Name: x-ray diffraction of intact murine skeletal muscle as a tool for studying the structural basis of muscle disease
Uploaded: 2019-07-18T12:30:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease at JoVE.com

Questa ricerca ha utilizzato le risorse dell'Advanced Photon Source, un Office of Science User Facility del Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti (DOE) gestito per l'Ufficio della Scienza del DOE dall'Argonne National Laboratory sotto contratto n. DE-AC02-06CH11357. Questo progetto è stato sostenuto dalla sovvenzione P41 GM103622 dell'Istituto Nazionale di Scienze Mediche Generali degli Istituti Nazionali di Sanità. L'uso del rivelatore Pilatus 3 1M è stato fornito dalla sovvenzione 1S10OD018090-01 da NIGMS. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non riflette necessariamente le opinioni ufficiali dell'Istituto Nazionale di Scienze Mediche Generali o degli Istituti Nazionali di Sanità.

Tutti i protocolli di esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'Illinois Institute of Technology Institutional Animal Care and Use Committee (Protocol 2015-001, Data di approvazione: 3 novembre 2015) e hanno seguito il NIH "Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio"9 .
1. Preparazione pre-sperimentazione
<ol><li>Preparare 500 mL della soluzione di Ringer (contiene: 145 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,0 mM MgSO4, 1,0 mM CaCl2, 10,0 mM HEPES, 11 mM di glucosio, pH 7.4) fresco per ogni giorno dell'esperimento.</li>
	<li>Riempire 200 mL di soluzione Ringer in una bottiglia spray e conservare in frigorifero da 4 c. Riempire una piastra Petri (10 cm di diametro) con la soluzione di Ringer e perfondere con ossigeno al 100% collegando il tubo da una bombola di ossigeno a una pietra d'aria dell'acquario. I piatti Petri ("piatti dissetti) sono stati precedentemente rivestiti con un composto di elastomero per consentire l'inserimento di spilli durante la dissezione.</li>
	<li>Preparare ganci di montaggio in metallo. Tagliare due pezzi di filo in acciaio inossidabile, di 0,5 mm di diametro, alla lunghezza appropriata e piegare il filo ad entrambe le estremità per formare ganci. Disporre tutti gli strumenti di dissezione, forbici, pinze di legatura sutura, microforsorti pratici per l'uso. NOT:</</c2> La parte del gancio dovrebbe essere lunga circa 3 mm. Il filo più lungo (che termina in un gancio) dovrebbe essere lungo circa 5 cm, e il filo più corto (anche in un gancio) deve essere lungo circa 1 cm per adattarsi alle camere personalizzate utilizzate a BioCAT e consentire una gamma sufficiente di movimento per il braccio del trasduttore.</li>
	<li>
Collegare e accendere tutte le apparecchiature. Questo include un trasduttore combinato motore/forza, un controller trasduttore motore/forza uno stimolatore di corrente bifasica ad alta potenza e un sistema di acquisizione/controllo dei dati controllati al computer.
	<ol>
<li>Accendere il sistema di acquisizione dati e calibrarlo prima di iniziare l'esperimento10. In breve, calibrando la forza aggiungendo una serie di pesi noti, coprendo fino al 50% della forza massima misurata dal trasduttore di forza in una progressione lineare, sul trasduttore di forza e registrando i cambiamenti di tensione di uscita. Calibrare la lunghezza applicando una serie di tensione di uscita nota al braccio della leva e misurare il cambio di lunghezza del braccio.</li>
		<li>Collegare i tubi dal blocco termico sul supporto del campione a un bagno circolante refrigerato e impostare la temperatura per mantenere la temperatura desiderata nella camera a tra i 10 e i 40 gradi centigradi. Determinare questo empiricamente in anticipo impostando il bagno circolante a una gamma di temperature e misurando la temperatura nella camera con una termocoppia.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparazione muscolare
<ol><li>
Eutanasia del mouse
	<ol>
<li>Eutanasia il topo per inalazione di anidride carbonica seguita da lussazione cervicale.</li>
		<li>Spruzzare la pelle sull'arto posteriore con la soluzione fredda di Ringer per evitare che i capelli soffiano nella preparazione. Rimuovere la pelle tagliandola via intorno alla coscia utilizzando le forbici a dissezione fine e tirare rapidamente la pelle verso il basso utilizzando #5 forza per esporre i muscoli.</li>
		<li>Amputare l'arto posteriore e trasferirlo in un piatto di dissezione che è stato riempito con la soluzione di Ringer ossigenato, e quindi mettere sotto un microscopio di sezionoto binoculare.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione di un muscolo soleo
	<ol>
<li>Pin l'arto posteriore verso il basso nel piatto di dissezione con il muscolo gastrocnemio rivolto verso l'alto. Tagliare il tendine distale del gruppo muscolare gastrocnemius/soleus e sollevare i muscoli delicatamente e lentamente tagliando la fascia su entrambi i lati del muscolo gastrocnemio utilizzando forbici fini. Isolare il gruppo muscolare gastrocnemius/soleus dall'arto dopo aver liberato il tendine prossimale del muscolo soleo.</li>
		<li>Pin il gruppo muscolare contenente il muscolo gastrocnemio e il tendine distale giù nel piatto di dissezione. Sollevare delicatamente il muscolo del sole attraverso il tendine prossimale e separarlo dal muscolo gastrocnemio lasciando intatto la maggior parte del tendine distale soleus.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione di un muscolo edlorio longus (EDL) dell'estensore
	<ol>
<li>Fissare l'arto posteriore verso il basso nel piatto di dissezione con il muscolo anteriore tibialis rivolto verso l'alto. Tagliare la fascia lungo il muscolo tibialis anteriore (TA) e tirarlo chiaro con le pinze. Identificare e tagliare il tendine distale del muscolo TA. Sollevare il muscolo TA e tagliarlo con attenzione senza tirare sul muscolo EDL.</li>
		<li>Tagliare aprire il lato laterale del ginocchio ed esporre i due tendini. Tagliare il tendine prossimale, lasciando il più possibile il tendine possibile ancora attaccato al muscolo, e sollevare il muscolo EDL (muscolo mediale) tirando delicatamente il tendine. Tagliare il tendine distale una volta esposto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montare il muscolo
	<ol>
<li>Pin giù il muscolo attraverso i tendini, e tagliare tutto il grasso in più, fascia e tendine via il più possibile. Inserire un tendine in un nodo pre-legato e legare saldamente la sutura con pinze di sutura. Legare il secondo nodo intorno al gancio metallico.</li>
		<li>Ripetere la stessa procedura con il gancio lungo all'altra estremità del tendine. Assicurarsi che nessuno del corpo del muscolo sia contattato dalle suture. Questo danneggerà la preparazione.</li>
		<li>Fissare il gancio corto alla parte inferiore della camera sperimentale e il gancio lungo al trasduttore/motore a doppia forza. Bolla la soluzione nella camera sperimentale con ossigeno 100%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ottimizzazione dei protocolli di stimolazione e della lunghezza muscolare
	<ol>
<li>Allungare il muscolo regolando i micromanipolatori attaccati al trasduttore/motore per generare una tensione di base tra 15 a 20 mN prima di trovare i migliori parametri di stimolo. Impostare la tensione di stimolazione a 40 V. La corrente di stimolazione viene sistematicamente aumentata fino a quando non vi è alcun ulteriore aumento della forza di contrazione. La corrente più alta trovata è aumentata di circa il 50% per garantire l'attivazione sovra-massimale.</li>
		<li>Trova la lunghezza ottimale, L0, definita come la lunghezza muscolare che dà la massima forza di contrazione, aumentando la lunghezza muscolare e attivando il muscolo con una singola contrazione fino a quando la forza attiva (forza di picco meno forza di base) smette di aumentare.</li>
		<li>Eseguire una breve contrazione tetanica (attivazione di 1 s) per testare il montaggio e allungare il muscolo indietro alla forza di base ottimale, se necessario. Registrare la lunghezza muscolare in mm con una pinza digitale.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Diffrazione a raggi X
 NOT:</</c0> La seguente descrizione è per gli esperimenti di diffrazione a raggi X effettuati utilizzando lo strumento di diffrazione a raggi X piccolo angolare sulla trave BioCAT 18ID presso l'Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory, ma metodi simili potrebbero essere impiegati su altre travi come l'ID 02 all'ESRF (Francia) e BL40XU a SPring8 (Giappone). Beamline 18ID è azionato a un'energia a raggi X fissa di 12 keV (lunghezza d'onda di 0,1033 nm) con un flusso di incidenti di 1013 fotoni al secondo nel fascio completo.
<ol><li>Scegliere un campione per rilevare la distanza (lunghezza della fotocamera). Utilizzare una lunghezza della fotocamera di 1,8 m per gli esperimenti che esaminano l'actin di 2,7 nm e le riflessioni di miosina di alto ordine, ad esempio riflessioni meridionali di 2,8 nm. Utilizzare una fotocamera di 4-6 m per altri esperimenti, dove uno è principalmente interessato ai minimi dettagli sulle linee meridiane e strato</li>
	<li>
Ottimizzazione della posizione del campione nel fascio
	<ol>
<li>Determinare la posizione del fascio utilizzando un pezzo di carta sensibile ai raggi X che produce un punto scuro in risposta ai raggi X ("un'ustione"). Quindi utilizzare un generatore di capelli incrociati video per creare un mirino allineato con il segno di masterizzazione sulla carta o semplicemente fare un segno sullo schermo video con una penna pennarello.</li>
		<li>Utilizzare l'interfaccia utente grafica fornita da BioCAT al posizionatore campione per spostare il muscolo da centrare sulla posizione del fascio. Oscillare la camera campione a 10-20 mm/s spostando lo stadio del campione per diffondere la dose di raggi X sul muscolo durante l'esposizione. Osservare il campione mentre si muove per evitare grandi regioni di fascia (contiene collagene che inquina i modelli di diffrazione) e per garantire che rimanga illuminato durante l'intero percorso del suo viaggio. NOT:</</c2> I passaggi esatti necessari nelle sezioni 3.3 e 3.4 per effettuare le impostazioni e le azioni necessarie utilizzando l'interfaccia utente grafica fornita dalla trave saranno travi e rilevatori specifici. Chiedere al personale della trave come eseguire queste operazioni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Impostazione del rilevatore CCD (dispositivo accoppiato a carica) per modelli ad alta risoluzione dal muscolo in stati stati stati stati stati stati stati statidefiniti (riposo o durante la contrazione isometrica)
	<ol>
<li>Impostare il tempo di esposizione e il periodo di esposizione nell'interfaccia utente grafica al software di controllo. Prendere un'immagine di sfondo scura prima di prendere l'esposizione e ripetere questa procedura ogni 2 ore o dopo il cambio del tempo di esposizione per correggere eventuali deriva nell'elettronica di lettura del rilevatore.</li>
		<li>Attenuare il fascio di raggi X al valore desiderato per l'esposizione. Poi prendi un'immagine. Non è possibile prendere sequenze di immagini con questo rilevatore. Il rilevatore CCD ha anche bisogno di alcuni secondi per leggere una singola immagine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Impostazione del rilevatore di matrici di pixel per un esperimento risolto nel tempo
	<ol>
<li>Impostare il numero di immagini, il tempo di esposizione, il periodo di esposizione nell'interfaccia utente grafica. Il rilevatore di matrici di pixel utilizzato in questo caso richiede almeno 1 ms per la lettura. La frequenza massima dei fotogrammi per il rilevatore di conteggio dei fotoni è 500 Hz. Utilizzare il segnale di uscita del rilevamento del conteggio foton per controllare l'otturatore a raggi X.</li>
		<li>Attenuare il fascio in base all'intensità desiderata. Armare il rilevatore e attendere il trigger dal sistema di acquisizione dati. Sincronizzare i dati meccanici e a raggi X attivandoli contemporaneamente. I modelli a raggi X vengono raccolti continuamente durante il protocollo a con un tempo di esposizione di 1 ms e un periodo di esposizione di 2 ms. NOT:</</c7> L'esatto tempo di esposizione e il periodo di esposizione devono essere determinati caso per caso per le informazioni desiderate e la durata osservata del campione nel fascio. Attenuare il fascio per non utilizzare più fascio di raggi X di quelli necessari per fornire dati analizzabili nel periodo di esposizione scelto.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Trattamento muscolare post-esperimento
<ol><li>Recuperare e pesare il muscolo dopo ogni esperimento meccanico e a raggi X. Calcolare l'area trasversale del muscolo utilizzando la lunghezza muscolare misurata e la massa muscolare11 assumendo una densità muscolare di 1,06 g/mL12.</li>
	<li>Allungare il muscolo alla lunghezza sperimentale e fissare il muscolo in formalina 10% per 10 min. Separa il muscolo fisso in una serie di fasci di fibra selezionati da posizioni in tutta la sezione trasversale muscolare3.</li>
	<li>Misurare la lunghezza del sarcomero utilizzando un sistema di misurazione della lunghezza del video sarcomero.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ma, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thick-Filament+Extensibility+in+Intact+Skeletal+Muscle.">Thick-Filament Extensibility in Intact Skeletal Muscle.</a> Biophysical Journal. 115 (8), 1580-1588 (2018).</li><li>Ma, W., Gong, H., Irving, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Head+Configurations+in+Resting+and+Contracting+Murine+Skeletal+Muscle.">Myosin Head Configurations in Resting and Contracting Murine Skeletal Muscle.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), (2018).</li><li>Kiss, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nebulin+stiffens+the+thin+filament+and+augments+cross-bridge+interaction+in+skeletal+muscle.">Nebulin stiffens the thin filament and augments cross-bridge interaction in skeletal muscle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (41), 10369-10374 (2018).</li><li>Ochala, J., Gokhin, D. S., Iwamoto, H., Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pointed-end+capping+by+tropomodulin+modulates+actomyosin+crossbridge+formation+in+skeletal+muscle+fibers.">Pointed-end capping by tropomodulin modulates actomyosin crossbridge formation in skeletal muscle fibers.</a> Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 28 (1), 408-415 (2014).</li><li>Lindqvist, J., Iwamoto, H., Blanco, G., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fraction+of+strongly+bound+cross-bridges+is+increased+in+mice+that+carry+the+myopathy-linked+myosin+heavy+chain+mutation+MYH4(L342Q).">The fraction of strongly bound cross-bridges is increased in mice that carry the myopathy-linked myosin heavy chain mutation MYH4(L342Q).</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 6 (3), 834-840 (2013).</li><li>Huxley, H. E., Stewart, A., Sosa, H., Irving, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+diffraction+measurements+of+the+extensibility+of+actin+and+myosin+filaments+in+contracting+muscle.">X-ray diffraction measurements of the extensibility of actin and myosin filaments in contracting muscle.</a> Biophysical Journal. 67 (6), 2411-2421 (1994).</li><li>Wakabayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+diffraction+evidence+for+the+extensibility+of+actin+and+myosin+filaments+during+muscle+contraction.">X-ray diffraction evidence for the extensibility of actin and myosin filaments during muscle contraction.</a> Biophysical Journal. 67 (6), 2422-2435 (1994).</li><li>Anderson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mavacamten+stabilizes+a+folded-back+sequestered+super-relaxed+state+of+&#946;-cardiac+myosin.">Mavacamten stabilizes a folded-back sequestered super-relaxed state of &#946;-cardiac myosin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2018).</li><li>National Research Council. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+for+the+care+and+use+of+laboratory+animals.">Guide for the care and use of laboratory animals.</a> Institute for Laboratory Animal Research (U.S.) &amp; National Academies Press (U.S.). , (2011).</li><li>. How to Calibrate Your Dual-Mode Lever System Using DMC Available from: <a target="_blank" href="https://aurorascientific.com/how-to-calibrate-your-dual-mode-lever-system-using-dmc/">https://aurorascientific.com/how-to-calibrate-your-dual-mode-lever-system-using-dmc/</a> (2017)</li><li>Alexander, R. M. V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dimensions+of+knee+and+ankle+muscles+and+the+forces+they+exert.">The dimensions of knee and ankle muscles and the forces they exert.</a> Journal of Human Movement Studies. 1, 115-123 (1975).</li><li>Burkholder, T. J., Fingado, B., Baron, S., Lieber, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+Muscle-Fiber+Types+and+Sizes+and+Muscle+Architectural+Properties+in+the+Mouse+Hindlimb.">Relationship between Muscle-Fiber Types and Sizes and Muscle Architectural Properties in the Mouse Hindlimb.</a> Journal of Morphology. 221 (2), 177-190 (1994).</li><li>Jiratrakanvong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MuscleX: software suite for diffraction X-ray imaging V1.13.1. , (2018).</li><li>Reconditi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+filament+activation+in+the+heart+is+tuned+to+the+mechanical+task.">Myosin filament activation in the heart is tuned to the mechanical task.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 3240-3245 (2017).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Recenti pubblicazioni del nostro gruppo hanno mostrato che i modelli a raggi X del muscolo scheletrico del topo possono essere utilizzati per far luce sulle informazioni strutturali sareriche dal muscolo nella salute e nella malattia1,2,3 soprattutto con la maggiore disponibilità di modelli murini geneticamente modificati per varie miopatie. Gli studi meccanici ad alta risoluzione su fibre singole o piccoli fasci combinati con la diffrazione a raggi X sono i migliori da parte di esperti. Se, tuttavia, saranno sufficienti informazioni meccaniche più modeste per i tuoi scopi, l'intera preparazione muscolare consente la raccolta di modelli di raggi X dettagliati da una semplice preparazione.
Una dissezione pulita è la chiave per un esperimento meccanico e a raggi X combinato di successo. È molto importante non tirare sul muscolo bersaglio così come altri muscoli associati con i muscoli soleus o EDL durante la dissezione dal momento che questo potrebbe strappare parti del muscolo e portare alla forza ridotta. Può anche portare a una struttura interna danneggiata che degrada i modelli a raggi X. Dal momento che tutto si disperderà nel fascio di raggi X, è importante pulire via qualsiasi grasso in più, il collagene nella fascia così come eventuali peli o pezzi di tessuto sciolti mentre si fa il seguente protocollo. Per ridurre ulteriore conformità nella preparazione muscolare, è anche importante legare in modo sicuro i tendini ai ganci, il più vicino possibile al corpo muscolare senza danneggiarlo.
Tempi di esposizione ai raggi X diversi possono fornire diversi tipi di informazioni dallo stesso muscolo. Utilizzando il fascio completo su 18ID, un modello equatoriale analizzabile può essere ottenuto in un'esposizione di 1 ms (vedere Figura 2D). Per una prima riflessione della linea del livello myosin analizzabile, è in genere necessario un tempo di esposizione totale di 10 ms. Per raccogliere riflessioni meridionali di ordine più elevato come l'M15 (2,8 nm myosin meridional reflection) e la riflessione meridionale actin di 2,7 nm, in genere è necessaria un'esposizione totale di almeno 1 s, ma è consigliata un'esposizione totale superiore a 2 s per un'elevata precisione Misure.
La scelta del rilevatore di raggi X ottimale per l'esperimento è importante. Per i modelli a raggi X più dettagliati, un rilevatore CCD personalizzato, come quello del BioCAT con 40 pixel e 65 punti di diffusione nel fosforo, può fornire modelli con un'elevata gamma dinamica e una buona risoluzione spaziale, ma può richiedere solo un fotogramma alla volta. Per gli esperimenti risolti nel tempo, il rilevatore di array di pixel di conteggio dei fotoni di BioCAT è in grado di raccogliere modelli di raggi X a 500 Hz. La dimensione dei pixel di 172 m con questo rilevatore, tuttavia, non fornisce una risoluzione spaziale sufficiente per studi dettagliati della parte interna del meridiano, ma è adeguata per la maggior parte degli altri scopi. BioCAT ha acquisito un rilevatore di fotoni ad alta risoluzione che fornisce una risoluzione reale di 75 m alla frequenza fotogrammi massima di 9.000 Hz. Si prevede che rilevatori simili di questo tipo sostituiranno i rilevatori di corrente per gli studi muscolari nei prossimi anni.
Con i flussi molto elevati di raggi X a sincrotroni di terza generazione, i danni da radiazioni sono una seria preoccupazione. È sempre una buona scelta attenuare il fascio per fornire non più fascio di quanto sia necessario per osservare le caratteristiche di diffrazione desiderate. La stessa esposizione totale ai raggi X può essere ottenuta prolungando il tempo di esposizione da un fascio attenuato. Un vantaggio del conteggio dei rilevatori di array di pixel per il conteggio dei fotoni è che i singoli fotogrammi possono essere sommati insieme senza alcuna riduzione del rumore. Anche in questo caso, il danno da radiazioni è possibile. I segni di danno da radiazioni includono la caduta della forza massima di contrazione, la sfonificazione dei riflessi della linea di strato, persino il cambiamento del colore muscolare.
Uno dei limiti della preparazione intatta del muscolo scheletrico del topo è la difficoltà nell'ottenere la lunghezza del sarcomero dal muscolo intatto durante gli esperimenti. I muscoli sono troppo spessi per la microscopia video e la diffrazione laser. Mentre con gli sviluppi futuri potrebbe essere possibile stimare la lunghezza del sarcomero direttamente dai modelli di diffrazione14, nel breve termine l'unica opzione è misurarla dopo l'esperimento come descritto qui.

La diffrazione a raggi X a piccolo angolo del sincrotrone è il metodo di scelta per studiare la struttura su scala nm di contrarre attivamente le preparazioni muscolari in condizioni fisiologiche. È importante sottolineare che le informazioni strutturali provenienti da preparati muscolari vivi o scuoiati possono essere ottenute in sincronia con dati fisiologici, come la forza muscolare e i cambiamenti di lunghezza. C'è stato un crescente interesse nell'applicare questa tecnica per studiare la base strutturale delle malattie muscolari ereditarie che hanno la loro base in mutazioni puntiformi nelle proteine sarcomeriche. La comunità della biofisica muscolare è stata molto attiva nella generazione di modelli murini transgenici per queste condizioni di malattia umana che potrebbero fornire letti di prova ideali per studi strutturali. Recenti pubblicazioni del nostro gruppo1,2,3 e altre4,5 hanno indicato che i modelli a raggi X dal digitalorum longus (EDL) e al sole possono fornire tutti i informazioni sulla diffrazione disponibili da organismi modello più tradizionali come il muscolo scheletrico della rana e del coniglio. Un vantaggio della preparazione muscolare scheletrica del topo è la facilità di dissezione ed esecuzione di base membrana-intatta, esperimenti fisiologici dell'intero muscolo. Le dimensioni del muscolo sezionato hanno una massa sufficiente a produrre modelli muscolari altamente dettagliati in tempi di esposizione ai raggi X molto brevi (millisecondi per fotogramma) sulle travi a raggi X di terza generazione.
I modelli di diffrazione a raggi X muscolari sono costituiti dai riflessi equatoriali, dai riflessi meridionali e dai riflessi della linea del livello. Il rapporto di intensità equatoriale (rapporto dell'intensità delle riflessioni equatoriali 1,1 e 1,0, I11/I10), è strettamente correlato al numero di ponti trasversali collegati, che è proporzionale alla forza generata nel muscolo scheletrico del mouse 2.Le riflessioni meridionali che riportano periodicità all'interno dei filamenti spessi e sottili possono essere utilizzate per stimare l'estendibilità del filamento1,3,6,7. Le caratteristiche di diffrazione non sul meridiano e l'equatore sono chiamate linee di strato, che derivano dalle teste di miosina approssimativamente ordinate eleviamente sulla superficie della spina dorsale del filamento spesso e dai filamenti sottili ordinati grossolanamente. L'intensità delle linee dello strato di miosina è strettamente correlata al grado di ordinamento delle teste di miosina in varie condizioni2,8. Tutte queste informazioni possono essere utilizzate per studiare i comportamenti delle proteine sarcomeriche in situ in salute e malattia.
La diffrazione a raggi X del sincrotrone del muscolo è stata storicamente fatta da team di esperti altamente specializzati, ma i progressi tecnologici e la disponibilità di nuovi strumenti di riduzione dei dati indicano che questo non deve essere sempre il caso. Il BioCAT Beamline 18ID presso l'Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory ha dedicato personale e strutture di supporto per l'esecuzione di esperimenti di diffrazione muscolare a raggi X che possono aiutare i nuovi arrivati nel campo a iniziare a utilizzare queste tecniche. Molti utenti scelgono di collaborare formalmente con il personale BioCAT, ma un numero crescente di utenti trova di poter fare gli esperimenti e l'analisi stessa riducendo l'onere per il personale della trave. L'obiettivo principale di questo documento è quello di fornire ai potenziali sperimentatori le informazioni di cui hanno bisogno per pianificare ed eseguire esperimenti sul sistema muscolare scheletrico del mouse sia alla trave BioCAT che ad altre travi ad alto flusso intorno al mondo in cui questi esperimenti sarebbero possibili.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:793px;" width="793">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">#5 forceps</td>
			<td style="width:131px;">WPI</td>
			<td style="width:87px;">500342</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">4/0 surgical suture</td>
			<td style="width:131px;">Braintree Sci</td>
			<td>SUT-S 108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">aquarium air stone</td>
			<td>uxcell</td>
			<td></td>
			<td>a regular air stone from a pet store would be fine</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CCD detector</td>
			<td>Rayonix Inc</td>
			<td>MAR 165 CCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">data accquisition system</td>
			<td>Aurora Scientific Inc</td>
			<td>610A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">elastomer compound</td>
			<td style="width:131px;">Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:240px;">High resolution photon counting detector</td>
			<td>Dectris Inc</td>
			<td>EIGER X 500K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">high-power bi-phasic current stimulator</td>
			<td>Aurora Scientific Inc</td>
			<td>701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iris Scissors</td>
			<td style="width:131px;">WPI</td>
			<td>501263-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">micro scissor</td>
			<td style="width:131px;">WPI</td>
			<td>503365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">motor/force transducer</td>
			<td>Aurora Scientific Inc</td>
			<td>300C-LR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">petri-dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">photon counting detector</td>
			<td>Dectris Inc</td>
			<td>Pilatus 3 1M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless Steel wire</td>
			<td style="width:131px;">McMaster-carr</td>
			<td>8908K21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Suture Tying Forceps</td>
			<td style="width:131px;">WPI</td>
			<td>504498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Video sarcomere length measuring system</td>
			<td>Aurora Scientific Inc</td>
			<td>900B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

x-ray diffraction of intact murine skeletal muscle as a tool for studying the structural basis of muscle disease

I modelli murini transgenici sono stati strumenti importanti per studiare la relazione tra genotipo e fenotipo per le malattie umane, comprese quelle del muscolo scheletrico. Il muscolo scheletrico del mouse ha dimostrato di produrre modelli di diffrazione a raggi X di alta qualità sulle travi di sincrotrone di terza generazione, offrendo l'opportunità di collegare i cambiamenti a livello del genotipo ai fenotipi funzionali nella salute e nella malattia determinando le conseguenze strutturali dei cambiamenti genetici. Presentiamo protocolli dettagliati per la preparazione degli esemplari, raccogliendo i modelli a raggi X ed estraendo i parametri strutturali rilevanti dai modelli a raggi X che possono aiutare gli sperimentatori che desiderano eseguire tali esperimenti per se stessi.

Contrazione tetanica isometrica. Qualsiasi tipo di esperimento meccanico muscolare classico, come contrazioni isometriche o isotoniche, può essere eseguito con l'acquisizione simultanea di modelli a raggi X. Figura 1 A mostra la configurazione sperimentale per esperimenti meccanici e a raggi X. Un esempio di traccia di forza per una contrazione tetanica iometrica è illustrato nella Figura 1B. Il muscolo è stato tenuto a riposo per 0,5 s prima attivato per 1 s. La registrazione meccanica si interrompe di 1 s dopo lo stimolo. I modelli a raggi X sono stati raccolti continuamente durante il protocollo a 1 ms di tempo di esposizione a 500 Hz.
Modelli di diffrazione a raggi X. Il modello di diffrazione muscolare a raggi X può fornire informazioni strutturali di risoluzione nanometrica provenienti da strutture all'interno del sarcomere. I modelli di diffrazione a raggi X muscolari sono composti da quattro quadranti equivalenti divisi per l'equatore e il meridiano. Il modello equatoriale deriva dall'imballaggio del miofilamento all'interno del sarcomere perpendicolare all'asse della fibra, mentre i modelli meridionali riportano informazioni strutturali dai miofili lungo l'asse muscolare. I riflessi rimanenti non sull'equatore o sul meridiano sono chiamati linee di livello. Le linee di livello (ad esempio, le caratteristiche etichettate MLL4 e ALL6 nella Figura 2A) derivano dalla disposizione approssimativamente elicoidale delle sottounità molecolari all'interno del miosina contenente filamenti spessi e l'actina contenente filamenti sottili. Le linee di strato a base di miosina sono forti e taglienti nei modelli dal muscolo a riposo (Figura 2A), mentre le linee di strato basate su actin sono più prominenti nei modelli da muscolo contrarre (Figura 2B). I modelli di differenza ottenuti sottraendo il modello di riposo dal modello di contrarre (Figura 2C) possono far luce sui cambiamenti strutturali durante lo sviluppo della forza nel muscolo sano e malato. Seguendo questi cambiamenti strutturali alla scala temporale dei millisecondi degli eventi molecolari durante la contrazione muscolare, i modelli di diffrazione a raggi X possono rivelare informazioni strutturali sostanziali (Figura 2D).
Analisi dei dati tramite MuscleX. Di seguito è riportato un esempio di analisi delle riflessioni equatoriali utilizzando la routine "equatore" nel pacchetto MuscleX (Figura 3). MuscleX è un pacchetto software di analisi open source sviluppato presso BioCAT13. Il rapporto di intensità equatoriale (I1,1/I1,0) è un indicatore della vicinanza della miosina all'actin nel muscolo a riposo (Figura 3A), mentre è strettamente correlato al numero di ponti trasversali collegati nel contrattazione ( Figura 3B) murino muscolo scheletrico2. Il rapporto di intensità, I1,1/I1,0, è di circa 0,47 nel muscolo a riposo e di circa 1,2 nel muscolo contraente. La distanza tra i due riflessi di 1,0 (2-S1,0) è inversamente correlata alla spaziatura tra i filamenti. Documentazione dettagliata e manuali per MuscleX sono disponibili online13.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59559/59559fig1.jpg"> Figura 1 : configurazione e protocollo dell'esperimento meccanico e a raggi X. (A) Il muscolo è montato su un'estremità di un gancio all'interno della camera sperimentale e l'altra ad un trasduttore motore/forza a doppia modalità. Si svolge tra due pellicole Kapton per permettere ai raggi X di passare. La camera è riempita con la soluzione di Ringer perfusa con ossigeno al 100% durante l'esperimento. (B) Il protocollo meccanico per gli esperimenti a raggi X su un muscolo durante la contrazione tetanica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59559/59559fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59559/59559fig2.jpg"> Figura 2 : modelli di diffrazione a raggi X EDL. Modello di diffrazione a raggi X del muscolo EDL dal muscolo a riposo (A) e dalla contrazione (B). (C) Il modello di differenza tra il modello di riposo e quello di contrarre. La regione blu indica un'elevata intensità nel modello a riposo, mentre la regione gialla rappresenta un'intensità elevata nel modello di contraimento. (D) modello di diffrazione a raggi X da un'esposizione di 1 ms con muscolo EDL. MLL1 - Linea di livello myosin di primo ordine; MLL4 - Quarta linea di strati miosina; ALL1 - Linea di strato actin a1/2ordine ALL6 - Sesto ordine linea di strati; ALL7 - Settimo ordine linea di strato; Riflesso di tropomyosina (indicato da una scatola bianca); M3 - riflessione meridionale di terzo ordine; M6 - sesto ordine riflessione meridionale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59559/59559fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59559/59559fig3.jpg"> Figura 3 : analisi dei dati dei modelli equatoriali utilizzando MuscleX. Lo sfondo sottrasse il profilo del rapporto di intensità equatoriale (mentre l'area) e i primi cinque ordini (linee verdi) erano adatti per calcolare l'intensità di ogni picco. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59559/59559fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease

Diffrazione a raggi X del muscolo scheletrico Murine intatto come strumento per studiare la base strutturale della malattia muscolare

Vi presentiamo protocolli dettagliati per l'esecuzione di esperimenti di diffrazione a raggi X a piccolo angolo utilizzando muscoli scheletrici del topo intatti. Con l'ampia disponibilità di modelli murini transgenici per le malattie umane, questa piattaforma sperimentale può costituire un utile banco di prova per chiarire la base strutturale delle malattie genetiche muscolari

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal ...

Il muscolo scheletrico del topo fisiologicamente intatto può produrre modelli di diffrazione a raggi X di alta qualità contenenti molte informazioni strutturali in grado di fornire informazioni sui processi fisiologici. La diffrazione a raggi X è l'unica tecnica che consente l'acquisizione di informazioni strutturali ad alta risoluzione dal tessuto muscolare vivente in condizioni fisiologiche reali in tempo fisiologico reale. Molte malattie muscolari sono ereditate.Con una maggiore disponibilità a modificare geneticamente la maggior parte dei modelli di miopatie, la diffrazione dei raggi X può fornire approfondimenti strutturali nei meccanismi della malattia e indicare strategie terapeutiche. La maggior parte dei muscoli estensori digitorum longus e soleus sono particolarmente convenienti per questo scopo. Ma molti altri muscoli di piccoli animali possono essere sezionati intatti e maneggiati in modo simile.Prima di iniziare la procedura, accendere il trasduttore combinato della forza del motore, il controller del trasduttore della forza del motore con uno stimolatore di corrente bifasica ad alta potenza e un sistema di controllo dell'acquisizione dei dati di controllo del computer. Successivamente, spruzzare la pelle sull'arto posteriore del mouse con la soluzione fredda di Ringer e utilizzare forbici a dissezione fine per tagliare la pelle intorno alla coscia. Usando le forcette numero cinque, tirare rapidamente la pelle verso il basso per esporre i muscoli e amputare l'arto posteriore.Posizionare l'arto in una sezionatura rivestita di elastomero contenente la soluzione di Ringer ossigenata e posizionare il piatto sotto un microscopio di sezionatura binoculare. Per raccogliere il muscolo soleo, inchiodare l'arto posteriore con il muscolo gastrocnemio rivolto verso l'alto. Utilizzare forbici fini per tagliare il tendine distale del gruppo muscolare gastrocnemio/soleo.Tagliare la fascia su entrambi i lati del muscolo gastrocnomio per consentire ai muscoli di essere sollevati delicatamente e lentamente lontano dall'osso. Quindi liberare il tendine prossimale del muscolo soleo. Inchiodare il gruppo muscolare contenente il muscolo gastrocnemio e il tendine distale nel piatto.Sollevare delicatamente il muscolo soleo attraverso il tendine prossimale per separarlo dal muscolo gastrocnemio, lasciando intatto il più possibile il tendine distale soleus. Per raccogliere il muscolo estensore digitorum longus o EDL, inchiodare l'arto posteriore nel piatto con il muscolo anteriore tibiale rivolto verso l'alto e tagliare la fascia lungo il muscolo anteriore tibiale. Utilizzare le flessione per liberare la fascia e tagliare il tendine distale del muscolo anteriore della tibialis.Sollevare il muscolo tibiale anteriore e tagliarlo con attenzione senza tirare il muscolo EDL e tagliare il lato laterale del ginocchio per esporre i due tendini. Tagliare il tendine prossimale, lasciandoci gran parte del tendine il più possibile ancora attaccato al muscolo e tirare delicatamente il tendine per sollevare il muscolo EDL. Quindi tagliare il tendine distale una volta esposto.Per montare il muscolo raccolto, fissare il muscolo attraverso i tendini e tagliare il maggior numero possibile di grasso, fascia e tendine extra. Inserire un tendine in un nodo pre-legato e utilizzare le forcep di legatura della sutura per legare saldamente la sutura. Legare il secondo nodo attorno al gancio metallico e ripetere la procedura sull'altra estremità del tendine.Quindi attaccare il gancio corto sul fondo della camera sperimentale e il lungo gancio al motore del trasduttore di forza a doppia modalità. Bollare la soluzione nella camera sperimentale con 100% di ossigeno. Per ottimizzare il protocollo di stimolazione e la lunghezza muscolare regolare i micro manipolatori collegati al motore del trasduttore per generare una tensione di base compresa tra 15 e 20 millinewton per trovare i migliori parametri di stimolo per allungare il muscolo.Impostare la tensione di stimolazione su 40 volt. La corrente di stimolazione verrà sistematicamente aumentata fino a quando non vi sarà alcun aumento aggiuntivo della forza di contrazione. Per trovare la lunghezza ottimale, aumentare la lunghezza muscolare e attivare il muscolo con una singola contrazione fino a quando la forza attiva smette di aumentare.Eseguire una contrazione tetanica di un secondo per testare il montaggio e allungare il muscolo alla forza di base ottimale, se necessario. Quindi registrare la lunghezza muscolare in millimetri con una pinza digitale. Per determinare la posizione del fascio, utilizzare un pezzo di carta sensibile ai raggi X che produce una macchia scura in risposta ai raggi X e un generatore di mirino video per creare un mirino allineato con il segno di bruciatura sulla carta.Utilizzando l'interfaccia utente grafica fornita da BioCAT al posizionatore del campione, centrare il muscolo sulla posizione del fascio e spostare lo stadio del campione per oscillare la camera del campione a 10-20 millimetri al secondo per distribuire la dose di raggi X su tutto il muscolo durante l'esposizione. Osservare il campione mentre si muove per evitare grandi regioni di fascia che contengono collagene e per assicurarsi che rimanga illuminato durante l'intero percorso del suo viaggio. Armare il rilevatore e attendere il trigger dal sistema di acquisizione dati.Quindi attivare i dati meccanici e a raggi X contemporaneamente per sincronizzarli. I modelli a raggi X verranno raccolti continuamente in tutto il protocollo con un tempo di esposizione di 10 millisecondi e un periodo di esposizione di 50 millisecondi. In questa contrazione tetanica isometrica rappresentativa il muscolo EDL è stato tenuto a riposo per 0,5 secondi prima di essere attivato per un secondo, seguito da un rilassamento di 1,5 secondi.Il modello di diffrazione dei raggi X muscolari può fornire informazioni strutturali sulla risoluzione nanometrica dalle strutture all'interno del sarcomero. Le linee di strato a base di miosina contenenti filamenti spessi sono forti e affilate nei modelli dei muscoli a riposo, mentre le linee di strato a base di actina contenenti filamenti sottili sono più prominenti nei modelli di contrarre i muscoli. I modelli di differenza ottenuti sottraendo il modello di riposo dal modello di contrazione possono far luce sui cambiamenti strutturali durante lo sviluppo della forza nel muscolo sano e mato.Seguendo questi cambiamenti strutturali alla scala temporale millisecondo degli eventi molecolari durante la contrazione muscolare e il rilassamento, i modelli di diffrazione dei raggi X possono rivelare informazioni strutturali sostanziali. In questa rappresentante analisi delle riflessioni equatoriali usando la routine equatore nel pacchetto MuscleX open source, il rapporto di intensità equatoriale indica la vicinanza della miosina all'actina nel muscolo a riposo ed è strettamente correlato al numero di ponti trasversali attaccati nel contrarre il muscolo scheletrico murino. La distanza tra la riflessione 1, 0 è inversamente correlata alla spaziatura dell'interfilamento.Una dissezione pulita è la chiave per un esperimento a raggi X muscolare intatto di successo, quindi cerca di evitare danni meccanici durante la preparazione muscolare. Qualsiasi protocollo fisiologico standard con muscoli interi può essere implementato in questi esperimenti e può essere utilizzato per studiare l'attivazione muscolare, il rilassamento e il comportamento cross-bridge durante la rapida caescenza meccanica. La manipolazione genetica dei topi sta diventando sempre più sofisticata.I nuovi modelli di topi transgenici consentiranno di progettati esperimenti più specifici e approfonditi per indicare nuove direzioni terapeutiche per le miopatie umane.

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Unit 1

The Cytoskeleton I: Actin and Microfilaments

Analyzing Cells and Proteins

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Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analisi delle larve Zebrafish muscolo scheletrico Integrità con Blu di Evans Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Utilizzo di mitocondri isolati da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per High micropiastre rendimento respiratorie Misure

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Induzione di acuta muscolo scheletrico Rigenerazione da cardiotossina Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Preparazione e la cultura di cellule miogeniche Precursore / mioblasti primari dal muscolo scheletrico di adulti e esseri umani invecchiati

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Valutazione delle lesioni-indotta senescenza e In Vivo riprogrammazione nel muscolo scheletrico

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Applicazione di stimolazione cronica per lo studio del ratto indotta da attività contrattile del muscolo scheletrico fenotipica adattamenti

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Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

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In Vivo Formazione immagine del muscolo-tendine morfogenesi in Drosophila pupe

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

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Isolamento, cultura, caratterizzazione e differenziazione delle cellule del progenitore muscolare umano dalla procedura di biopsia muscolare scheletrica

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

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Esecuzione di Xenografi muscolari scheletrici umani in topi immunodeficienti

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...