यह वास्तविक समय आरटी-पीसीआर पूर्व-पोस्टमार्टम और पोस्टमार्टम नमूनों में रेबीज का तेजी से निदान करने के लिए उपयुक्त है। Lyssavirus जीनस के सभी सदस्यों की पहचान करने के लिए पैन-Lyssavirus प्राइमर को अनुकूलित किया गया है। यह एक तेजी से, संवेदनशील, और बंद ट्यूब परख है जो नैदानिक नमूनों से अत्यधिक भिन्न प्रजातियों सहित Lyssavirus जीनस भर से वायरस का पता लगाता है।
ओआईई ने हाल ही में रेबीज संक्रमण की रिपोर्ट करने के लिए आणविक परख स्वीकार की है । यह विघटित नमूनों के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जो हमेशा वायरस संस्कृति या एंटीजन डिटेक्शन विधियों द्वारा निदान नहीं किया जा सकता है। इस परख की संवेदनशीलता के कारण, संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए विभिन्न चरणों को अलग करने सहित अच्छी प्रयोगशाला अभ्यास महत्वपूर्ण है।
प्रक्रिया का प्रदर्शन डेज़ी जेनिंग्स, मेरी प्रयोगशाला से एक निदान होगा । एक माइक्रो वॉल्यूम स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ आरएनए की मात्रा निर्धारित करके शुरू करें। सुनिश्चित करें कि मशीन आरएनए के लिए सेट है और मशीन को सामान्य बनाने और एक आधार रेखा स्थापित करने के लिए आणविक ग्रेड पानी के एक से दो माइक्रोलीटर का उपयोग करें।
आरएनए एकाग्रता को मापें और इसे एक माइक्रोग्राम प्रति माइक्रोलीटर में समायोजित करें। परीक्षण और नियंत्रण दोनों नमूनों को ध्यान में रखते हुए स्प्रेडशीट के साथ अपनी पीसीआर प्लेट के लेआउट की योजना बनाएं। सतहों को कीटाणुरहित करके पीसीआर वर्कस्टेशन तैयार करें और यदि यूवी कैबिनेट का उपयोग कर रहे हैं, तो शुरू करने से 10 मिनट पहले यूवी लाइट चालू करें।
फ्रीजर से गल जाने के लिए रिएजेंट्स और प्राइमर निकालें लेकिन हर समय बर्फ पर एंजाइम मिक्स रखें । तरल इकट्ठा करने के लिए रिएजेंट्स और सेंट्रलाइज को संक्षेप में मिलाएं। पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार Lyssavirus और बीटा-Actin के लिए पीसीआर मास्टर घोला जा सकता है तैयार करें।
उपयोग करने के लिए तैयार होने तक मास्टर को बर्फ पर छोड़ दें। मिक्स और अपकेंद्रित्र तैयार मास्टर घोला जा सकता है और पीसीआर मशीन संगत प्लेट या ट्यूब पट्टी के प्रासंगिक कुओं में 19 माइक्रोलीटर बांटना । एक अलग कमरे या यूवी कैबिनेट में, तैयार आरएनए का एक माइक्रोलीटर सावधानी से जोड़ें।
यदि यूवी कैबिनेट का उपयोग कर रहे हैं, तो शुरू करने से 10 मिनट पहले यूवी लाइट चालू करें। परीक्षण नमूनों के बाद, सकारात्मक नियंत्रण और कोई टेम्पलेट नियंत्रण जोड़ें। मास्टर मिक्स करने के लिए आरएनए जोड़ते समय, सुनिश्चित करें कि यह सही अच्छी तरह से जोड़ा गया है।
इस चरण की सहायता के लिए प्लेट योजना का उपयोग करें। प्लेट को सील करें कि ढक्कन प्लेट के पार फ्लैट हैं और कुओं के तल पर सभी तरल इकट्ठा करने के लिए इसे नीचे स्पिन करते हैं। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक कुएं में तरल की एक ही मात्रा है और कोई बुलबुले दिखाई नहीं दे रहे हैं।
इसके बाद सैंपलों को पीसीआर मशीन में ट्रांसफर कर दें। वियोजन के साथ SYBR ग्रीन चुनने के कार्यक्रम खोलें। कुओं का चयन करने के लिए नमूना प्रकार और फ्लोरोसेंट डाई के रूप में SYBR के रूप में अज्ञात चुनने का विश्लेषण किया जाएगा ।
प्लेट लेआउट पर कुओं को नमूना जानकारी के साथ लेबल करें जिसमें यह शामिल है कि क्या परख Lyssavirus एल या बीटा-ऐक्टिन के लिए है। थर्मो प्रोफाइल सेटअप पर क्लिक करें और पांडुलिपि में निर्दिष्ट थर्मल साइकिलिंग स्थितियों को संशोधित करें। स्टार्ट पर क्लिक करें फिर फाइल को सेव करने के लिए एक स्थान चुनें और रन के अंत में लैंप को स्विच ऑफ करने के लिए बॉक्स की जांच करें।
जब लैंप वार्मअप दिखाई देने से पहले शुरू करने का विकल्प हो, तो अब चलाने पर क्लिक करें लेकिन यह सुनिश्चित करें कि दीपक के पास गर्म होने के लिए 15 मिनट से कम समय है। जब पीसीआर रन पूरा हो गया हो तो डाटा एनालिसिस के साथ आगे बढ़ें। सबसे पहले, Lyssavirus प्रवर्धन भूखंडों का विश्लेषण करें।
सकारात्मक नमूने घातीय रैंप प्रदर्शित करते हैं जबकि नकारात्मक नमूनों में कोई सीटी मूल्यों के साथ फ्लैट प्रवर्धन भूखंड होते हैं। इसके बाद, नियंत्रण नमूनों के साथ परीक्षण नमूनों के Lyssavirus वियोजन वक्र परिणामों का विश्लेषण करें। एक Lyssavirus सकारात्मक नमूने ७७ और ८० डिग्री सेल्सियस के बीच एक पिघलने का तापमान होगा और सकारात्मक नियंत्रण के साथ ओवरलैप ।
इसके बाद, समग्र परिणाम की व्याख्या करने के लिए नियंत्रणों के साथ तुलना करते हुए बीटा-ऐक्टिन प्रवर्धन भूखंडों और वियोजन घटता का विश्लेषण करें। टेक्स्ट रिपोर्ट देखें और एक नियंत्रण कार्ड में नियंत्रण आरएनए के लिए प्राप्त सीटी और टीएम मूल्यों को रिकॉर्ड करने के लिए विवरण का उपयोग करें ताकि यह पुष्टि की जा सके कि रन सफल रहा और परीक्षण नमूने के परिणामों की रिपोर्ट की जा सकती है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग नियंत्रण मानक वायरस की आरएनए कमजोर पड़ने श्रृंखला पर पैन-Lyssavirus आरटी-पीसीआर की संवेदनशीलता को प्रदर्शित करने के लिए किया जाता है।
प्रवर्धन वक्र इंगित करता है कि Lyssavirus के 10 पिकोग्राम का पता लगाया जा सकता है और वियोजन घटता उत्पाद के पिघलने के तापमान को सत्यापित करता है। पिघलने वाले तापमान का उपयोग इस बात की पुष्टि करने के लिए किया जाता है कि एम्प्लिकॉन लिसावायरस विशिष्ट है। यहां परिणाम ७७.३४ से ७९.६७ डिग्री सेल्सियस के Lyssavirus जीनस भर में एक पिघलने तापमान रेंज का प्रदर्शन ।
76.8 या 80.2 से ऊपर के पिघलने वाले तापमान मूल्यों को गैर-विशिष्ट माना जाता है। इस आरटी-पीसीआर परख की संवेदनशीलता भी तीन Lyssavirus पॉजिटिव ब्रेन सैंपल से आरएनए का पता लगाकर तय होती है । लक्ष्य आरएनए के माइक्रोलीटर प्रति 0.1 पिकोग्राम तीन नमूनों में से दो के लिए पता लगाया जा सकता है।
विशेष रूप से, इस परख का उपयोग करके सभी मान्यता प्राप्त Lyssavirus प्रजातियों के प्रतिनिधियों का पता लगाया जाता है। यदि लार या सीएसएफ जैसे नैदानिक नमूनों से आरएनए अर्क का विश्लेषण करते हैं, तो मेजबान न्यूक्लिक एसिड की कमी के कारण बीटा-ऐक्टिन परिणाम नकारात्मक हो सकते हैं। एक बहिर्जात नियंत्रण के अलावा इस समस्या को हल कर सकते हैं।
रेबीज संक्रमण के भौगोलिक और मेजबान मूल के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान करने के लिए Lyssavirus सकारात्मक नमूनों के अनुक्रमण की सिफारिश की जाती है। Lyssavirus सकारात्मक या संदिग्ध सकारात्मक नमूनों की हैंडलिंग स्थानीय स्वास्थ्य और सुरक्षा दिशा निर्देशों के अनुसार होना चाहिए । निकाले गए आरएनए गैर संक्रामक है, इसलिए कम रोकथाम प्रयोगशालाओं के भीतर संभाला जा सकता है ।
