Name: a rapid image-based bacterial virulence assay using amoeba
Uploaded: 2018-06-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba at JoVE.com

KP와 그대로 쓴 원고를 수정. KP는 실험 및 분석을 수행합니다. 이 작품을 다른 이름으로 국립 보건원 (NIH) 경력 전환 상 (K22AI112816)에 의해 지원 되었다

모든 실험 절차, Irvine가 주 대학에 실행 되었다.
1. 버퍼 및 솔루션
<ol><li>이중 증 류 물 (ddH2O) 1 L에 파운드-밀러 믹스의 25 g을 추가 하 여 1 리터 유리병에 Lysogeny 국물 (파운드)를 준비 합니다. 접시, 한 천의 추가 20 g 추가. 오토 클레이 브 소독. 10 cm 직경 접시에 녹은 한 천 매체의 25 mL를 붓고 고 실 온에서 응고를 허용 합니다. 실내 온도에 액체 미디어와 4 ° c.에 한 천 ...

<ol>
	<li>Rasko, D. A., Sperandio, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-virulence+strategies+to+combat+bacteria-mediated+disease.">Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 9 (2), 117-128 (2010).</li><li>Coburn, B., Grassl, G. A., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella,+the+host+and+disease:+a+brief+review.">Salmonella, the host and disease: a brief review.</a> Immunology and Cell Biology. 85 (2), 112-118 (2007).</li><li>Alibaud, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+virulence+genes+identified+in+a+Dictyostelium+host+model.">Pseudomonas aeruginosa virulence genes identified in a Dictyostelium host model.</a> Cellular Microbiology. 10 (3), 729-740 (2008).</li><li>Pukatzki, S., Kessin, R. H., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+pathogen+Pseudomonas+aeruginosa+utilizes+conserved+virulence+pathways+to+infect+the+social+amoeba+Dictyostelium+discoideum.">The human pathogen Pseudomonas aeruginosa utilizes conserved virulence pathways to infect the social amoeba Dictyostelium discoideum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (5), 3159-3164 (2002).</li><li>Cosson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+Virulence+Analyzed+in+a+Dictyostelium+discoideum+Host+System.">Pseudomonas aeruginosa Virulence Analyzed in a Dictyostelium discoideum Host System.</a> Journal of Bacteriology. 184 (11), 3027-3033 (2002).</li><li>Pukatzki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+conserved+bacterial+protein+secretion+system+in+Vibrio+cholerae+using+the+Dictyostelium+host+model+system.">Identification of a conserved bacterial protein secretion system in Vibrio cholerae using the Dictyostelium host model system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 103 (5), 1528-1533 (2006).</li><li>Steinert, M., Heuner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+as+host+model+for+pathogenesis.">Dictyostelium as host model for pathogenesis.</a> Cellular Microbiology. 7 (3), 307-314 (2005).</li><li>Hagele, S., Kohler, R., Merkert, H., Schleicher, M., Hacker, J., Steinert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+discoideum:+a+new+host+model+system+for+intracellular+pathogens+of+the+genus+Legionella.">Dictyostelium discoideum: a new host model system for intracellular pathogens of the genus Legionella.</a> Cellular Microbiology. 2 (2), 165-171 (2000).</li><li>Matz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+uses+type+III+secretion+system+to+kill+biofilm-associated+amoebae.">Pseudomonas aeruginosa uses type III secretion system to kill biofilm-associated amoebae.</a> ISME Journal. 2 (8), 843-852 (2008).</li><li>Hauser, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+type+III+secretion+system+of+Pseudomonas+aeruginosa:+infection+by+injection.">The type III secretion system of Pseudomonas aeruginosa: infection by injection.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (9), 654-665 (2009).</li><li>Moore, P. L., MacCoubrey, I. C., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+pH+insensitive,+two+color+fluorescence+viability+(cytotoxicity)+assay.">A rapid pH insensitive, two color fluorescence viability (cytotoxicity) assay.</a> Journal of Cell Biology. 111, 58 (1990).</li><li>Kaneshiro, E. S., Wyder, M. A., Wu, Y. -. P., Cushion, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+calcein+acetoxy+methyl+ester+and+ethidium+homodimer+or+propidium+iodide+for+viability+assessment+of+microbes.">Reliability of calcein acetoxy methyl ester and ethidium homodimer or propidium iodide for viability assessment of microbes.</a> Journal of Microbiological Methods. 17 (1), 1-16 (1993).</li><li>Siryaporn, A., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A., Gitai, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+attachment+induces+Pseudomonas+aeruginosa+virulence.">Surface attachment induces Pseudomonas aeruginosa virulence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (47), 16860-16865 (2014).</li><li>Decherchi, P., Cochard, P., Gauthier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+staining+assessment+of+Schwann+cell+viability+within+whole+peripheral+nerves+using+calcein-AM+and+ethidium+homodimer.">Dual staining assessment of Schwann cell viability within whole peripheral nerves using calcein-AM and ethidium homodimer.</a> Journal of Neuroscience Methods. 71 (2), 205-213 (1997).</li><li>Braut-Boucher, F., Pichon, J., Rat, P., Adolphe, M., Aubery, M., Font, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-isotopic,+highly+sensitive,+fluorimetric,+cell-cell+adhesion+microplate+assay+using+calcein+AM-labeled+lymphocytes.">A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes.</a> Journal of Immunological Methods. 178 (1), 41-51 (1995).</li><li>Grieshaber, P., Lagr&#232;ze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+of+fluorogold-prelabeled+retinal+ganglion+cells+with+calcein-AM:+A+new+method+for+assessing+cell+vitality.">Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality.</a> Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 233-239 (2010).</li><li>Witkin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherited+Differences+in+Sensitivity+to+Radiation+in+Escherichia+Coli.">Inherited Differences in Sensitivity to Radiation in Escherichia Coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 32 (3), 59-68 (1946).</li><li>Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+of+Dictyostelium+discoideum+to+nucleic+acid+analogues.">Sensitivity of Dictyostelium discoideum to nucleic acid analogues.</a> Experimental Cell Research. 64 (2), 484-486 (1971).</li><li>Rahme, L. G., Stevens, E. J., Wolfort, S. F., Shao, J., Tompkins, R. G., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+virulence+factors+for+bacterial+pathogenicity+in+plants+and+animals.">Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals.</a> Science. 268 (5219), 1899-1902 (1995).</li><li>O'Loughlin, C. T., Miller, L. C., Siryaporn, A., Drescher, K., Semmelhack, M. F., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quorum-sensing+inhibitor+blocks+Pseudomonas+aeruginosa+virulence+and+biofilm+formation.">A quorum-sensing inhibitor blocks Pseudomonas aeruginosa virulence and biofilm formation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (44), 17981-17986 (2013).</li></ol>

이 프로토콜 P. 녹 농 균에 독성 분석 결과를 신속 하 고 양적 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 다른 박테리아와 테스트할 수 있습니다. 그러나, 그것은 성장 매체 아메바 성장 조건와 호환 되어야 하는 마음에 유지 하는 것이 중요입니다. 특히, 우리는 세균성 성장 매체로 PS:DB를 사용 하 여 프로토콜을 최적화 했습니다. 다른 미디어를 사용 하는 경우에는 셀이 없으면 세균성 매체는 amoebae...

세균 감염 인간과 동물1,2사망률의 주요 원인 중 하나입니다. 문화 또는 biofilms에 박테리아의 독성을 측정 하는 능력은 의료 및 연구 설정에 중요 합니다. 여기, 세균성 독성을 계량 하는 다재 다능 한, 빠른, 그리고 상대적으로 간단한 방법을 설명 합니다. 진 핵 유기 체 Dictyostelium discoideum (아메바) 모델 호스트 유기 체로 사용 됩니다. D. discoideum 은 녹 농 균 (P. 녹 농 균)3,,45 에 다른 박테리아6,7 독성 요소를 식별 하는 호스트로 사용 되었습니다. ,8 주로 같은 독성 요인 유형 III 분 비9,10을 포함 한 포유류 세포를 죽이 게 쉽습니다. D. discoideum 를 사용 하 여 이전 독성 분석 실험 시간3,,45의 과정을 통해 디 discoideum 세포를 가진 박테리아의 장기간된 노출을 관련 있다. 프로토콜, 여기,이 아메바를 사용 하 여 독성을 결정 하는 빠른 방법을 제공 합니다. 이 프로토콜 (그림 1) 설명 하는 방법: (1) axenically (에서 박테리아의 부재) amoebae 성장, (2) 분석 결과 대 한 박테리아, (3) 준비 박테리아 성장과 현미경 검사 법, (4)에 대 한 호스트 셀 epifluorescence 현미경 검사 법, 수행 하 고 (5) 아메바 분석 형광입니다.
Amoebae 처음 냉동된 주식에서 줄무늬 고는 amoebae 포자를 생산 하는 곳의 대장균 (대장균), 잔디밭에 성장. 이 포자는 포착 하 고 axenic 성장 위한 풍부한 매체에 주사. amoebae는 영양분이 풍부한 조건에서 axenic 성장을 통해 세균 독성의 평가 대 한 박테리아와 혼합 될 준비가 될 때까지 유지 됩니다. 생존 또는 amoebae의 죽음은 calcein-acetoxymethyl (calcein-오전), 세포내 esterases에 의해 죽 습 이며, 따라서, 형광11,12에 대 한 활성화의 형광을 측정 하 여 정량. 강조 하는 반면 라이브 amoebae 거의 비슷하게 형광을 전시 하 고 죽어가는 세포 형광 강렬 하지. 이 결과 calcein-오전 건강 amoebae와 법인의 조금 또는 전혀 설립 및 스트레스 amoebae13기판의 분열. 이 문제는 특히 포유류 세포11,,1415,16calcein 오전 형광 다릅니다.
박테리아 독성에 대 한 평가 별도로 성장 된다. 여기, 우리는 기회 주의 병원 체 피 녹 농 균 의 독성을 측정 planktonic (수영) 및 표면 부착 부분 모집단의 독성을 계량 하는 방법에 자세히 설명 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 다른 박테리아의 독성 테스트를 적용할 수 있습니다. 대표적인 결과 섹션에서 우리는 독성 표면 부착 세포에서 활성화 되 고 보여줄 낮은 planktonic 셀에 이전13보고 했다. 비 악성 planktonic 세포는 amoebae 소비 하는 동안 표면에 부착 된 독성 활성화 P. 농 균 amoebae 죽인다. Planktonic 박테리아의 독성은 전적으로 분석 되 고, 박테리아는 프로토콜에 설명 된 대로 접시를 사용 하는 것 보다는 일반 문화 관에서 경작 될 수 있습니다.
P. 농 균 문화는 amoebae 영양분이 풍부한 조건에서 안정 된 상태에서 성장 하는 동안 의도 성장 단계에 도달 되도록 amoebae의 P. 농 균 문화 성장 조정 해야 합니다. 이 상태는 일반적으로 그들은 박테리아와 혼합 되어 적어도 1 일 하기 전에 희석 amoebae 문화를 필요 합니다. Amoebae 및 박테리아 천 패드를 사용 하 여 움직일 수는, 1 시간에 대 한 공동 incubated 이며 객관적인, 녹색 형광 단백질 (GFP) 필터, 낮은 해상도 (10 X, 숫자 조리개 0.3)와 이미징 카메라를 사용 하 여 몇 군데. 분석은 ImageJ 소프트웨어를 자유롭게 사용할 수를 사용 하 여 수행할 수 있습니다 또는 이미지 분석 소프트웨어를 사용자 정의. 우리의 분석은 과학적인 분석 패키지13를 사용 하 여 작성 하는 우리 자신의 소프트웨어를 사용 하 여 수행 되었다. 소프트웨어 단계 명암 이미지를 사용 하 여 마스크를 만들고 형광 이미지의 마스크 된 영역에서 형광 값을 추출 해야 합니다. 형광 값은 적어도 100 셀, 숫자 호스트 살인 색인 결과 이상 평균 했다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:716px;" width="715">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Reagents</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Bacto agar, dehydrated</td>
			<td style="width:108px;">BD Difco</td>
			<td style="width:91px;">214010</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:91px;">15240062</td>
			<td style="width:297px;">Aliquot &#60; 1 mL and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM)</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:91px;">C34852</td>
			<td style="width:297px;">Calcein Acetoxymethyl (AM)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Calcium chloride, anhydrous</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:91px;">C1016</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:108px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:91px;">D16500</td>
			<td style="width:297px;">Dextrose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:91px;">D5879</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Folic acid</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:91px;">F8758</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">LB-Miller</td>
			<td style="width:108px;">BD Difco</td>
			<td style="width:91px;">244620</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:91px;">M8266</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:108px;">Oxoid</td>
			<td style="width:91px;">LP0021</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Special peptone</td>
			<td style="width:108px;">Oxoid</td>
			<td style="width:91px;">LP0072</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Potassium hyroxide</td>
			<td style="width:108px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:91px;">P250</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Potassium phosphate monobasic&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:91px;">P0662</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td style="width:108px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:91px;">S373</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Vitamin B12</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:91px;">V2876</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Strains</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:220px;">Dictyostelium discoideum</td>
			<td style="width:108px;">Siryaporn lab</td>
			<td style="width:91px;">Strain AX318</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:220px;">Escherichia coli</td>
			<td style="width:108px;">Siryaporn lab</td>
			<td style="width:91px;">Strain B/r17</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:220px;">Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td style="width:108px;">Siryaporn lab</td>
			<td style="width:91px;">PA14</td>
			<td style="width:297px;">PA14 strain19</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Pseudomonas aeruginosa &#916;lasR</td>
			<td style="width:108px;">Siryaporn lab</td>
			<td style="width:91px;">AFS20.1</td>
			<td style="width:297px;">PA14-derived strain20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Supplies</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">0.22 &#181;m filter&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Millipore</td>
			<td style="width:91px;">SCGPT01RE</td>
			<td style="width:297px;">For filter sterilization</td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:220px;">Conical tube, 15 mL</td>
			<td style="width:108px;">Corning</td>
			<td style="width:91px;">352097</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Glass storage bottles</td>
			<td style="width:108px;">Pyrex</td>
			<td style="width:91px;">13951L</td>
			<td style="width:297px;">250 mL, 500 mL, 1000 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Petri dish, 6 cm diameter</td>
			<td style="width:108px;">Corning</td>
			<td style="width:91px;">351007</td>
			<td style="width:297px;">60 x 15 mm polystyrene plates</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:220px;">Petri dish, 10 cm diameter</td>
			<td style="width:108px;">Fisher</td>
			<td style="width:91px;">FB0875712</td>
			<td style="width:297px;">100 x 15 mm polystyrene plates</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:220px;">Plastic containers with lid</td>
			<td style="width:108px;">Ziploc</td>
			<td style="width:91px;">2.57E+09</td>
			<td style="width:297px;">Square 3-cup containers</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:220px;">Glass plates</td>
			<td style="width:108px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:91px;">1653308</td>
			<td style="width:297px;">For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:220px;">Wooden sticks</td>
			<td style="width:108px;">Fisher</td>
			<td style="width:91px;">23-400-102&#160;</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Equipment</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Eclipse Ti-E microscope&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Nikon</td>
			<td style="width:91px;">MEA53100</td>
			<td style="width:297px;">Microscope setup</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">10X Plan Fluor Ph1 objective&#160; 0.3 NA</td>
			<td style="width:108px;">Nikon</td>
			<td style="width:91px;">MRH20101</td>
			<td style="width:297px;">Microscope setup</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Fluorescence excitation source</td>
			<td style="width:108px;">Lumencor</td>
			<td style="width:91px;">Sola light engine</td>
			<td style="width:297px;">Microscope setup</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:220px;">Fluorescence filter set</td>
			<td style="width:108px;">Semrock</td>
			<td style="width:91px;">LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000&#160;</td>
			<td style="width:297px;">Microscope setup</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Orca Flash 4.0 V2 Camera</td>
			<td style="width:108px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:91px;">77054098</td>
			<td style="width:297px;">Microscope setup</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">ImageJ</td>
			<td style="width:108px;">NIH</td>
			<td style="width:91px;">v. 1.49</td>
			<td style="width:297px;">Software for image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">MATLAB</td>
			<td style="width:108px;">Mathworks</td>
			<td style="width:91px;">R2013</td>
			<td style="width:297px;">Software for image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Orbital shaker incubator</td>
			<td style="width:108px;">VWR</td>
			<td style="width:91px;">89032-092</td>
			<td style="width:297px;">For growth of bacteria at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Platform shaker</td>
			<td style="width:108px;">Fisher</td>
			<td style="width:91px;">13-687-700</td>
			<td style="width:297px;">For growth of amoebae at 22 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:108px;">Biochrom</td>
			<td style="width:91px;">Ultrospec 10</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Undercounter refrigerated incubator</td>
			<td style="width:108px;">Fisher</td>
			<td style="width:91px;">97990E</td>
			<td style="width:297px;">For growth of amoebae at 22 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Isotemp waterbath&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Fisher</td>
			<td style="width:91px;">15-462-21Q</td>
			<td style="width:297px;">For cooling media to 55 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid image-based bacterial virulence assay using amoeba

전통적인 세균 독성 분석 실험 호스트 셀에 몇 시간에 걸쳐 박테리아의 장기간된 노출을 포함 됩니다. 이 기간 동안 박테리아 호스트 성장 환경에 노출 하 고 호스트 세포의 존재로 인해 생리에 변화를 받을 수 있습니다. 우리는 빠르게는 박테리아 호스트 세포의 성장 정도 최소화 하는 박테리아의 독성 상태를 측정 하는 분석 결과 개발. 박테리아와 amoebae 함께 혼합 하 고 천 패드를 사용 하 여 단일 영상 평면에 움직일 수 있다. 절차는 호스트 세포 건강의 지표로 서 에스테 르 calcein acetoxymethyl (calcein-오전) 단일 셀 형광 이미징을 사용합니다. 호스트 세포의 형광 박테리아 epifluorescence 현미경 검사 법을 사용 하 여 호스트 세포의 노출의 1 시간 후 분석 된다. 이미지 분석 소프트웨어는 호스트 살인 인덱스를 계산 하는 데 사용 됩니다. 이 방법은 planktonic 및 표면 부착 녹 농 균 에서 독성을 측정 하기 위해 사용 되었습니다 biofilm 형성의 초기 단계에서 하위 인구 및 다른 박테리아와 biofilm 성장의 다른 단계에 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜 독성을 측정 하는 신속 하 고 강력한 방법을 제공 합니다 그리고 많은 성장과 포유류 세포의 유지 보수와 관련 된 복잡성을 방지 합니다. 여기 amoebae를 사용 하 여 측정 하는 독성 고기 또한 마우스 대 식 세포를 사용 하 여 확인 되었습니다. 특히,이 분석 결과 피 녹 농 균에 그 표면 첨부 파일 upregulates 독성 설정 하 사용 되었다.

우리 야생-타입 성장 P. 농 균 PA1419 스트레인 또는 ΔlasR 6 cm 직경 접시에 동일한 PA14 배경에서20 를 변형 하 고 planktonic 및 표면에 연결 된 세포의 독성을 분석. 문화는 PS:DB 문화, 채도를 37 ° C에서 롤러 드럼에 문화 관에서 하룻밤 성장에 단일 식민지에서 주사 했다, PS:DB, 100 rpm, 떨고 6 cm 직경 접시에 8 h에 대 한 성장 planktonic ?...

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A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

아메바를 사용 하 여 빠른 이미지 기반 세균 독성 분석 결과

여기, 선물이 D. discoideum (아메바)를 사용 하 여 호스트 planktonic 또는 표면에 부착 된 세균의 독성을 측정 하는 프로토콜. 독성은 1 시간 동안 측정 하 고 호스트를 죽이 형광 현미경 검사 법 및 이미지 분석을 사용 하 여 계량. 이 프로토콜 P. 농 균박테리아를 사용 하 여 설명 합니다.

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS)

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry SESI-MS

보조 전기 분무 이온화 질량 분석법 (SESI - MS)를 사용하여 특성화 세균 휘발성 물질

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) is a method developed for the rapid detection of volatile compounds, without the need for ...

연구

생체공학

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

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전기 화학 센서를 사용하여 세균의 검출 및 식별

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

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액상 사출 성형을위한 3D 인쇄 금형을 사용하여 의료 기기의 신속하고 저렴한 프로토 타이핑

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Rapid Mix Preparation of Bioinspired Nanoscale Hydroxyapatite for Biomedical Applications

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다중 스펙트럼 화상 진찰 교류 세포측정을 사용하여 시험관 내 미세핵 분석기를 능력을 발휘하는 자동화된 방법

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슈도모나스 주사기 pv에 대한 저항의 높은 처리량 식별. 모종 홍수 분석을 사용하여 토마토토마토

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

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The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...

3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting

3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting

점성-관성 포스 제팅을 번갈아 가며 생체외 하이드로겔 마이크로캐리어의 3D 프린팅

Microcarriers are beads with a diameter of 60-250 &#181;m and a large specific surface area, which are commonly used as carriers for large-scale cell ...