Name: pan-lyssavirus real time rt-pcr for rabies diagnosis
Uploaded: 2019-07-10T14:00:00
Duration: 6 min 25 s
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लेखकों प्रयोगों को पूरा करने में सहायता के लिए मिस एम्मा वाइज और मिस मेगन गोल्डिंग शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. इस प्रोटोकॉल के विकास के लिए आर्थिक रूप से पर्यावरण, खाद्य और ग्रामीण मामलों के लिए ब्रिटेन विभाग (Defra), स्कॉटिश सरकार और वेल्श सरकार द्वारा अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था [SV3500, और SE0431] और यूरोपीय वायरस पुरालेख वैश्विक (EVAg) परियोजना है कि है अनुदान समझौते के तहत यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से धन प्राप्त नहीं 653316.

प्राकृतिक संक्रमण के बाद APHA में प्राप्त नैदानिक सामग्री से नमूने, या लाइसेंस के तहत ब्रिटेन के गृह कार्यालय के नियमों के तहत APHA नैतिकता और सांख्यिकीय समिति द्वारा मूल्यांकन प्रोटोकॉल का उपयोग कर चूहों inoculating द्वारा प्राप्त 70/
1. आरएनए की मात्रा एक माइक्रो मात्रा स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग
<ol><li>स्पेक्ट्रोफोटोमीटर की सेटिंग्स आरएनए के लिए सेट कर रहे हैं सुनिश्चित करें.</li>
	<li>मशीन को प्रारंभ करने और एक आधार रेखा निर्धारित करने के लिए आणविक ग्रेड पानी के 1-2 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करें।</li>
	<li>आरएनए मात्रा का आकलन करने के लिए प्रत्येक परीक्षण आरएनए नमूने के 1-2 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करें।</li>
	<li>रीडिंग और दस्तावेज़ सहेजें.</li>
	<li>यदि आवश्यक हो, तो आरएनए को 1 डिग्री/ नोट: आरएनए बर्फ पर रखा जाना चाहिए (या एक शांत ब्लॉक में) हर समय. यदि आरएनए एक स्तंभ, या मनका आधारित विधि का उपयोग कर प्राप्त किया जाता है आरएनए आमतौर पर कम से कम 1 g/ इस स्थिति में आरएनए साफ का उपयोग करें.</li>
</ol>2. अंतिम बिंदु संवेदनशीलता निर्धारित करने के लिए आरएनए फैलाव श्रृंखला की तैयारी
<ol><li>
आरएनए के एक 10 गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने बनाओ.
	<ol>
<li>तनुता श्रृंखला के साथ लेबल ट्यूब (उदा., 10-1, 10-2, आदि) और आरएनए विवरण.</li>
		<li>प्रत्येक ट्यूब के लिए आणविक ग्रेड पानी के 45 डिग्री एल जोड़ें.</li>
		<li>आरएनए के 5 डिग्री एल जोड़ें (पहले 1 डिग्री/</li>
		<li>उपयुक्त कीटाणुनाशक में पिपेट टिप का निपटान करें और एक ताजा टिप के साथ बदलें।</li>
		<li>10-1 से 5 डिग्री सेल्सियस लें और 10-2 ट्यूब में जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं।</li>
		<li>शेष कमजोर पड़ने के साथ 2.1.3-2.1.5 दोहराएँ. नोट: आरएनए बर्फ पर रखा जाना चाहिए (या एक शांत ब्लॉक में) हर समय.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. वास्तविक समय आरटी पीसीआर प्रतिक्रियाओं की तैयारी
<ol><li>एक स्प्रेडशीट का उपयोग करना, परीक्षण के नमूने और नियंत्रण के नमूने की संख्या के अनुसार प्लेट लेआउट की योजना, दोनों lyssavirus और जेड-actin assays के लिए. नोट: यदि 4 नमूने एक सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के साथ डुप्लिकेट में परीक्षण किया जा करने के लिए कर रहे हैं, यह दोनों assays के लिए 10 प्रतिक्रियाओं के बराबर है.</li>
	<li>आरएनए टेम्पलेट से अलग 'क्लीन रूम' या क्षेत्र में, पीसीआर कार्यकेंद्र (यदि उपयोग करते हुए) का उपयोग करने या तैयार करने से पहले एक उपयुक्त कीटाणुनाशक के साथ सतहों को साफ करें। कार्य केंद्र तैयार करने के लिए, एक उचित कीटाणुरहित के साथ कैबिनेट सतह पोंछें और कार्य केंद्र में आवश्यक वस्तुओं को रखें और दरवाजे बंद करें। 10 मिनट के लिए यूवी प्रकाश पर स्विच</li>
	<li>फ्रीजर और thaw से रीजेंट्स और प्राइमर निकालें (तालिका 1 में सूचीबद्ध अभिकर्ता और तालिका 2में प्राइमर )। नोट: एंजाइम मिश्रण ग्लिसरोल में संग्रहीत किया जाता है तो thawing की आवश्यकता नहीं है और बर्फ पर रखा जाना चाहिए (या एक शांत ब्लॉक में) हर समय. अन्य सभी अभिकर्मकों कमरे के तापमान पर thawed किया जा सकता है.</li>
	<li>एक बार thawed, अभिकर्मकों और अपकेंद्रित्र संक्षेप में मिश्रण करने के लिए तरल इकट्ठा. नोट: एंजाइम मिश्रण भंवर मत करो, बस अपकेंद्रण संक्षेप में.</li>
	<li>lyssavirus और जेड-actin के लिए अलग मास्टर घोला जा सकता है तैयार करें। प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए, आणविक ग्रेड पानी के 7.55 डिग्री सेल्सियस, 2x यूनिवर्सल SYBR हरी प्रतिक्रिया मिश्रण के 10 डिग्री एल, आगे प्राइमर के 0.6 $L, रिवर्स प्राइमर के 0.6 $L, iTaQ आरटी एंजाइम मिश्रण के 0.25 डिग्री एल जोड़ें।
	<ol>
<li>मैन्युअल परिकलन में त्रुटियों से बचने के लिए सही वॉल्यूम की गणना करने के लिए स्प्रेडशीट का उपयोग करें. सुनिश्चित करें कि पर्याप्त मास्टर मिश्रण pipeting त्रुटि के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए तैयार है. इसलिए यदि 10 अभिक्रियाओं की आवश्यकता है (नोट में देखें 3-1), तो 12 अभिक्रियाएँ तैयार करें</li>
		<li>बर्फ पर मास्टर मिश्रण तैयार (या एक शांत ब्लॉक में) और बर्फ पर रहते हैं जब तक वास्तविक समय मशीन में रखा.</li>
	</ol></li>
	<li>तैयार मास्टर-मिक्स मिक्स करें, अपकेंद्रण संक्षिप्त रूप से और पट्टी ट्यूबों के प्रासंगिक कुओं या उपयोग में वास्तविक समय मशीन के साथ संगत एक 96 अच्छी तरह से थाली में 19 डिग्री सेल्सियस वितरित करें। नोट: पाइपिंग के दौरान कुओं में बुलबुले के उत्पादन को कम करें।</li>
	<li>एक अलग कमरे में, या एक यूवी कैबिनेट में के रूप में 3.2 में वर्णित तैयार, ध्यान से जोड़ने 1 $L आरएनए के पहले से समायोजित करने के लिए समायोजित 1 g/$L (चरण 1.5 देखें) उचित मास्टर मिश्रण की सतह के नीचे अच्छी तरह से और धीरे से मिश्रण. उपयोग (पृष्ठ के नीचे) के बाद सीधे कीटाणुनाशक में पिपेट टिप को छोड़ें।
	<ol>
<li>परीक्षण के नमूने के बाद नियंत्रण जोड़ें, सकारात्मक नियंत्रण के साथ अगले जोड़ा और कोई टेम्पलेट नियंत्रण (NTC - आणविक ग्रेड पानी) पिछले जोड़ा. आरएनए की मात्रा का इस्तेमाल किया नमूना प्रकार के आधार पर बदला जा सकता है, और आरएनए निष्कर्षण इस्तेमाल किया. उपयोग की गई राशि को यह सुनिश्चित करने के लिए मान्य किया जाना चाहिए कि प्रतिक्रिया ऑप्टिमाइज़ की गई है।</li>
	</ol></li>
	<li>सभी ढक्कन ों को मजबूती से बंद कर दिया गया है और नमूनों को उन्मुख करने के लिए पर्याप्त लेबल सुनिश्चित करने के लिए पट्टी ढक्कन या सीलर का उपयोग करके सील प्लेट। प्लेट/पट्टी ट्यूबों के किनारे को लेबल करें।</li>
	<li>कुओं के तल पर सभी तरल इकट्ठा करने के लिए एक अपकेंद्रित्र का उपयोग कर के नमूने नीचे स्पिन।</li>
	<li>वास्तविक समय पीसीआर मशीन के लिए स्थानांतरण प्लेट, प्लेट लेआउट के अनुसार नमूनों की सही स्थान / नोट: यदि ट्यूब स्ट्रिप्स का उपयोग किया जाता है, सुनिश्चित करें कि धारक जगह में है.</li>
	<li>वास्तविक समय पीसीआर मशीन प्रोग्राम को खोलें और वियोजन वक्र के साथ SYBR वास्तविक समय प्रयोग के लिए विकल्प का चयन करें। डेटा संग्रह बिंदुओं सहित तालिका 3में निर्दिष्ट थर्मल साइकिल चालन शर्तों का उपयोग कर वास्तविक समय पीसीआर मशीन कार्यक्रम।</li>
	<li>फ्लोरोसेंट डाई के रूप में SYBR का चयन करें और नमूना प्रकार के रूप में अज्ञात का चयन करें और सही नमूना नाम बॉक्स में एक नाम डालें। नोट: प्रतिकृति के बीच और भी lyssavirus और जेड-actin कुओं के बीच अंतर.</li>
	<li>प्रयोगात्मक डेटा को सहेजने के लिए कोई फ़ाइल स्थान चुनें, सुनिश्चित करें कि लैंप रन के अंत में बंद हो जाएगा, फिर रन प्रारंभ करें. नोट: के रूप में पहला कदम एक RT चरण है, कोई डेटा इस समय के दौरान एकत्र किया जाता है, इसलिए, यदि दीपक एक गर्म अप अवधि की आवश्यकता होती है यह RT चरण के दौरान हो सकता है. वास्तविक समय मशीन और सॉफ्टवेयर, वास्तविक समय में प्रवर्धन घटता प्रदर्शित करेगा, जबकि पिघलने वक्र चक्र के अंत में उत्पन्न किया जाएगा.</li>
</ol>4. डेटा विश्लेषण
<ol><li>
रन पूरा हो जाने के बाद डेटा विश्लेषण निम्नानुसार करें।
	<ol>
<li>पहले नियंत्रण नमूनों के साथ परीक्षण के नमूने के प्रवर्धन साजिश परिणामों का विश्लेषण. सकारात्मक नमूने घातीय रैंप प्रदर्शित करते हैं, आमतौर पर पठार और एक सीटी मूल्य के बाद। ऋणात्मक नमूने फ्लैट प्रवर्धन भूखंडों को प्रदर्शित करते हैं जिनके साथ कोई सीत मान नहीं होते हैं (चित्र 1क) । सीटी मान स्वचालित रूप से सॉफ्टवेयर द्वारा गणना की है, हालांकि यह जाँच की जानी चाहिए और मैन्युअल रूप से बदल यदि आवश्यक हो.</li>
		<li>दूसरा, नियंत्रण नमूनों के साथ परीक्षण के नमूने के वियोजन वक्र परिणामों का विश्लेषण. एक धनात्मक नमूने का गलन का ताप (टच) 77 - 80 डिग्री सेल्सियस होगा तथा धनात्मक नियंत्रण चित्र 1खके साथ अतिव्यापन होगा।</li>
		<li>नियंत्रण मान्य हैं यह सुनिश्चित करके समग्र नैदानिक परिणाम प्राप्त करें। आंतरिक-अभिक्रिया नियंत्रण के संबंध में परिणामों की व्याख्या करने के लिए सारणी 4 का उपयोग की जाए। यदि सकारात्मक नियंत्रण नमूने नकारात्मक हैं और/या नकारात्मक नमूने सकारात्मक हैं, तो रन की उपेक्षा की जानी चाहिए।</li>
		<li>प्रवृत्ति विश्लेषण को सक्षम करने और परख संवेदनशीलता में drifts की पहचान करने में मदद करने के लिए एक 'नियंत्रण कार्ड' में नियंत्रण आरएनए के लिए प्राप्त सीटी और टीएम मूल्यों को रिकॉर्ड करें।</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OIE.">OIE.</a> OIE Terrestrial Manual 2018. , 8-14 (2018).</li><li>Panning, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+rabies+virus+reverse+transcription-PCR+and+virus+isolation+using+samples+from+a+patient+infected+with+rabies+virus.">Comparative analysis of rabies virus reverse transcription-PCR and virus isolation using samples from a patient infected with rabies virus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2960-2962 (2010).</li><li>Wakeley, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+real-time,+TaqMan+reverse+transcription-PCR+assay+for+detection+and+differentiation+of+lyssavirus+genotypes+1,+5,+and+6.">Development of a real-time, TaqMan reverse transcription-PCR assay for detection and differentiation of lyssavirus genotypes 1, 5, and 6.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (6), 2786-2792 (2005).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SYBR-green+I+quantitative+real-time+reverse+transcription-PCR+assay+for+rabies+viruses+with+different+virulence.">A SYBR-green I quantitative real-time reverse transcription-PCR assay for rabies viruses with different virulence.</a> Virologica Sinica. 29 (2), 131-132 (2014).</li><li>Wadhwa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Pan-Lyssavirus+Taqman+Real-Time+RT-PCR+Assay+for+the+Detection+of+Highly+Variable+Rabies+virus+and+Other+Lyssaviruses.">A Pan-Lyssavirus Taqman Real-Time RT-PCR Assay for the Detection of Highly Variable Rabies virus and Other Lyssaviruses.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 11 (1), e0005258 (2017).</li><li>Nadin-Davis, S. A., Sheen, M., Wandeler, A. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+relationships+among+rhabdoviruses+from+vertebrates+and+hematophagous+arthropods.">Antigenic relationships among rhabdoviruses from vertebrates and hematophagous arthropods.</a> Intervirology. 30 (5), 241-257 (1989).</li><li>Aznar-Lopez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+rhabdovirus+viral+RNA+in+oropharyngeal+swabs+and+ectoparasites+of+Spanish+bats.">Detection of rhabdovirus viral RNA in oropharyngeal swabs and ectoparasites of Spanish bats.</a> Journal of General Virology. 94 (1), 69-75 (2013).</li></ol>

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

पैन-lysavirus वास्तविक समय आरटी-पीसीआर परख वर्णित एक बंद ट्यूब, एक कदम परख जो सभी तीन phylogroups भर में lysaviruses का पता लगाता है. परख दोनों पशु और मानव रेबीज निदान के लिए मान्य किया गया है, पोस्टमार्टम मस्तिष्क ऊतक सहित (ऑप्टिमली brainstem), और इस तरह की त्वचा बायोप्सी के रूप में पूर्व-मर्तबा नमूने, क्रमिक रूप से एकत्र लार, या मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी तरल पदार्थ (सीएसएफ). इस परख में उपयोग किए गए प्राइमर को पहले आरएबीवी, ईबीएलवी-1 और ईबीएलवी-23के बीच अंतर करने के लिए जांच-आधारित परख के लिए डिजाइन और उपयोग किया गया था, जिसका उपयोग कई ओआईई रेबीज प्रयोगशालाओं में किया गया है और EURL प्रवीणता योजनाओं में लगातार प्रदर्शन करता है। बाद में इन प्राइमर के 'पैन-lysavirus' प्रकृति एक 2 कदम वास्तविक समय परख15का उपयोग कर की पुष्टि की गई है. यहाँ वर्णित परख आगे एक बंद ट्यूब, तेजी से प्रणाली को सक्षम करने के लिए एक एक कदम SYBR परख में आरटी-पीसीआर अनुकूलन करने के लिए प्राइमर का उपयोग किया गया है। इसके अलावा, रेबीज स्थानिकमारी वाले देशों में प्रशिक्षण इस परख का उपयोग कर पार संदूषण को कम करने और नमूने का पता लगाने के लिए बुनियादी PPE और गुणवत्ता प्रणालियों के साथ किसी भी प्रयोगशाला में लागू करने के लिए उपयुक्तता की पुष्टि की है, अभिकर्मकों और एक वास्तविक समय स्टोर करने के लिए सुविधाओं SYBR का पता लगाने के साथ मशीन. परख अत्यंत मजबूत है और वसा के साथ 100% संबंध है, विघटित नमूनों के लिए बेहतर संवेदनशीलता के साथ3. एक डीएनए intercalating डाई आधारित परख के लिए मुख्य लाभ में से एक एक जांच आधारित परख की तुलना में रिश्तेदार लागत है. एक अतिरिक्त लाभ यह है कि परख केवल दो प्राइमर का इस्तेमाल करता है, इसलिए अनुक्रम विचलन के कारण असफल पता लगाने का कम जोखिम होता है, जो पहले प्रकाशित जांच-आधारित परख में कमजोरी रही है। वास्तव में, सभी lysavirus प्रजातियों के प्रतिनिधियों (TWBLV और KBLV के अलावा) इस परख का उपयोग कर पता चला रहे हैं, और प्राइमर साइटों भर में TWBLV और KBLV के अनुक्रम विश्लेषण कोई महत्वपूर्ण विचलन दृढ़ता से सुझाव है कि वे भी सुझाव है कि वे भी का उपयोग कर का पता लगाया जाएगा पता चला है इस विधि. विश्लेषण वायरस भर में मनाया पता लगाने की सीमा की सीमा, दो मुख्य कारकों के कारण माना जा सकता है. पहला यह है कि आरएनए नैदानिक मस्तिष्क सामग्री से अलग किया गया था, इसलिए प्रत्येक undiluted नमूने में जीनोम प्रतियां की मात्रा सीधे तुलनीय नहीं है. आरएनए को कुल आरएनए को 1 ग्राम/जेडएल में समायोजित करके सामान्यीकृत किया गया था; हालांकि, उस नमूने के भीतर वायरल जीनोम आरएनए का अनुपात अलग-अलग होगा। दूसरा है lysavirus दृश्यों की विविधता, प्राइमर साइटों संरक्षित क्षेत्रों में स्थित होने के बावजूद, वहाँ भिन्नता की स्थिति बनी हुई है. इसलिए, यह आश्चर्य की बात नहीं है कि परख के लिए कम संवेदनशीलता के साथ lyssaviruses के बहुमत phylgroup द्वितीय और तृतीय वायरस हैं. वियोजन वक्र विश्लेषण एक आवश्यक पैरामीटर का प्रतिनिधित्व करता है, एक झूठी सकारात्मक परिणाम है जो अन्यथा प्राइमर dimers के गठन के कारण हो सकता है, या मेजबान जीनोम में एक गैर विशिष्ट क्षेत्र के प्रवर्धन को कम. वास्तव में, यह एक दुर्लभ घटना है और वियोजन वक्र विश्लेषण सही ढंग से आकार पारंपरिक आरटी-पीसीआर amplicons कल्पना करने के लिए एक agarose जेल चलाने के लिए बराबर है। हमारी प्रयोगशाला में एकत्रित आंकड़ों के आधार पर स्वीकार्य टीएम मूल्यों की श्रेणी (77-80 डिग्री सेल्सियस) प्रदान की गई है। यह दृढ़ता से सिफारिश की है कि अलग-अलग प्रयोगशालाओं में घर में डेटा collate सुनिश्चित करने के लिए सीमा transferrable है और तदनुसार संशोधन. प्रवर्धन और वियोजन दोनों भूखंडों से परिणामों की व्याख्या, सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण और जेड-एक्टिन परिणामों के साथ, मजबूत और पुन: उत्पादनीय नैदानिक परिणामों को सक्षम बनाता है।
इस प्रोटोकॉल के दायरे के बाहर उच्च गुणवत्ता आरएनए प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता आरएनए निष्कर्षण विधि है। सभी आरएनए इस प्रोटोकॉल में विश्लेषण TRIzol का उपयोग कर तैयार किया गया था; हालांकि, कॉलम और मनका-आधारित निष्कर्षण किट सहित कई उपयुक्त ग्वानिडियम-आधारित निष्कर्षण आरएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल उपलब्ध हैं। lyssavirus सकारात्मक (या संदिग्ध सकारात्मक) नमूनों की हैंडलिंग लाइसेंस प्राप्त biocontainment सुविधाओं के भीतर देश के भीतर मंजूरी दे दी होनी चाहिए. हालांकि, निकाले गए कुल आरएनए गैर संक्रामक है, इसलिए कम रोकथाम प्रयोगशालाओं के भीतर संभाला. उपयोग की जाने वाली निष्कर्षण विधि के आधार पर आरएनए की मात्रा निर्धारित करने और उसे कम करने की आवश्यकता का मूल्यांकन करने की आवश्यकता होगी। फीनॉल-आधारित निष्कर्षणों के लिए, TRIzol सहित, इस कदम की आवश्यकता है और gDNA contaminating से परख के निषेध को रोकता है; हालांकि, स्तंभ और मनका आधारित extractions (विशेष रूप से एक डीएनए कमी चरण के साथ उन) परीक्षण से पहले कमजोर पड़ने की आवश्यकता नहीं है.
प्रोटोकॉल के दौरान, यह आवश्यक है कि देखभाल और परिश्रम को पार संदूषण और सही कुओं के लिए नमूने का सही इसके अलावा को रोकने के लिए उपयोग किया जाता है. अभिकर्मक गणना और प्लेट लेआउट के साथ एक स्प्रेडशीट एक पूरक फ़ाइल के रूप में डाउनलोड के लिए उपलब्ध है. अच्छा प्रयोगशाला अभ्यास, स्वच्छ काम सतहों सहित, दस्ताने के नियमित परिवर्तन, बाधा युक्तियाँ और विभिन्न कमरों / यह सुनिश्चित करने के लिए परीक्षण अपेक्षित पैरामीटर के साथ प्रदर्शन कर रहा है, सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण शामिल किया जाना चाहिए और सभी परीक्षण नमूने डुप्लिकेट (या trilicate) में चलाते हैं।
नियंत्रण का समावेश किसी भी पीसीआर की एक अनिवार्य विशेषता है, विशेष रूप से निदान के लिए। सकारात्मक नियंत्रण आरएनए CVS (चुनौती वायरस मानक) बैचों में संक्रमित माउस दिमाग से तैयार किया गया था और मान्य और बैचों के बीच स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए calibrated. नियंत्रण आरएनए को परिमाणित किया गया था और उसे 1 ग्राम/जेडएल तक पतला किया गया था जिसके लिए एक क्रमिक कमजोर पड़ने में कम से कम 10-4 (100 pg/$L के बराबर) में एक सकारात्मक परिणाम प्राप्त किया गया था, उद्देश्य के लिए उपयुक्त माना गया था। सकारात्मक नियंत्रण आरएनए को 10-1 एलिकोट्स में -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था। जब आवश्यक हो, एक alicot पतला किया गया था 1:100 पर एक काम कर स्टॉक प्रदान करने के लिए 1 ng/$L और पर संग्रहीत -80 डिग्री सेल्सियस में 5 डिग्री एल एकल उपयोग alicuots. पतला सकारात्मक नियंत्रण आरएनए कम स्तर सकारात्मक नमूने का प्रतिनिधित्व करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और यह सुनिश्चित करने के लिए कि परख की संवेदनशीलता में किसी भी कमी का पता चला था. Ct मानों की निगरानी करने और प्रवृत्तियों की पहचान करने के लिए प्रत्येक नियंत्रण के लिए एक 'नियंत्रण कार्ड' रखा गया था (तालिका 5)। तालिका 5 कई दिनों और ऑपरेटरों भर में CVS सकारात्मक नियंत्रण नमूना सीटी और टीएम मूल्यों के लिए अच्छा अंतर रन तुलनीयता का प्रदर्शन किया, आश्वासन है कि परख मजबूत और reproduible है प्रदान करते हैं. परिणाम है कि इन माप से विचलित जांच की जानी चाहिए और यदि आवश्यक हो तो दोहराया नमूने परीक्षण. आणविक ग्रेड पानी एक NTC के रूप में हर रन में शामिल किया गया था पुष्टि करने के लिए अभिकर्मकों lysavirus आरएनए के साथ संदूषण से मुक्त थे और एक नकारात्मक नमूना की पुष्टि करें. इसके अलावा, आरएनए निष्कर्षण प्रभावकारिता सुनिश्चित करने के लिए, एक अलग ट्यूब में परीक्षण के नमूनों के साथ-साथ जेड-एक्टिन का परीक्षण किया गया था। lyssavirus सकारात्मक नियंत्रण आरएनए भी जेड-actin सकारात्मक नियंत्रण के लिए इस्तेमाल किया गया था. अन्य अंतर्जात जीन या विषमतापूर्ण आंतरिक नियंत्रण प्रणालियों का उपयोग किया जा सकता है। इन नियंत्रणों के उपयोग ने यह सुनिश्चित किया कि सभी चरणों का परीक्षण नमूनों के समान ही परिस्थितियों में विश्लेषण किया गया। कभी कभी, अगर नमूना अत्यधिक अपमानित किया गया था या पर्याप्त मेजबान आरएनए शामिल नहीं था (जैसे लार या सीएसएफ के रूप में), अंतर्जात जीन पीसीआर विफल कर सकते हैं. इस उदाहरण में, जहां lyssavirus वास्तविक समय आरटी-पीसीआर परिणाम सकारात्मक था, एक स्वतंत्र आरएनए निष्कर्षण पर पुष्टि - मूल परीक्षण पर या एक माध्यमिक परीक्षण द्वारा आरएनए निष्कर्षण के दौरान संदूषण से इनकार करने के लिए (या तो आणविक, जैसे पारंपरिक आरटी-पीसीआर) , या FAT. नैदानिक नमूने के विश्लेषण के दौरान तालिका 4 का उपयोग सही व्याख्या सुनिश्चित करता है।
रेबीज संक्रमण की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया आणविक परख के बावजूद, इस तरह के वसा या वायरस अलगाव के रूप में virology में lysavirus प्रजातियों और शास्त्रीय तकनीकों का निर्धारण करने के लिए Sanger अनुक्रमण का उपयोग कर जांच का पालन भी करने के लिए अनुमति देने के लिए किया जाना चाहिए आगे वायरस की विशेषता और OIE और डब्ल्यूएचओ के लिए सकारात्मक मामलों की अधिसूचना का समर्थन करते हैं.

आणविक पद्धतियों का उपयोग कर रेबीज का निदान 20181में OIE द्वारा स्वीकार किया गया था , रेबीज मामलों की पुष्टि में इन तकनीकों के लाभों को पहचानने, विशेष रूप से स्थितियों में जब नमूने उप इष्टतम हैं, या पूर्व-मर्चन निदान के लिए, के रूप में वहाँ लाइव वायरस या ताजा नमूने के लिए कोई आवश्यकता नहीं है. lyssaviruses के लिए पीसीआर assays एक रिवर्स प्रतिलेखन की आवश्यकता (आरटी) से पहले पीसीआर शुरू कर सकते हैं के रूप में जीनोम आरएनए है. आरटी-पीसीआर परख कि जीनोम के 3' समीपस्थ क्षेत्र का पता लगाने सबसे संवेदनशील माना जाता है, के रूप में ट्रांसक्रिप्शनल gradients lysavirus प्रतिकृति के दौरान होते हैं. आम तौर पर इस्तेमाल किया आरटी-पीसीआर assays मोटे तौर पर दो श्रेणियों में विभाजित किया जा सकता है, अंत बिंदु (या जेल आधारित) और वास्तविक समय. दोनों दृष्टिकोण संवेदनशील और विशिष्ट होते हैं; हालांकि, वास्तविक समय परख 'वास्तविक समय' में परिणाम प्राप्त करने और एक पूरी तरह से बंद ट्यूब प्रणाली में प्रदर्शन किया जा रहा है, जिससे ऑपरेटर संदूषण के लिए क्षमता को कम करने के रूप में कुछ अतिरिक्त लाभ है. वास्तविक समय परख का उपयोग कर प्राप्त lyssavirus-विशिष्ट amplicons का पता लगाने के लिए दो मुख्य दृष्टिकोण हैं. पहले hydrolysis जांच का इस्तेमाल करता है (जैसे TakMan जांच के रूप में) कि एक फ्लोरोफोर और एक कतार होते हैं. जब जांच प्रवर्धन के दौरान लक्ष्य क्षेत्र के लिए बांधता है, बहुलक के exonuclease गतिविधि fluorophore और क्वेन्चर के विघटन में परिणाम, जिसके परिणामस्वरूप फ्लोरोसेंट मापा जा करने के लिए सक्षम करने. दूसरा एक डीएनए intercalating डाई का इस्तेमाल करता है (इस तरह के SYBR ग्रीन के रूप में fluorochrome) कि प्रवर्धन के दौरान फंसे डीएनए डबल करने के लिए बांध. बाध्य फ्लोरोक्रोम्स फ्लोरोक्रोम्स का उत्सर्जन करते हैं जो प्रत्येक चक्र में पाया जाता है, जिससे उत्पाद का वास्तविक समय का पता लगाने और परिमाणीकरण की अनुमति मिल जाती है। किसी भी dsDNA के लिए बाध्यकारी की गैर-विशिष्ट प्रकृति के कारण, प्रतिक्रिया की विशिष्टता की पुष्टि करने के लिए एक वियोजन वक्र विश्लेषण किया जाता है। वास्तविक समय आरटी-पीसीआर छोटे amplicon आकार के कारण तेजी से कर रहे हैं, आम तौर पर लंबाई में कम से कम 200 बीपी; हालांकि, संरक्षित क्षेत्रों में प्राइमर और जांच डिजाइन करने के लिए उपयुक्त क्षेत्रों की पहचान करना चुनौतीपूर्ण साबित हो सकता है, इसलिए जांच की आवश्यकता को दूर करना एक विशिष्ट लाभ है।
वास्तविक समय आरटी-पीसीआर की एक संख्या विशेष रूप से व्यक्तिगत उपभेदों या RABV2 के वंश का पता लगाने के लिए और भी जीनस3,4,5,6भर में lysaviruses का पता लगाने के लिए डिजाइन किया गया है, 7,8,9. सभी परख कैसे प्राइमर संरक्षित पर निर्भर का पता लगाने की एक सीमा होगी (और यदि आवश्यक हो, जांच) दृश्यों जीनस भर में हैं. वास्तव में, उभरते या उपन्यास वायरस उपभेदों अत्यधिक विशिष्ट जांच आधारित परख अप्रभावी प्रदान कर सकते हैं. वास्तविक समय का पता लगाने (डीई बनाम जांच) की पसंद का इरादा आवेदन पर निर्भर करेगा. स्थानीय रूप से sourced मस्तिष्क सामग्री पर निगरानी का आयोजन एक प्रयोगशाला के लिए और नकारात्मक नमूनों की उच्च संख्या की उम्मीद, सस्ता intercalating डाई का उपयोग एक समझदार विकल्प है. SYBR ग्रीन दृष्टिकोण भी इष्टतम होगा जब स्कैनिंग निगरानी का आयोजन जहां उपन्यास या भिन्न lysaviruses की उपस्थिति अधिक प्रतिबंधित जांच आधारित परख द्वारा पता नहीं चल रहेगा.
जीनस लिसावायरस के सभी सदस्य रोग रेबीज का कारण बनते हैं, जो लक्षण दिखाई देने के बाद घातक होता है। मानव और पशु रेबीज के अधिकांश मामले रेबीज वायरस (आरएबीवी) के कारण होते हैं, जिसके लिए प्रमुख जलाशय घरेलू कुत्ता10है . चमगादड़ lyssaviruses के लिए महत्वपूर्ण मेजबान जलाशय हैं और सभी लेकिन दो lyssavirus प्रजातियों विशेषता चमगादड़ में सीधे पहचान की गई है - Ikoma lyssavirus (IKOV) और मोकोला वायरस (MOKV) - और इन दोनों में से, IKOV एक बल्ले मेजबान जलाशय है अनुमान लगाया गया है 11. 16 मान्यता प्राप्त lyssavirus प्रजातियों12के अलावा , वहाँ दो lyssaviruses है कि हाल ही में वर्णित किया गया है: ताइवान बैट lysavirus (TWBLV)13 और Kotalahti बल्ले lysavirus (KBLV)14. Lyssaviruses आनुवंशिक रूप से तीन phylgroups में विभाजित किया जा सकता है, lysaviruses के बहुमत के साथ, RABV सहित, phylogroup I से संबंधित. हालांकि, सबसे अलग lyssaviruses phylogroup III के हैं और RABV या phylogroup मैं वायरस दृश्यों को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन आरटी पीसीआर द्वारा पता लगाया जा करने की संभावना नहीं है।
यहाँ वर्णित परख वास्तविक समय प्राइमर जोड़ी JW12-N165, पहली बार 20053में वर्णित का इस्तेमाल करता है. प्राइमर को पैन-lysavirus होने के लिए डिजाइन किया गया था, हालांकि मूल आवेदन lysavirus प्रजातियों में अंतर करने के लिए जांच के साथ एक TakMan परख के रूप में किया गया था। बाद में पुष्टि है कि प्राइमर जोड़ी विशिष्टता में पैन-lysavirus था WCBV15सहित उपलब्ध सभी lyssavirus प्रजातियों पर एक 2 कदम SYBR वास्तविक समय परख का उपयोग प्राप्त किया गया था. प्राइमर जोड़ी यहाँ एक एक कदम आरटी-पीसीआर वास्तविक समय परख एक intercalating फ्लोरोक्रोम का उपयोग में वर्णित है, सभी 16 मान्यता प्राप्त lyssavirus प्रजातियों से प्रतिनिधियों का उपयोग मान्य. यह एक कदम वास्तविक समय परख एक तेजी से, संवेदनशील, lysavirus विशेष परख है और दर्शाता है कि प्राइमर की मजबूती भी अत्यधिक भिन्न lysavirus प्रजातियों की पहचान करने के लिए सेट.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Art Barrier pipette tips (various sizes)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Allegra 21R</td>
			<td>Rotor capable of holding 96 well plates required. Step 3.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (mico)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipettes (to dispense 0.5-1000 &#181;L)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green One-Step RT-PCR kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5150</td>
			<td>Equivalent kits can be used if validated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MX3000P or MX3005P real-tme PCR system</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Eqivalent machines can be used if validated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp reaction plate base</td>
			<td>Any suitable</td>
			<td></td>
			<td>Used to hold tube strip and plates securely.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optically clear flat clear strips (8)</td>
			<td>ABgene</td>
			<td>AB-0866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfect fit frame (if using tube strips)</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Specific to machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers: for primer details see Table 2.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ordered at 0.05 &#181;mole scale HPLC purified.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo-Fast 96 well plares, non skirted</td>
			<td>ABgene</td>
			<td>AB-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo-Fast strips (8) Thermo-tubes</td>
			<td>ABgene</td>
			<td>AB-0452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex machine / Whirlimixer</td>
			<td>Fisons Scientific equipment</td>
			<td>SGP-202-010J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unless stated, alternative equipment can be used</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pan-lyssavirus real time rt-pcr for rabies diagnosis

आण्विक परख तेजी से कर रहे हैं, संवेदनशील और विशिष्ट, और रेबीज के निदान के लिए केंद्रीय बन गए हैं. पीसीआर आधारित परख का उपयोग रेबीज निदान की पुष्टि करने के लिए दशकों से किया गया है, लेकिन हाल ही में रेबीज संक्रमण का पता लगाने के लिए प्राथमिक विधि के रूप में ओआईई (विश्व संगठन फॉर एनिमल हेल्थ) द्वारा स्वीकार किया गया है। वास्तविक समय आरटी-पीसीआर परख वास्तविक समय डेटा प्रदान करते हैं, और बंद कर रहे हैं ट्यूब सिस्टम, सेटअप के दौरान संदूषण के जोखिम को कम से कम. डीएनए intercalating फ्लोरोक्रोम वास्तविक समय आरटी-पीसीआर परख महंगी जांच की आवश्यकता नहीं है, प्रति नमूना लागत को कम करने, और जब प्राइमर संरक्षित क्षेत्रों में डिजाइन किए हैं, assays कि वायरस वंश भर में विशिष्ट हैं बजाय सिर्फ एक वायरस के लिए विशिष्ट प्रजातियों संभव हैं. यहाँ हम एक पैन-lysavirus SYBR वास्तविक समय आरटी-पीसीआर परख है कि Lyssavirus जीनस भर में lyssaviruses का पता लगाता है का वर्णन, सबसे अलग वायरस IKOV, WCBV और LLEBV सहित. वियोजन वक्र विश्लेषण के साथ संयोजन के रूप में, इस परख संवेदनशील और विशिष्ट है, सभी lyssavirus प्रजातियों का पता लगाने के लाभ के साथ. परख गुणवत्ता आश्वासन वातावरण के साथ कई नैदानिक प्रयोगशालाओं में अपनाया गया है, मजबूत सक्षम, तेजी से, पशु और मानव रेबीज मामलों के संवेदनशील निदान.

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Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

रेबीज निदान के लिए पैन-लिसवायरस रियल टाइम आरटी-पीसीआर

यह वास्तविक समय आरटी-पीसीआर dsDNA intercalating डाई का उपयोग lyssavirus संक्रमण का निदान करने के लिए उपयुक्त है। विधि रेबीज संदिग्ध पूर्व-मर्चन या पोस्टमार्टम नमूनों से निकाले गए आरएनए के साथ शुरू होता है, मास्टर मिश्रण तैयारी, आरएनए इसके अलावा, वास्तविक समय मशीन की स्थापना और परिणामों की सही व्याख्या का विवरण।

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

यह वास्तविक समय आरटी-पीसीआर पूर्व-पोस्टमार्टम और पोस्टमार्टम नमूनों में रेबीज का तेजी से निदान करने के लिए उपयुक्त है। Lyssavirus जीनस के सभी सदस्यों की पहचान करने के लिए पैन-Lyssavirus प्राइमर को अनुकूलित किया गया है। यह एक तेजी से, संवेदनशील, और बंद ट्यूब परख है जो नैदानिक नमूनों से अत्यधिक भिन्न प्रजातियों सहित Lyssavirus जीनस भर से वायरस का पता लगाता है।ओआईई ने हाल ही में रेबीज संक्रमण की रिपोर्ट करने के लिए आणविक परख स्वीकार की है । यह विघटित नमूनों के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जो हमेशा वायरस संस्कृति या एंटीजन डिटेक्शन विधियों द्वारा निदान नहीं किया जा सकता है। इस परख की संवेदनशीलता के कारण, संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए विभिन्न चरणों को अलग करने सहित अच्छी प्रयोगशाला अभ्यास महत्वपूर्ण है।प्रक्रिया का प्रदर्शन डेज़ी जेनिंग्स, मेरी प्रयोगशाला से एक निदान होगा । एक माइक्रो वॉल्यूम स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ आरएनए की मात्रा निर्धारित करके शुरू करें। सुनिश्चित करें कि मशीन आरएनए के लिए सेट है और मशीन को सामान्य बनाने और एक आधार रेखा स्थापित करने के लिए आणविक ग्रेड पानी के एक से दो माइक्रोलीटर का उपयोग करें।आरएनए एकाग्रता को मापें और इसे एक माइक्रोग्राम प्रति माइक्रोलीटर में समायोजित करें। परीक्षण और नियंत्रण दोनों नमूनों को ध्यान में रखते हुए स्प्रेडशीट के साथ अपनी पीसीआर प्लेट के लेआउट की योजना बनाएं। सतहों को कीटाणुरहित करके पीसीआर वर्कस्टेशन तैयार करें और यदि यूवी कैबिनेट का उपयोग कर रहे हैं, तो शुरू करने से 10 मिनट पहले यूवी लाइट चालू करें।फ्रीजर से गल जाने के लिए रिएजेंट्स और प्राइमर निकालें लेकिन हर समय बर्फ पर एंजाइम मिक्स रखें । तरल इकट्ठा करने के लिए रिएजेंट्स और सेंट्रलाइज को संक्षेप में मिलाएं। पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार Lyssavirus और बीटा-Actin के लिए पीसीआर मास्टर घोला जा सकता है तैयार करें।उपयोग करने के लिए तैयार होने तक मास्टर को बर्फ पर छोड़ दें। मिक्स और अपकेंद्रित्र तैयार मास्टर घोला जा सकता है और पीसीआर मशीन संगत प्लेट या ट्यूब पट्टी के प्रासंगिक कुओं में 19 माइक्रोलीटर बांटना । एक अलग कमरे या यूवी कैबिनेट में, तैयार आरएनए का एक माइक्रोलीटर सावधानी से जोड़ें।यदि यूवी कैबिनेट का उपयोग कर रहे हैं, तो शुरू करने से 10 मिनट पहले यूवी लाइट चालू करें। परीक्षण नमूनों के बाद, सकारात्मक नियंत्रण और कोई टेम्पलेट नियंत्रण जोड़ें। मास्टर मिक्स करने के लिए आरएनए जोड़ते समय, सुनिश्चित करें कि यह सही अच्छी तरह से जोड़ा गया है।इस चरण की सहायता के लिए प्लेट योजना का उपयोग करें। प्लेट को सील करें कि ढक्कन प्लेट के पार फ्लैट हैं और कुओं के तल पर सभी तरल इकट्ठा करने के लिए इसे नीचे स्पिन करते हैं। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक कुएं में तरल की एक ही मात्रा है और कोई बुलबुले दिखाई नहीं दे रहे हैं।इसके बाद सैंपलों को पीसीआर मशीन में ट्रांसफर कर दें। वियोजन के साथ SYBR ग्रीन चुनने के कार्यक्रम खोलें। कुओं का चयन करने के लिए नमूना प्रकार और फ्लोरोसेंट डाई के रूप में SYBR के रूप में अज्ञात चुनने का विश्लेषण किया जाएगा ।प्लेट लेआउट पर कुओं को नमूना जानकारी के साथ लेबल करें जिसमें यह शामिल है कि क्या परख Lyssavirus एल या बीटा-ऐक्टिन के लिए है। थर्मो प्रोफाइल सेटअप पर क्लिक करें और पांडुलिपि में निर्दिष्ट थर्मल साइकिलिंग स्थितियों को संशोधित करें। स्टार्ट पर क्लिक करें फिर फाइल को सेव करने के लिए एक स्थान चुनें और रन के अंत में लैंप को स्विच ऑफ करने के लिए बॉक्स की जांच करें।जब लैंप वार्मअप दिखाई देने से पहले शुरू करने का विकल्प हो, तो अब चलाने पर क्लिक करें लेकिन यह सुनिश्चित करें कि दीपक के पास गर्म होने के लिए 15 मिनट से कम समय है। जब पीसीआर रन पूरा हो गया हो तो डाटा एनालिसिस के साथ आगे बढ़ें। सबसे पहले, Lyssavirus प्रवर्धन भूखंडों का विश्लेषण करें।सकारात्मक नमूने घातीय रैंप प्रदर्शित करते हैं जबकि नकारात्मक नमूनों में कोई सीटी मूल्यों के साथ फ्लैट प्रवर्धन भूखंड होते हैं। इसके बाद, नियंत्रण नमूनों के साथ परीक्षण नमूनों के Lyssavirus वियोजन वक्र परिणामों का विश्लेषण करें। एक Lyssavirus सकारात्मक नमूने ७७ और ८० डिग्री सेल्सियस के बीच एक पिघलने का तापमान होगा और सकारात्मक नियंत्रण के साथ ओवरलैप ।इसके बाद, समग्र परिणाम की व्याख्या करने के लिए नियंत्रणों के साथ तुलना करते हुए बीटा-ऐक्टिन प्रवर्धन भूखंडों और वियोजन घटता का विश्लेषण करें। टेक्स्ट रिपोर्ट देखें और एक नियंत्रण कार्ड में नियंत्रण आरएनए के लिए प्राप्त सीटी और टीएम मूल्यों को रिकॉर्ड करने के लिए विवरण का उपयोग करें ताकि यह पुष्टि की जा सके कि रन सफल रहा और परीक्षण नमूने के परिणामों की रिपोर्ट की जा सकती है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग नियंत्रण मानक वायरस की आरएनए कमजोर पड़ने श्रृंखला पर पैन-Lyssavirus आरटी-पीसीआर की संवेदनशीलता को प्रदर्शित करने के लिए किया जाता है।प्रवर्धन वक्र इंगित करता है कि Lyssavirus के 10 पिकोग्राम का पता लगाया जा सकता है और वियोजन घटता उत्पाद के पिघलने के तापमान को सत्यापित करता है। पिघलने वाले तापमान का उपयोग इस बात की पुष्टि करने के लिए किया जाता है कि एम्प्लिकॉन लिसावायरस विशिष्ट है। यहां परिणाम ७७.३४ से ७९.६७ डिग्री सेल्सियस के Lyssavirus जीनस भर में एक पिघलने तापमान रेंज का प्रदर्शन ।76.8 या 80.2 से ऊपर के पिघलने वाले तापमान मूल्यों को गैर-विशिष्ट माना जाता है। इस आरटी-पीसीआर परख की संवेदनशीलता भी तीन Lyssavirus पॉजिटिव ब्रेन सैंपल से आरएनए का पता लगाकर तय होती है । लक्ष्य आरएनए के माइक्रोलीटर प्रति 0.1 पिकोग्राम तीन नमूनों में से दो के लिए पता लगाया जा सकता है।विशेष रूप से, इस परख का उपयोग करके सभी मान्यता प्राप्त Lyssavirus प्रजातियों के प्रतिनिधियों का पता लगाया जाता है। यदि लार या सीएसएफ जैसे नैदानिक नमूनों से आरएनए अर्क का विश्लेषण करते हैं, तो मेजबान न्यूक्लिक एसिड की कमी के कारण बीटा-ऐक्टिन परिणाम नकारात्मक हो सकते हैं। एक बहिर्जात नियंत्रण के अलावा इस समस्या को हल कर सकते हैं।रेबीज संक्रमण के भौगोलिक और मेजबान मूल के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान करने के लिए Lyssavirus सकारात्मक नमूनों के अनुक्रमण की सिफारिश की जाती है। Lyssavirus सकारात्मक या संदिग्ध सकारात्मक नमूनों की हैंडलिंग स्थानीय स्वास्थ्य और सुरक्षा दिशा निर्देशों के अनुसार होना चाहिए । निकाले गए आरएनए गैर संक्रामक है, इसलिए कम रोकथाम प्रयोगशालाओं के भीतर संभाला जा सकता है ।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia में microRNAs की सामान्य सीएनएस में वास्तविक समय पीसीआर द्वारा और Neuroinflammation दौरान जांच

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

टी सेल की वास्तविक समय लाइव इमेजिंग परिसर गठन संकेतन

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

उच्च throughput मात्रात्मक वास्तविक समय आरटी पीसीआर परख प्रकार मैं और तृतीय इंटरफेरॉन उपप्रकार की अभिव्यक्ति प्रोफाइल निर्धारण के लिए

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

मल सामग्री में CWD Prions का पता लगाने के लिए वास्तविक समय तड़पनेवाला-प्रेरित रूपांतरण परख

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...

A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells

चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर टी कोशिकाओं के लिए एक वास्तविक समय शक्ति परख ठोस और हेमेटोलॉजिकल कैंसर कोशिकाओं को लक्षित

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy for cancer has achieved significant clinical benefit for resistant and refractory hematological ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

रेबीज वैक्सीन शक्ति का मूल्यांकन करने के लिए विट्रो एलिसा टेस्ट में

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

फॉर्मेलिन-फिक्स्ड ऊतकों से Lyssavirus एंटीजन डिटेक्शन के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री टेस्ट

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

रियल-टाइम सेल विश्लेषण का उपयोग करके मेजबान के बाहर इन्फ्लूएंजा वायरस उत्तरजीविता की निगरानी

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

एक स्यूडोमोनास एरुगिनोसा संक्रमण मॉडल के वास्तविक समय के आकलन के लिए उपकरण

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a ...