, where they can readily be observed. The blood clotting system involves aggregation of amebocytes and the formation of an extracellular clot of a protein, coagulin, which is released from the secretory granules of the blood cells. Biochemical analysis of washed blood cells requires that aggregation and degranulation does not occur, which can be accomplished by collecting blood into 0.1 volumes of 2% Tween-20, 0.5 M LPS-free NaCl, followed by centrifugation of the cells and washing with 0.5 M NaCl.

The American horseshoe crab, Limulus polyphemus, is arguably the most convenient source for large quantities of blood of any invertebrate. The blood is simple in composition, with only one cell-type in the general circulation, the granular amebocyte, and only three abundant proteins in the plasma, hemocyanin, the C-reactive proteins, and &alpha;2-macroglobulin. Blood is collected from the heart and the blood cells and plasma are separated by centrifugation.

Amerikan Horseshoe Yengeç, Limulus Polyphemus&#39;un Kan Toplama

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate.  The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated ...

Biyoloji

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Apoptotik hücresi Temizliği görüntülenmesi sırasında Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyo

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to investigate the biological activities during development and diseases. Metabolomics approaches&#160;are widely employed in the study of cancer, nutrition/diet, diabetes, and other physiological and pathological conditions involving metabolic processes. An advantageous tool that aids in metabolomic profiling advocated in this paper is matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI). Its ability to detect metabolites in situ without labeling, structural modifications, or other specialized reagents, such as those used in immunostaining, makes MALDI MSI a unique tool in advancing methodologies relevant in the field of metabolomics. An appropriate sample preparation process is critical to yield optimal results and will be the focus of this paper.

The goal of this protocol is to provide detailed guidance on the sample preparation when planning for experiments using MALDI MSI to maximize metabolic and molecular detection in biological samples.

MALDI Kütle Spektrometresi Görüntüleme Kullanarak Metabolik Profilleme için Örnek Hazırlama

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...

Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) human corneal epithelial cell cultures. Cells were exposed to UV radiation and toxic doses of benzalkonium chloride (BAK), hydrogen peroxide (H2O2), and sodium dodecyl sulfate (SDS). Metabolic activity was measured using a metabolic assay. The release of inflammatory cytokines was measured using a multi-plex interleukin (IL)-1&#946;, IL-6, IL-8, and tumor necrosis factor-alpha (TNF-&#945;) assay, and cells were evaluated for viability using fluorescent dyes. 
The damaging effects of UV on cell metabolic activity and cytokine release occurred at 5 min of UV exposure for iHCEC and 20 min for pHCEC. Similar percent drops in metabolic activity of the iHCEC and pHCEC occurred after exposure to BAK, H2O2, or SDS, and the most significant changes in cytokine release occurred for IL-6 and IL-8. Microscopy of fluorescently stained iHCEC and pHCEC BAK-exposed cells showed cell death at 0.005% BAK exposure, although the degree of ethidium staining was greater in the iHCECs than pHCECs. Utilizing multiple methods of assessing toxic effects using microscopy, assessments of metabolic activity, and cytokine production, the toxicity of UV radiation and chemical toxins could be determined for both primary and immortalized cell lines.

This article describes the procedures used to evaluate the toxicity of UV radiation and chemical toxins on a primary and immortalized cell line.

UV Radyasyonu ve Kimyasallarının Primer ve Ölümsüzleştirilmiş İnsan Kornea Epitel Hücreleri Üzerindeki Toksisitesinin Belirlenmesi

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) ...

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent retinal and vascular tissues. At present, the limited reparative capacity of mammalian RPE, which is restricted to small injuries, has hindered progress to understanding in vivo RPE regenerative processes. Here, a detailed methodology is provided to facilitate the study of in vivo RPE repair utilizing the zebrafish, a&#160;vertebrate model capable of robust tissue regeneration. This protocol describes a transgenic nitroreductase/metronidazole (NTR/MTZ)-mediated injury paradigm (rpe65a:nfsB-eGFP), which results in ablation of the central two-thirds of the RPE after 24 h treatment with MTZ, with subsequent tissue recovery. Focus is placed on RPE ablations in larval zebrafish and methods for testing the effects of pharmacological compounds on RPE regeneration are also outlined. Generation and validation of RpEGEN, a MATLAB script created to automate quantification of RPE regeneration based on pigmentation, is also discussed. Beyond active RPE repair mechanisms, this protocol can be expanded to studies of RPE degeneration and injury responses as well as the effects of RPE damage on adjacent retinal and vascular tissues, among other cellular and molecular processes. This zebrafish system holds significant promise in identifying genes, networks, and processes that drive RPE regeneration and RPE disease-related mechanisms, with the long-term goal of applying this knowledge to mammalian systems and, ultimately, toward therapeutic development.

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

This protocol describes the methodology to genetically ablate the retinal pigment epithelium (RPE) using a transgenic zebrafish model. Adapting the protocol to incorporate signaling pathway modulation using pharmacological compounds is extensively detailed. A MATLAB platform for quantifying RPE regeneration based on pigmentation was developed and is presented and discussed.

Zebra Balığı Retinal Pigment Epitelinin Rejenerasyonunu İncelemek için Nitroredüktaz / Metronidazol Aracılı Ablasyon ve Bir MATLAB Platformu (RpEGEN)

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent ...

Yapay Görme Yaklaşımı Kullanarak TEM İş Akışları, Sonuç Analizi ve Veri Yönetimi

A Machine-Vision Approach to Transmission Electron Microscopy Workflows, Results Analysis and Data Management

Transmission electron microscopy (TEM) enables users to study materials at their fundamental, atomic scale. Complex experiments routinely generate thousands of images with numerous parameters that require time-consuming and complicated analysis. AXON synchronicity is a machine-vision synchronization (MVS) software solution designed to address the pain points inherent to TEM studies. Once installed on the microscope, it enables the continuous synchronization of images and metadata generated by the microscope, detector, and in situ systems during an experiment. This connectivity enables the application of machine-vision algorithms that apply a combination of spatial, beam, and digital corrections to center and track a region of interest within the field of view and provide immediate image stabilization. In addition to the substantial improvement in resolution afforded by such stabilization, metadata synchronization enables the application of computational and image analysis algorithms that calculate&#8239;variables between images. This calculated metadata can be used to analyze trends or identify key areas of interest within a dataset, leading to new insights and the development of more sophisticated machine-vision capabilities in the future. One such module that builds on this calculated metadata is dose calibration and management. The dose module provides state-of-the-art calibration, tracking, and management of both the electron fluence (e-/&#197;2&#183;s-1) and cumulative dose (e-/&#197;2) that is delivered to specific areas of the sample on a pixel-by-pixel basis. This enables a comprehensive overview of the interaction between the electron beam and the sample. Experiment analysis is streamlined through a dedicated analysis software in which datasets consisting of images and corresponding metadata are easily visualized, sorted, filtered, and exported. Combined, these tools facilitate efficient collaborations and experimental analysis, encourage data mining and enhance the microscopy experience.

Yazar Spotlight: Transmisyon Elektron Mikroskobu İş Akışlarına, Sonuç Analizine ve Veri Yönetimine Yapay Görme Yaklaşımı  

Here, we present a protocol to utilize machine-vision software to stabilize dynamic processes during TEM imaging, while concurrently indexing multiple streams of metadata to each image into a navigable timeline. We demonstrate how this platform enables automated calibration and mapping of the electron dose over the course of an experiment.

İletim elektron mikroskobu iş akışlarına, sonuç analizine ve veri yönetimine bir makine görüşü yaklaşımı

Transmission electron microscopy (TEM) enables users to study materials at their fundamental, atomic scale. Complex experiments routinely generate ...

Cell Culture Techniques and Practices to Avoid Contamination by Fungi and Bacteria in the Research Cell Culture Laboratory

Cell culture is a delicate skill necessary for growing human, animal, and insect cells, or other tissues, in a controlled environment. The goal of the protocol is to emphasize the correct techniques used in a research laboratory to prevent contamination from fungi and bacteria. Special emphasis is placed on avoiding mycoplasma contamination, a major concern in the cell culture room due to its small size and resistance to most antibiotics used for cell culture. These same techniques ensure continuous growth and maintain healthy cells. For new and experienced cell culture users alike, it&#8217;s important to consistently adhere to these best practices to mitigate the risk of contamination. Once a year, laboratories should review cell culture best practices and follow-up with a discussion or additional training if needed. Taking early action to prevent contamination in the first place will save time and money, as compared to cleaning up after contamination occurs. Universal best practices keep cell cultures healthy, thereby reducing the need to constantly thaw new cells, purchase expensive cell culture media, and reducing the amount of incubator decontamination and downtime.&#160;

This protocol presents essential cell culture techniques and practices to be used in the research cell culture laboratory to avoid contamination by fungi and bacteria. Within the category of bacteria, special emphasis will be placed on preventing mycoplasma contamination.&#160;&#160;

Araştırma Hücre Kültürü Laboratuvarında Mantar ve Bakterilerin Kontaminasyonunu Önlemek İçin Hücre Kültürü Teknikleri ve Uygulamaları

Cell culture is a delicate skill necessary for growing human, animal, and insect cells, or other tissues, in a controlled environment. The goal of the ...