Diese Arbeit wurde von der von der koreanischen Regierung finanzierten National Research Foundation of Korea (MSIP) (Nr. 2015R1A2A1A10052663 und Nr. 2014M1A3A3A02034698) unterstützt.

1. Sicherheit ACHTUNG: Dieses Protokoll verwendet [γ- 32 P] -ATP, um die Aktivität von AMPK zu beurteilen. Phosphor-32 ist ein radioaktives Isotop, das weitgehend eine Beta-Strahlung emittiert. Da die Größe eines Beta-Partikels extrem klein ist, kann es leicht Kleidung und Haut durchdringen. Sowohl externe als auch interne Exposition gegenüber Beta-Strahlung können schädlich für die menschliche Gesundheit, einschließlich durch Verursachen von Hautverbrennungen und Gewebeschäden. <ol><li> Führen Sie alle Schritte durch, die die Verwendung von [γ- 32 P] -ATP mit einem geeigneten Schutz erfordern, wie z. B. Acryl-Abschirmung. </li><li> Stellen Sie sicher, dass alle Mitarbeiter mit elektronischen persönlichen Dosimetern (EPD) ausgestattet sind, um das Ausmaß der Exposition gegenüber schädlichen Strahlung während aller Verfahren zu überwachen. </li><li> Behandeln Sie Open-Source-Strahlung nur nach entsprechender Schulung und Zulassung. HINWEIS: Hier wurden alle Experimente nach Abschluss der Ausbildung zum Open-Source-Strahlungseinsatz bei der Seoul National UnivUnd die Zustimmung der koreanischen Regierung (nssc.go.kr/nssc/de). </li><li> Entsorgen Sie radioaktive Abfälle nach den örtlichen Vorschriften. HINWEIS: Hier wurden Richtlinien vom Institut für Umweltschutz &amp; Sicherheit der Seoul National University gefolgt. Die folgenden sind eine Liste der Regulierungsbehörden in den Vereinigten Staaten und in den europäischen Ländern: Die Vereinigten Staaten von Amerika, United States Nuclear Regulatory Commission (http://www.nrc.gov/); Vereinigtes Königreich, Health and Safety Executive (HSE) (http://www.hse.gov.uk); Frankreich, Autorité de sûreté nucléaire (https://www.asn.fr/); Und Deutschland, Bundesministerium für Umwelt, Naturschutz, Bauen und Nukleare Sicherheit (BMU) (http://www.bmu.de). </li></ol> 2. In vitro Competitive Kinase Assay <ol><li> Aufbau von wettbewerbsfähigen Peptiden <ol><li> Bestimmen Sie das von AMPK phosphorylierte Konsensmotiv. ANMERKUNG: AMPK erkennt das Konsensmotiv &amp;# 934; - [X, β] -XX-Ser / Thr-XXX-Φ. In der Konsensussequenz repräsentiert Φ hydrophobe Aminosäuren ( dh Valin [V], Leucin [L], Methionin [M] und Isoleucin [I]) und β stellt basische Aminosäuren dar ( dh Lysin [K], Arginin [ R] und Histidin [H]) 1 . </li><li> Selektieren Sie Serin- oder Threoninreste aus Zielsequenzen nach dem obigen Konsensusmotiv. Verwenden Sie drei putative Stellen von menschlichem Nrf2 (Nr. 1, 148-157 mit Ser153; # 2, 330-339 mit Ser335 und # 3, 553-562 mit Ser558) 8 . </li><li> Kommerziell synthetisieren 10-Reste-Peptide, die die vermeintlichen Stellen nachahmen. Erhalten Sie das synthetisierte Produkt als lyophilisiertes Pulver mit einer Reinheit von mehr als 98% für jedes Peptid. </li><li> Löse die Peptide unter Verwendung eines Kinasepuffers, um eine Konzentration von 71,667 g / l zu erreichen. Wenn ein Peptid in einem Kinasepuffer nicht löslich ist, löst es es in 20% DMSO auf. Wenn es unlösbar bleibt, ein Peptid, das den Put nachahmtUm die Löslichkeit zu erhöhen. </li></ol></li></ol><ol start="2"><li> In vitro- kompetitiver AMPK-Kinase-Assay <ol><li> 5 × Kinasepuffer wie folgt vorbereiten: 100 mM HEPES, pH 7,4; 25 mM MgCl &amp; sub2 ;; 5 mM EGTA; 5 mM DTT; 125 mM β-Glycerophosphat (Serin / Threonin-Phosphataseinhibitor); 5 mM Na &amp; sub3; VO &amp; sub4; (Tyrosinphosphataseinhibitor); 0,5% (v / v) Protease-Inhibitor-Cocktail-Set III, 1 mM kaltes ATP; Und 500 &amp; mgr; M AMP. HINWEIS: AMP ist eine wesentliche Komponente des Kinase-Puffers, um die AMPK-Aktivität zu testen. Der Puffer kann verwendet werden, um die Aktivität von Serin / Threonin-Kinasen und Tyrosinkinasen zu messen. </li><li> Tauen Sie das folgende rekombinante Protein und synthetische Peptide auf Eis: AMPK; Nrf2; Und Oligopeptide # 1, # 2 und # 3. </li><li> Bereiten Sie einen Reaktionspuffer auf Eis vor: 0,15 μg AMPK, 0,4 μg Nrf2 (~ 4 pmol), 0,43 mg Oligopeptid (~ 300 nmol) und 6 μl 5 × Kinasepuffer. EINDas Endvolumen auf 30 μl mit sterilem destilliertem Wasser (DW) einstellen. HINWEIS: Die Zugabe von [γ- 32 P] -ATP nach der Herstellung des Reaktionspuffers kann das radioaktive Signal aufgrund der Kinase-Autophosphorylierung reduzieren. </li></ol></li><li> Die Reaktanten laufen lassen HINWEIS: Alle nachfolgenden Prozesse müssen unter Schutz mit Acrylschild, Rack oder Block sowie passenden persönlichen Schutzausrüstungen durchgeführt werden. <ol><li> Vor Beginn des Experiments Heizblöcke auf 30 ° C stellen. </li><li> Füge 1 μl [γ- 32 P] -ATP (1 μCi) zu den Reaktionsröhrchen auf Eis hinzu. Mischen Sie den Reaktionspuffer durch mehrmaliges Pipettieren. HINWEIS: Die Radioaktivität von 32 P hat eine kurze Halbwertszeit von ca. 14 Tagen 9 . Stellen Sie die Lautstärke unter Berücksichtigung der Halbwertszeit ein ( z. B. nach einem Monat nach der Produktion von [γ- 32 P] -ATP, fügen Sie 4 μl [γ- 32 P]-ATP, um 1 μCi zu machen). </li><li> Inkubieren Sie die Probe im Heizblock bei 30 ° C für 15-30 min. Während dieses Schrittes werden 7,5% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Gele hergestellt. Passen Sie den Prozentsatz des Gels entsprechend der Größe des Zielproteins an. </li><li> Stoppen Sie die Kinase-Reaktion durch Zugabe von 3 μl 10 × SDS-Probenpuffer (10% (v / v) Glycerin, 20% (w / v) SDS, 15,42% (w / v) Dithiothreitol, 90% (v / v) 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8) und 0,02% (w / v) Bromphenolblau). Mischen Sie den Reaktionspuffer durch mehrmaliges Pipettieren. </li><li> Führen Sie die Proben in einem 7,5% SDS-PAGE-Gel bei 70 V für 20 min und kontinuierlich bei 140 V für 1 h. HINWEIS: Die Bromphenol-blaue Linie am Ende des Gels enthält extrem hohe radioaktive Signale. Es wird empfohlen, das Gel unterhalb der blauen Linie zu entfernen, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren, um Hintergrundsignale zu reduzieren. </li><li> Nach SDS-PAGE entfernen Sie das Gel vorsichtig aus dem Zaubernden. Legen Sie das Gel in ein Glas tUbe für den nächsten Schritt. </li><li> Das Gel mit Fixierungspuffer für 20 min (50% Methanol und 10% Eisessig) fixieren. </li><li> Ziehen Sie das Gel vorsichtig auf das Filterpapier und bedecken Sie es mit einer transparenten Umhüllung. Beachten Sie, dass das Gel bei diesem Schritt leicht zerrissen werden kann. Das Gel mit einem Vakuum-Gel-Trockner bei 80 ° C für 1 h trocknen. </li></ol></li><li> Visualisierung <ol><li> Setzen Sie das Gel entweder über einen Leuchtstoffschirm oder einen Röntgenfilm über Nacht (meist ca. 16 h) aus. HINWEIS: Ein Phosphorschirm kann nach der Exposition gegenüber dem extra hellen Licht wiederverwendet werden. Wenn ein Röntgenfilm verwendet wird, setzen Sie das Gel über zwei Tage frei. Röntgenfilme haben niedrigere Empfindlichkeiten als Phosphorsiebe. </li><li> Scannen Sie den Leuchtstoffschirm mit einem Phosphor-Imager. Exportiere das Bild als hochauflösende TIFF- oder Bitmap-Datei. </li><li> Nach der Visualisierung, bewegen Sie das Gel in einen Glas- oder Kunststoffbehälter für Coomassie-Brillantblau (CBB) -Färbung. </li><li> Waschen Sie das Gel mit DW. Verwerfe den DW und Fleck thE Gel mit dem Färbereagenz für 1 h. </li><li> Das Reagenz verwerfen und das Gel mit DW für 1 h oder über Nacht entfärben. Legen Sie das Gel zwischen transparente Plastikfolien (oder das Äquivalent), um mit einem Büro-Scanner zu scannen. </li></ol></li></ol> 3. In-Vitro- Kinase-Assay unter Verwendung einer ortsspezifischen Mutante <ol><li> Site-Directed Mutagenese von pGEX-Nrf2 <ol><li> Mutagenes Primer Design HINWEIS: Das Entwerfen geeigneter mutagener Primer ist entscheidend für das erfolgreiche Ergebnis der Mutagenese. Im Folgenden sind einige Überlegungen zur Gestaltung mutagener Primer gegeben. Erstellen Sie eine Grundierung bestehend aus 25 bis 45 Basen, mit der gewünschten Mutation in der Mitte des Primers. Der Primer sollte 40-60% GC-Gehalt haben und mit einer oder mehreren G- oder C-Basen enden. Stellen Sie sicher, dass das T m des Primers gleich 78 ° C oder größer ist, gemäß der Formel [T m = 81,5 + 0,41 (% GC) - (675 / Länge der Basen) -% Mismatch]. HINWEIS: Reinigen Sie diePrimer, weil seine Reinheit für die Mutationseffizienz wichtig ist. Es gibt mehrere Websites für die Gestaltung mutagener Primer. <ol><li> Öffnen Sie das Primer-Design-Programm für &quot;Design von Primern für ortsspezifische Mutagenese&quot; (http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp). </li><li> Paste menschliche Nrf2 DNA Sequenz (Zugang Nr. NM_006164.4) und wähle die Schaltfläche &quot;Upload übersetzt&quot;. </li><li> Wählen Sie den Serin-558-Rest aus der übersetzten Aminosäuresequenz, um in Alanin umzuwandeln. Mit dem mutagenen Primer, ersetzen Sie das Codon für Serin von Agc zu Gcc, für Alanin. </li><li> Betrachten Sie die Primerlänge, T m und den GC-Gehalt. ANMERKUNG: Der mutagene Primer wird schließlich als 5&#39;-ctactgaaaaaacaactc gcc accttatatctcgaag-3 &#39;entworfen. </li></ol></li><li> Reaktion für die Mutantenstrass-Synthese unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) <ol><li> Das PCR-Reaktionsgemisch auf Eis vorbereiten: 10 × Reaktionspuffer, 50 ngPGEX-GST-Nrf2, 125 ng Vorwärtsprimer, 125 ng Rückwärtsprimer, 1 μl dNTP-Mischung (je 10 mM), 2,5 U Pfu- DNA-Polymerase und sterile DW bis 50 μl. </li><li> Führen Sie die PCR für die PGEX-GST-Nrf2-Mutanten-Strangsynthese mit folgendem Zyklus: 1 Zyklus bei 95 ° C für 30 s; 18 Zyklen bei 95 ° C für 30 s, bei 55 ° C für 1 min und bei 68 ° C für 90 s; Und 1 Zyklus bei 68 ° C für 5 min. HINWEIS: Abhängig von der Plasmidlänge können die Zyklusparameter geändert werden. </li><li> Legen Sie es auf Eis für 2 min, um die Reaktanten für den nächsten Schritt zu kühlen. Alternativ können sie bei 4 ° C über Nacht aufbewahren. </li></ol></li><li> Dpn I Verdauung und die Auswahl eines Mutantenplasmids <ol><li> 1 &amp; mgr; l Dpn I- Restriktionsenzym (10 U / &amp; mgr; l) zu jedem der Reaktanten nach dem Abkühlen zugeben Gründlich und vorsichtig durch Pipettieren und zentrifugieren für 1 min. </li><li> Inkubieren bei 37 ° C für 2 h, um parenterale pGEX-GST-Nrf2 zu verdauen,Gestrandete DNA. </li><li> DH5 &amp; agr; superkompetente Zellen vorsichtig auf Eis auftauen. </li><li> Füge 50 μl des Edukts zu 150 μl vorgekühlten DH5 α superkompetenten Zellen hinzu und inkubiere auf Eis für mindestens 30 min. </li><li> Die Röhrchen auf einen auf 42 ° C vorgeheizten Heizblock überführen und 90 s ablassen. Lege sie für 2 min auf Eis. </li><li> Füge vorgewärmte Lysogenbrühe (LB) zu den transformierten DH5-α- Zellen hinzu und inkubiere bei 37 ° C für 1 h unter Schütteln bei 180 U / min. </li><li> Die transformierten Zellen auf LB-Ampicillin-Agar-Platten verteilen und über Nacht bei 37 ° C inkubieren. HINWEIS: Ampicillin wird zur Selektion verwendet, da das Plasmid GEX-GST-Nrf2 den Ampicillin-Resistenzmarker hat. Verwenden Sie geeignete Antibiotika, abhängig vom Resistenzmarker des mutagenisierten Plasmids. </li><li> Wählen Sie eine einzelne Kolonie aus der Platte, überführen sie auf 5 ml LB-Ampicillin und inkubieren über Nacht bei 37 ° C unter Schütteln bei 180 U / min.Zur Verifikation der mutagenen Sequenz werden mindestens drei Kolonien ausgewertet. </li><li> Extrahieren von DNA unter Verwendung eines DNA-Miniprep-Kits für die DNA-Sequenzanalyse; Folgen Sie dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Überprüfen Sie die mutagenen DNA-Sequenzen mit einem automatischen DNA-Sequenz-Analysator gemäß dem Protokoll des Herstellers. Verwenden Sie mindestens 200 ng des DNA-Konstrukts für die Verifizierung von Mutantensequenzen. </li></ol></li></ol></li><li> Reinigung des rekombinanten GST-Nrf2 Proteins <ol><li> Expression mutagener GST-Nrf2- Fusionsproteine in Escherichia coli <ol><li> Verwandeln Sie das mutagene pGEX-GST-Nrf2-Plasmid in BL21- Zellen. Inokulieren einer einzelnen Kolonie in 25 ml LB-Brühe, die Ampicillin (100 &amp; mgr; g / ml) enthält, und bei 37 ° C auf einem Rotator über Nacht inkubieren. </li><li> Inokulieren der kultivierten Zellen in 100 ml LB-Brühe, die Ampicillin (100 &amp; mgr; g / ml) bei einem 1: 100-Verdünnungsverhältnis enthält. </li><li> Inkubieren bei 37 ° C auf einer RotationOder bis die Extinktion bei 600 nm etwa 0,4-0,8 (ca. 4 h) erreicht. </li><li> Füge 100 μl 1 M IPTG zu 100 ml kultivierten Zellen hinzu, um eine Endkonzentration von 1 mM IPTG herzustellen. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen bei 30 ° C auf einem Rotator für 6 h oder über Nacht für die Proteinexpression. </li><li> Die Zellen wurden bei 5000 xg für 20 min zentrifugiert und die Zellpellets mit 1 ml bakteriellem Lysepuffer (25 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 0,1% CHAPS, 1 μg / ml Pepstatin, 0,5 μg / ml Leupeptin, Und 1 mM PMSF) auf Eis. </li><li> Lyse die Zellpellets unter Verwendung eines Ultraschall-Homogenisators mit 2-s-Intervallen für 2 min bei 50% der maximalen Leistungsabgabe. </li><li> Die Zellen bei 12.000 × g für 15 min bei 4 ° C zentrifugieren und den Überstand sammeln. </li></ol></li><li> Reinigung des rekombinanten GST-Nrf2 Proteins <ol><li> 200 μl 50% (v / v) Glutathion-Agarose-Kügelchen zubereiten und mit 1 ml PBS (pH 7,3; 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 ) waschen </sUb&gt; HPO 4 und 1,8 mM KH 2 PO 4 ). Sammeln Sie die Perlen durch Zentrifugation bei 500 × g für 1 min. Wiederholen Sie den Waschschritt dreimal. </li><li> Fügen Sie das Zelllysat den vorbereiteten 200 &amp; mgr; l 50% (v / v) Glutathion-Agarose-Kügelchen hinzu und inkubieren Sie bei 4 ° C auf einem End-Over-End-Rotator für 2 h. </li><li> Sammeln Sie die Glutathion-Agarose-Perlen in Kombination mit GST-Nrf2-Protein durch Zentrifugation bei 500 xg für 1 min. Entfernen Sie den Überstand mit einer 1-ml-Spritze mit einer 31 G-Nadel. </li><li> Waschen Sie die Perlen mit 1 ml PBS (pH 7,3), wie in Schritt 1. </li><li> Fügen Sie 500 μl Elutionspuffer (50 mM Tris-HCl und 10 mM reduziertes Glutathion, pH 8,0) zu den Glutathion-Agarose-Perlen in Kombination mit GST-Nrf2 hinzu. Inkubieren bei 4 ° C auf einem End-Over-End-Rotator für 30 min. </li><li> Bei 500 xg für 1 min zentrifugieren und den Überstand sammeln. </li><li> Wiederholen Sie 300 μl Elutionspuffer zu den Perlen und wiederholen Sie die Schritte 3.2.2.5-3.2.2.6 zweimal. </li></ol></li><li> Bestätigung des gereinigten GST-Nrf2 Proteins <ol><li> 5 μl der Probe zur Visualisierung der Proteinmenge mit 0,5 μg Standardprotein BSA vorbereiten. </li><li> Führen Sie die Proben in einem 7,5% SDS-PAGE-Gel bei 70 V für 20 min und dann bei 140 V für 60 min. </li><li> Färben Sie das Gel mit 0,1% CBB-Färbelösung (0,1 g CBB R250, 40 ml 99% Methanol, 10 ml Eisessig und 50 ml destilliertes H 2 O) für 2 h und destain (30 ml Methanol, 10 ml Eisessig und 60 ml destilliertem H &amp; sub2 ; O), bis die Banden deutlich gezeigt sind. </li><li> Legen Sie das entfärbte Gel auf das Filterpapier und legen Sie es mit einer transparenten Umhüllung ab. Das Gel mit einem Vakuum-Gel-Trockner bei 80 ° C für 1 h trocknen. </li><li> Bestimmen Sie die Menge des mutierten GST-Nrf2-Proteins mit Densitometrie für den in vitro- AMPK-Kinase-Assay. </li></ol></li></ol></li><li> In-vitro- AMPK-Aktivitäts-Assay mit einer ortsspezifischen Mutante NICHTE: Der in vitro AMPK-Kinase-Assay wird gemäß den Schritten 2.2-2.4 unter Verwendung von 0,4 μg gereinigtem Wildtyp GST-Nrf2 oder der GST-Nrf2-S558A-Mutante ohne Peptidinhibitoren durchgeführt. Befolgen Sie alle in Schritt 1 beschriebenen Strahlenschutzrichtlinien. <ol><li> Einen Reaktionspuffer auf Eis mit 0,15 μg AMPK, 0,4 μg Mutanten- oder Wildtyp-GST-Nrf2 und 6 μl 5-Kinase-Puffer vorbereiten. Füllen Sie bis zu 30 μl mit sterilem DW. </li><li> Füge 1 μl [γ- 32 P] -ATP (1 μCi / μL) zu den Reaktionsröhrchen auf Eis hinzu. Den Reaktionspuffer durch mehrmaliges Auf- und Abpumpen mischen und zentrifugieren. </li><li> Inkubieren Sie die Proben in einem Heizblock bei 30 ° C für 30 min. </li><li> Stoppen Sie die Kinase-Reaktion durch Zugabe von 3 μl 10 × SDS-Probenpuffer. </li><li> In einem 7,5% SDS-PAGE-Gel bei 70 V für 20 min und dann bei 140 V für 1 h laufen gelassen. </li><li> Fixieren Sie das Gel mit dem Fixierungspuffer für 20 min, bewegen Sie es auf das Filterpapier und bedecken Sie das Gel mit einem transparEnt wrapper </li><li> Das Gel mit dem Vakuum-Gel-Trockner bei 80 ° C für 1 h trocknen und dann über Nacht entweder einem Leuchtstoffschirm oder einem Röntgenfilm aussetzen. </li><li> Den Phosphorschirm mit einem Phosphor-Imager abtasten und das Gel auf eine Glasröhre zur CBB-Färbung nach der Visualisierung gemäß Schritt 2.4 bewegen. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Als einfacher und bequemer Weg, um die Echtheit der von AMPK vermittelten vorhergesagten Phosphorylierungsstellen zu beurteilen, beschreiben wir hier einen in vitro -Kinase-Assay, der verwendet werden kann, um eine spezifische Phosphorylierungsstelle unter Verwendung von kompetitiven Peptiden zu entdecken und sie mit einer ortsspezifischen Mutante zu verifizieren . Die repräsentativen Daten, die aus dem in vitro- kompetitiven AMPK - Aktivitäts-Assay erhalten wurden, stimmen mit den Ergebniss...

Die Proteinphosphorylierung an einem spezifischen Rückstand spielt eine wichtige Rolle in einem breiten Spektrum zellulärer Prozesse. Somit erfordert ein Verständnis von Signalisierungsnetzwerken die Identifizierung spezifischer Phosphorylierungsstellen. Darüber hinaus bestimmt die Phosphorylierungsstelle die Wirkung auf die Proteinfunktion, da einzelne Domänen innerhalb eines Proteins unterschiedliche Strukturen und Funktionen besitzen. Die Aktivität des Kernfaktor-Erythroid-2-Faktors 2 (Nrf2), ein wichtiger Antioxidans-Transkriptionsfaktor, wird durch Phosphorylierung an verschiedenen Stellen bidirektional reguliert. Unsere Studien konzentrierten sich auf die Kinasen, die die Phosphorylierung von Nrf2 katalysieren. Die Stressreaktion von Nrf2 gegen oxidative Herausforderung erfolgt rasch, vor allem durch Phosphorylierung am Serin 40 und vermittelt durch die Proteinkinase C (PKC) -δ, die Nrf2 3 , 4 aktiviert. Umgekehrt katalysiert Fyn die hemmende Phosphorylierung von Nrf2 bei Tyrosin 568 zur engen Kontrolle der Aktivität 5 . Die häufigste Methode zur Entdeckung von Phosphorylierungsstellen ist die Flüssigchromatographie / Massenspektrometrie (LC / MS) -Analyse. Auf diese Weise können schnelle und hochempfindliche Phosphorylierungsstellen-Mapping-Daten erzeugt werden. Allerdings hat es mehrere technische Einschränkungen, die oft falsch-negative Signale erzeugen. Schlechte Sequenzabdeckung tritt häufig in der LC / MS-Analyse auf. Um Phosphorylierungsstellen zu identifizieren, sind Informationen über die maximale Aminosäureabdeckung eines Proteins erforderlich 6 . Die Proteolyse des Proteins von Interesse mit mehreren Proteasen während des Verdauungsschrittes kann bei der Verbesserung der Sequenzabdeckung hilfreich sein. Ein weiteres Hindernis für die Identifizierung von Phosphorylierungsrückständen ist der leichte Verlust an Phosphorsäure, der häufig für Serin- und Threonin-phosphorylierte Peptide 6 , 7 beobachtet wird . Labile Phosphatreste sind oftAus Phosphopeptiden während des Fragmentierungsprozesses freigesetzt 7 . Die zweite Option bei der Suche nach Phosphorylierungsstellen ist die Verwendung eines Peptid-Mikroarray-Verfahrens. Es ist möglich, die Kinase-Zielstellen unter Verwendung eines Mikroarray-Chips, der Peptidfragmente enthält, die von einem Protein von Interesse abgeleitet sind, zu screenen. Aufgrund des Ausrüstungsbedarfs für die Herstellung und Detektion eines Mikroarray-Chips wird das Peptid-Mikroarray-Verfahren jedoch als zeitaufwändig und teuer angesehen. Um diese Herausforderungen zu überwinden, kann ein in vitro- Oligopeptid-konkurrierender Kinase-Assay für eine Proteinkinase mit bekannten Erkennungsmotiven verwendet werden. Wenn das Konsensuserkennungsmotiv einer Kinase festgestellt wird, können mutmaßliche Phosphorylierungsstellen eines Kandidatensubstrats vorhergesagt und die Echtheit der Stellen validiert werden. Die überzeugendste Methode für dieses Verfahren ist, die Aufhebung der Phosphorylierung in einem mutierten Protein zu zeigen, in dem die PrädikatD-Rest wird mit einer nicht phosphorylierbaren Aminosäure ( dh Serin oder Threonin zu Alanin, Tyrosin zu Phenylalanin) substituiert. Allerdings ist die Herstellung und Isolierung von mutierten Proteinen zeitaufwändig. Als Alternative im Anfangsstadium der Forschung ist der kompetitive Peptid-Kinase-Assay einfach und bequem. Hier beschreiben wir ein Protokoll für einen In-vitro- Peptid-Konkurrenz-Assay und für die Validierung der Phosphorylierungsstelle.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>208337</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-glycerophosphate</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;VO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Calbiochem, Nottingham, UK</td><td>539134</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>AMP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A1752</td><td></td></tr><tr><td>AMPK</td><td>Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY</td><td>14-840</td><td></td></tr><tr><td>Nrf2 (WT)</td><td>Abnova, Taipei City, Taiwan</td><td>H00004780-P01</td><td></td></tr><tr><td>[&amp;gamma;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P]-ATP</td><td>PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA</td><td>NEG502A</td><td></td></tr><tr><td>EZblue staining reagent</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G1041</td><td></td></tr><tr><td>Pfu turbo DNA polymerase</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td><td>600250</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td><td>200415-51</td><td>Avoid multiple thaw and freezing cycle</td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>LB broth</td><td>Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands</td><td>L1704</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Affymetrix, Santa Clara, CA</td><td>11259</td><td></td></tr><tr><td>Agarose LE</td><td>iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea</td><td>32034</td><td></td></tr><tr><td>HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit</td><td>Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan</td><td>QDF100</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>161-0400</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Bovogen Biologicals, Victoria, Australia</td><td>BSA100</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione Sepharose 4B</td><td>GE Healthcare, Marlborough, MA</td><td>17-0756-01</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid glacial</td><td>Duksan pure chemicals, Ansan, South Korea</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methyl alcohol&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td><td>Daejung Chemicals &amp;amp; Metals, Siheung, South Korea</td><td>5558-4410</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Typhoon FLA 7000</td><td>GE Healthcare, Marlborough, MA</td><td>28-9558-09</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE kit</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>1658001FC</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum pump</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>165-178</td><td></td></tr><tr><td>Gel dryer</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>165-1746</td><td></td></tr><tr><td>Dancing shaker</td><td>FINEPCR, Seoul, Korea</td><td>CR300</td><td>The machine is needed for washing step</td></tr><tr><td>PCR machine</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>Incubator/shakers</td><td>N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea</td><td>NB-205L</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuges</td><td>LABOGENE, Seoul, Korea</td><td>1730R</td><td></td></tr><tr><td>Chromatography columns</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>732-1010</td><td></td></tr></tbody></table>

oligopeptide competition assay for phosphorylation site determination

Die Proteinphosphorylierung an bestimmten Stellen bestimmt ihre Konformation und Interaktion mit anderen Molekülen. So beeinflusst die Proteinphosphorylierung biologische Funktionen und Eigenschaften der Zelle. Derzeit ist die häufigste Methode zur Entdeckung von Phosphorylierungsstellen durch Flüssigchromatographie / Massenspektrometrie (LC / MS) -Analyse, ein schnelles und empfindliches Verfahren. Allerdings werden relativ labilile Phosphatreste oft aus Phosphopeptiden während des Fragmentierungsschrittes freigesetzt, was oft falsch-negative Signale ergibt. In solchen Fällen wäre ein herkömmlicher in vitro -Kinase-Assay unter Verwendung von ortsgerichteten Mutanten genauer, aber diese Methode ist mühsam und zeitaufwändig. Daher kann ein alternatives Verfahren unter Verwendung von Peptidwettbewerb vorteilhaft sein. Das Konsensuserkennungsmotiv der 5&#39;-Adenosinmonophosphat-aktivierten Proteinkinase (AMPK) wurde 1 etabliert und wurde unter Verwendung eines Positions-Scanning-Peptid-Bibliotheks-Asss validiertAy 2 Somit könnten AMPK-Phosphorylierungsstellen für ein neuartiges Substrat vorhergesagt und durch die Peptidwettbewerbsassays bestätigt werden. In diesem Bericht beschreiben wir die detaillierten Schritte und Verfahren für den in vitro- Oligopeptid-konkurrierenden Kinase-Assay durch die Veranschaulichung der AMPK-vermittelten Kernfaktor-Erythroid-2-verwandten Faktor 2 (Nrf2) -Phosphorylierung. Um die Phosphorylierungsstelle zu authentifizieren, führten wir einen sequentiellen In-vitro -Kinase-Assay unter Verwendung einer ortsspezifischen Mutante durch. Insgesamt liefert der Peptid-Konkurrenz-Assay ein Verfahren zum Screening mehrerer potentieller Phosphorylierungsstellen und zur Identifizierung von Stellen für die Validierung durch die Phosphorylierungsstellen-Mutanten.

Abbildung 1 und Abbildung 2 zeigen die Ergebnisse aus wiederholten Experimenten in dem zuvor gemeldeten Papier 8 . Drei verschiedene 10-Rest-Oligopeptide, die die mutmaßlichen AMPK-Zielstellen nachahmen (# 1, 148-157 mit Ser153; # 2, 330-339, umfassend Ser335 und # 3, 553-562, umfassend Ser558), wurden synthetisiert und als Konkurrenten in der in verwendet Vitro -Kinase-Assay Die Phosph...

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Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Peptid-Konkurrenz-Assays sind weit verbreitet in einer Vielzahl von molekularen und immunologischen Experimenten verwendet. Dieses Papier beschreibt eine detaillierte Methode für einen in vitro- Oligopeptid-konkurrierenden Kinase-Assay und die damit verbundenen Validierungsverfahren, die nützlich sein können, um spezifische Phosphorylierungsstellen zu finden.

Oligopeptid-Konkurrenz-Assay zur Phosphorylierungsbestimmung

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

oligopeptide-competition-assay-for-phosphorylation-site-determination

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.4K Aufrufe.  Seoul National University.  Peptid-Konkurrenz-Assays sind weit verbreitet in einer Vielzahl von molekularen und immunologischen Experimenten verwendet. Dieses Papier beschreibt eine detaillierte Methode für einen in vitro- Oligopeptid-konkurrierenden Kinase-Assay und die damit verbundenen Validierungsverfahren, die nützlich sein können, um spezifische Phosphorylierungsstellen zu finden. 

Serie: Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering allosteric details of their regulation. Kinases comprise signaling networks whose defects are often hallmarks of multiple forms of cancer and related diseases, making an assay platform amenable to manipulation of upstream regulatory factors and validation of reaction requirements critical in the search for improved therapeutics. Here, we describe a basic kinase assay that can be easily adapted to suit specific experimental questions including but not limited to testing the effects of biochemical and pharmacological agents, genetic manipulations such as mutation and deletion, as well as cell culture conditions and treatments to probe cell signaling mechanisms. This assay utilizes radiolabeled [&#947;-32P] ATP, which allows for quantitative comparisons and clear visualization of results, and can be modified for use with immunoprecipitated or recombinant kinase, specific or typified substrates, all over a wide range of reaction conditions.

Protein kinases are highly evolved signaling enzymes and scaffolds that are critical for inter- and intracellular signal transduction. We present a protocol for measuring kinase activity through the use of radiolabeled adenosine triphosphate ([&#947;-32P] ATP), a reliable method to aid in elucidation of cellular signaling regulation.

Test der Proteinkinase-Aktivität mit radioaktiv markiertem ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Forschung

Biochemie

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; however, the number of identified targets for Cdk1, particularly in human cells is still low. The identification of Cdk1-specific phosphorylation sites is important, as they provide mechanistic insights into how Cdk1 controls the cell cycle. Cell cycle regulation is critical for faithful chromosome segregation, and defects in this complicated process lead to chromosomal aberrations and cancer.
Here, we describe an in vitro kinase assay that is used to identify Cdk1-specific phosphorylation sites. In this assay, a purified protein is phosphorylated in vitro by commercially available human Cdk1/cyclin B. Successful phosphorylation is confirmed by SDS-PAGE, and phosphorylation sites are subsequently identified by mass spectrometry. We also describe purification protocols that yield highly pure and homogeneous protein preparations suitable for the kinase assay, and a binding assay for the functional verification of the identified phosphorylation sites, which probes the interaction between a classical nuclear localization signal (cNLS) and its nuclear transport receptor karyopherin &#945;. To aid with experimental design, we review approaches for the prediction of Cdk1-specific phosphorylation sites from protein sequences. Together these protocols present a very powerful approach that yields Cdk1-specific phosphorylation sites and enables mechanistic studies into how Cdk1 controls the cell cycle. Since this method relies on purified proteins, it can be applied to any model organism and yields reliable results, especially when combined with cell functional studies.

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is activated in the G2 phase of the cell cycle and regulates many cellular pathways. Here, we present a protocol for an in vitro kinase assay with Cdk1, which allows the identification of Cdk1-specific phosphorylation sites for establishing cellular targets of this important kinase.

Identifizierung von Cyclin-abhängige Kinase 1 spezifische Phosphorylierung Websites durch eine In-vitro- Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets in both physiological and pathological states. CK2 is an evolutionarily conserved serine/threonine kinase with a growing list of hundreds of substrates involved in multiple cellular processes. Due to its pleiotropic properties, identifying and characterizing a comprehensive set of CK2 substrates has been particularly challenging and remains a hurdle in the study of this important enzyme. To address this challenge, we have devised a versatile experimental strategy that enables the targeted enrichment and identification of putative CK2 substrates. This protocol takes advantage of the unique dual co-substrate specificity of CK2 allowing for specific thiophosphorylation of its substrates in a cell or tissue lysate. These substrate proteins are subsequently alkylated, immunoprecipitated, and identified by liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We have previously used this approach to successfully identify CK2 substrates from Drosophila ovaries and here we extend the application of this protocol to human glioblastoma cells, illustrating the adaptability of this method to investigate the biological roles of this kinase in various model organisms and experimental systems.

The objective of this protocol is to label, enrich, and identify substrates of protein kinase CK2 from a complex biological sample such as a cell lysate or tissue homogenate. This method leverages unique aspects of CK2 biology for this purpose.

Identifizierung von neuartigen CK2 Kinase Substrate mit einem vielseitigen biochemischen Ansatz

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

Charakterisierung auf molekularer Ebene mit robusten biochemischen Ansätzen eines neuen Kinase-Proteins

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of PNKs can be quantified using direct or indirect approaches. Presented here is a direct, in vitro approach to measure PNK activity that relies on a fluorescently-labeled oligonucleotide substrate and polyacrylamide gel electrophoresis. This approach provides resolution of the phosphorylated products while avoiding the use of radiolabeled substrates. The protocol details how to set up the phosphorylation reaction, prepare and run large polyacrylamide gels, and quantify the reaction products. The most technically challenging part of this assay is pouring and running the large polyacrylamide gels; thus, important details to overcome common difficulties are provided. This protocol was optimized for Grc3, a PNK that assembles into an obligate pre-ribosomal RNA processing complex with its binding partner, the Las1 nuclease. However, this protocol can be adapted to measure the activity of other PNK enzymes. Moreover, this assay can also be modified to determine the effects of different components of the reaction, such as the nucleoside triphosphate, metal ions, and oligonucleotides.

This protocol describes a nonradioactive assay to measure kinase activity of polynucleotide kinases (PNKs) on small DNA and RNA substrates.

Nichtradioaktiver Test zur Messung der Polynukleotid-Phosphorylierung kleiner Nukleotidsubstrate

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to measure protein phosphorylation cannot preserve the heterogeneity in phosphorylation across individual proteins. The single-molecule pull-down (SiMPull) assay was developed to investigate the composition of macromolecular complexes via immunoprecipitation of proteins on a glass coverslip followed by single-molecule imaging. The current technique is an adaptation of SiMPull that provides robust quantification of the phosphorylation state of full-length membrane receptors at the single-molecule level. Imaging thousands of individual receptors in this way allows for quantifying protein phosphorylation patterns. The present protocol details the optimized SiMPull procedure, from sample preparation to imaging. Optimization of glass preparation and antibody fixation protocols further enhances data quality. The current protocol provides code for the single-molecule data analysis that calculates the fraction of receptors phosphorylated within a sample. While this work focuses on phosphorylation of the epidermal growth factor receptor (EGFR), the protocol can be generalized to other membrane receptors and cytosolic signaling molecules.

The present protocol describes sample preparation and data analysis to quantify protein phosphorylation using an improved single-molecule pull-down (SiMPull) assay.

Ein optimierter Einzelmolekül-Pulldown-Assay zur Quantifizierung der Proteinphosphorylierung

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with cytoplasmic tails of the receptors. The interactions often occur through specific protein domains and result in activation of the enzymes. There are several methods to study interactions between proteins. While co-immunoprecipitation is commonly used to study domains that are required for protein-protein interactions, there are no assays that document the contribution of specific domains to activity of the recruited enzymes at the same time. Accordingly, the method described here combines co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay for simultaneous evaluation of interactions between proteins and associated enzymatic activation. The goal of this protocol is to identify the domains that are critical for physical interactions between a protein and enzyme and the domains that are obligatory for complete activation of the enzyme. The importance of this assay is demonstrated, as certain receptor protein domains contribute to the binding of the enzyme to the cytoplasmic tail of the receptor, while other domains are necessary to regulate the function of the same enzyme.

Here, we present a protocol for co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay to simultaneously study the contribution of specific protein domains of plasma membrane receptors to both enzyme recruitment and enzyme activity.

Co-Immunopräzipitation Test zur Untersuchung funktionalen Wechselwirkungen zwischen Rezeptoren und Enzymen

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Immunologie und Infektion

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

Bezeichnung des Post-translationale Modifikationen von Pflanzenproteinkomplexe

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Biologie

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Identifikation von Kinase-Substrat-Pairs Mit High Throughput Screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Comparing the Affinity of GTPase-binding Proteins using Competition Assays

In this protocol we demonstrate a method for comparing the competition between GTPase-binding proteins. Such an approach is important for determining the binding capabilities of GTPases for two reasons: The fact that all interactions involve the same face of the GTPases means that binding events must be considered in the context of competitors, and the fact that the bound nucleotide must also be controlled means that conventional approaches such as immunoprecipitation are unsuitable for GTPase biochemistry. The assay relies on the use of purified proteins. Purified Rac1 immobilized on beads is used as the bait protein, and can be loaded with GDP, a non-hydrolyzable version of GTP or left nucleotide free, so that the signaling stage to be investigated can be controlled. The binding proteins to be investigated are purified from mammalian cells, to allow correct folding, by means of a GFP tag. Use of the same tag on both proteins is important because not only does it allow rapid purification and elution, but also allows detection of both competitors with the same antibody during elution. This means that the relative amounts of the two bound proteins can be determined accurately.

This protocol compares the relative affinities of binding partners for Rho-family GTPases, including Rac1. In vivo, Rac1-binding proteins compete for a single binding interface, the conformation of which is dictated by a bound nucleotide. The nucleotide is both important and difficult to control experimentally, due to the high hydrolysis rate.

Vergleicht man die Affinität der GTPase-bindende Proteine ​​mit Competition-Assays

In this protocol we demonstrate a method for comparing the competition between GTPase-binding proteins. Such an approach is important for determining the ...

Oligopeptid-Konkurrenz-Assay zur Phosphorylierungsbestimmung

Zusammenfassung

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Test der Proteinkinase-Aktivität mit radioaktiv markiertem ATP

Identifizierung von Cyclin-abhängige Kinase 1 spezifische Phosphorylierung Websites durch eine In-vitro- Kinase Assay

Identifizierung von neuartigen CK2 Kinase Substrate mit einem vielseitigen biochemischen Ansatz

Charakterisierung auf molekularer Ebene mit robusten biochemischen Ansätzen eines neuen Kinase-Proteins

Nichtradioaktiver Test zur Messung der Polynukleotid-Phosphorylierung kleiner Nukleotidsubstrate

Ein optimierter Einzelmolekül-Pulldown-Assay zur Quantifizierung der Proteinphosphorylierung

Co-Immunopräzipitation Test zur Untersuchung funktionalen Wechselwirkungen zwischen Rezeptoren und Enzymen

Bezeichnung des Post-translationale Modifikationen von Pflanzenproteinkomplexe

Identifikation von Kinase-Substrat-Pairs Mit High Throughput Screening

Vergleicht man die Affinität der GTPase-bindende Proteine mit Competition-Assays

Oligopeptid-Konkurrenz-Assay zur Phosphorylierungsbestimmung

Zusammenfassung

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Test der Proteinkinase-Aktivität mit radioaktiv markiertem ATP

Identifizierung von Cyclin-abhängige Kinase 1 spezifische Phosphorylierung Websites durch eine In-vitro- Kinase Assay

Identifizierung von neuartigen CK2 Kinase Substrate mit einem vielseitigen biochemischen Ansatz

Charakterisierung auf molekularer Ebene mit robusten biochemischen Ansätzen eines neuen Kinase-Proteins

Nichtradioaktiver Test zur Messung der Polynukleotid-Phosphorylierung kleiner Nukleotidsubstrate

Ein optimierter Einzelmolekül-Pulldown-Assay zur Quantifizierung der Proteinphosphorylierung

Co-Immunopräzipitation Test zur Untersuchung funktionalen Wechselwirkungen zwischen Rezeptoren und Enzymen

Bezeichnung des Post-translationale Modifikationen von Pflanzenproteinkomplexe

Identifikation von Kinase-Substrat-Pairs Mit High Throughput Screening

Vergleicht man die Affinität der GTPase-bindende Proteine ​​mit Competition-Assays

Vergleicht man die Affinität der GTPase-bindende Proteine mit Competition-Assays