Name: sirna electroporation to modulate autophagy in herpes simplex virus type 1-infected monocyte-derived dendritic cells
Uploaded: 2019-10-28T13:00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par le Conseil allemand de la recherche (DFG) par le biais du projet STE 432/11-1 attribué à AS et par le programme ELAN de la Faculté de Médecine (Friedrich-Alexander-Universitàt Erlangen-Nunberg) via le projet 18-12-21-1, accordé à LG.

Des DC séduisants par monocyte ont été produits à partir de produits de leuphène de donneurs sains. Pour cela, un vote positif du comité d'éthique local a été obtenu (numéro de référence 4556). Les expériences de la présente étude ont été réalisées conformément aux recommandations du comité d'éthique du "Friedrich-Alexander-Universitàt Erlangen-N'rnberg" (numéro de référence 4556). Tous les donateurs ont approuvé un consentement écrit éclairé, y compris conformément à la Déclaration d'Helsinki.
1. Génération et manipulation de cellules dendritiques immatures (iDC) et de cellules dendritiques matures (MDC)
<ol><li>Isoler les cellules mononucléaires périphériques humaines de sang (PBMCs) des chambres de système de leukoreduction (LRSCs) comme précédemment décrit27. Évitez la cryoconservation des PBMC et utilisez-les directement lors de l'isolement pour obtenir des rendements DC plus élevés.</li>
	<li>Générer des DC humains à partir de PBMCs de différents donneurs sains dans T175 flacons de culture cellulaire comme précédemment décrit10,27. En bref, utiliser 350-400 millions de PBMc dans 30 mL de dC moyen (RPMI 1640 sans L-glutamine, 1% (v/v) AB-sérum, 100 U/mL pénicilline, 100 mg/mL de streptomycine, 0,4 mM L-glutamine, 10 mM HEPES) par flacon de culture cellulaire pour l'isolement des monocytes par adhésion. Après 1 h, laver la fraction non adhérente à l'aide de RPMI 1640. Ajouter le milieu DC frais complété avec 800 U/mL GM-CSF et 250 U/mL IL-4, et couver pendant 3 jours.<ol>
<li>Le jour 3 après l'adhérence, ajouter 5 mL de milieu DC frais contenant GM-CSF et IL-4 avec une concentration finale de 400 U/mL et 250 U/mL par flacon de culture cellulaire, respectivement, pour la différenciation DC.</li>
		<li>Pour récolter les iDC, rincez doucement les iDC lâchement adhérents du bas de la fiole de culture cellulaire, le jour 4 après l'adhésion. Répétez cette étape 2 fois. Pour la génération de mDC, ajoutez le cocktail de maturation composé comme suit : GM-CSF (concentration finale : 40 U/mL), IL-4 (concentration finale : 250 U/mL), IL-6 (concentration finale : 1000 U/mL), IL-1 (concentration finale : 200 U/mL), TNF-MD (concentration finale : 10 ng/ mL), prostaglandine E2 (PGE2; concentration finale : 1 g/mL).</li>
		<li>Six jours après l'adhérence (deux jours après l'induction de la maturation à l'aide d'un cocktail de cytokine), rincer les MDC du fond de la culture cellulaire flasque. Répétez cette étape deux fois. REMARQUE : Les DC immatures et matures peuvent être générés séquentiellement à partir de donneurs identiques dans 1 flacon de culture cellulaire. Pour ce faire, (i) séparer le nombre approprié d'iDC et (ii) induire la maturation des cellules restantes dans les flacons à l'aide du cocktail cytokine énuméré à l'étape 1.2.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transférer les iDC ou les MDC dans le milieu de culture cellulaire respectif dans des tubes de 50 ml. Récoltez les cellules par centrifugation à 300 x g pendant 5 min.<ol>
<li>Resuspendre doucement les DC dans 5-10 ml de RPMI 1640 par flacon de culture cellulaire. Combinez les suspensions DC respectives dans un tube.</li>
		<li>Définissez le numéro de cellule à l'aide d'une chambre de comptage ou d'une méthode alternative. Évitez les altérations de température lors de la manipulation des iDC, afin de réduire le risque de changements phénotypiques.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Analyses cytométriques de flux pour surveiller l'état phénotypique de maturation
<ol><li>Transférer les iDC ou les mDC (0,5 x 106) de l'étape 1.3.1 dans un tube de 1,5 ml. Récoltez les cellules par centrifugation à 3390 x g pendant 1,5 min. Lavez les cellules une fois avec un tampon FACS (PBS complété par 2 % de sérum fœtal du veau (FCS)).</li>
	<li>Resuspendre les cellules dans 100 L de la solution de coloration des anticorps (tampon FACS) contenant des anticorps spécifiques étiquetés fluorochrome contre des molécules de surface définies.<ol>
<li>Utilisez les anticorps suivants pour vérifier la pureté (CD3-FITC, CD14-PE) ainsi que l'état de maturation des DC (CD80-PacBlue/-PE-Cy5, CD11c-PE-Cy5, CCR7-PE-Cy7, CD83-APC, CD86-PE, MHCII-APC-Cy7).</li>
		<li>Préparer un échantillon non taché dans 100 l de tampon FACS comme un contrôle.</li>
		<li>Tainer les cellules sur la glace dans l'obscurité pendant 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ensuite laver les cellules deux fois dans 1 ml de tampon FACS et centrifugeuse à 3390 x g pendant 1,5 min.</li>
	<li>Enfin, resuspendre les cellules dans 200 L de tampon FACS complété par 2% PFA et d'analyser les cellules par cytométrie de flux. Les cellules fixes peuvent être stockées à 4 oC dans l'obscurité jusqu'à 2 jours.</li>
</ol>3. Procédure d'infection des DC avec le virus simplex d'herpès type-1 (HSV-1) et interférence du flux autophagique HSV-1-induit par l'intermédiaire de spautin-1 ou de bafilomycine-A1
REMARQUE : La souche HSV-1/17MD/CMV-EGFP/UL43 (HSV-1 EGFP) utilisée dans cette étude a été obtenue à partir de la souche de laboratoire HSV-1 souche 17. La souche HSV-1 EGFP exprime la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) qui a été insérée dans le locus du gène UL43 sous le contrôle du promoteur CMV. L'EGFP sert de marqueur pour l'infection par le VHS-1. En outre, la souche HSV1-RFPVP26 a été utilisée pour des études sur l'infection à DC (précédemment décrites dans Turan et al., 2019). Ce virus exprime la protéine de surface capside VP26 fusionnée à la protéine fluorescente rouge monomère (MRFP).
<ol><li>Transférer les iDC ou les mDC (2 x 106) de l'étape 1.3 dans un tube de 2 ml. Par la suite, centrifuger les cellules à 3390 x g pendant 1,5 min et jeter le supernatant.</li>
	<li>Resuspendre doucement les cellules dans le milieu d'infection (RPMI 1640 complété avec 20 mM HEPES).<ol>
<li>Pour inhiber la voie de dégradation autophagosomal-lysosomal, pré-traiter DCs avec spautin-1 ou bafilomycine-A1 1 h avant l'infection. Ajoutez 10 M spautin-1 ou 1 M BA1, ou DMSO comme contrôle non traité, au milieu de l'infection. Incuber les cellules dans un bloc chauffant à 300 tr/min en secouant à 37 oC pendant 1 h.</li>
		<li>Pour les études d'infection, inoculer les cellules avec des virions de HSV-1 à une multiplicité d'infection (MOI) de 2. Ajouter le volume respectif de tampon MNT (30 mM 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES), 100 mM NaCl, 20 mM Tris) comme contrôle simulé. Incuber les cellules dans un bloc chauffant à 300 tr/min en secouant à 37 oC pendant 1 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 h après l'infection (hpi), recueillir les cellules à 3390 x g pendant 1,5 min. Aspirate inoculum et resuspendre doucement les cellules dans le milieu DC contenant 40 U/mL de GM-CSF, 250 U/mL d'IL-4 et soit 10 M spautin-1, 1 M BA1, ou DMSO comme contrôle. Seed simulé-traité et HSV-1-infectés cellules à une concentration finale de 1 x 106/mL dans une plaque de 6 puits.</li>
	<li>À 16-24 hpi, récolter les cellules en rinçant (mDCs) ou à l'aide d'un grattoir cellulaire (iDC). Transférer les cellules dans un tube de safelock de 1,5 ml.<ol>
<li>Recueillir les cellules par centrifugation à 3390 x g pendant 1,5 min et laver la pastille une fois en ajoutant 1 ml de PBS.</li>
		<li>Resuspendre vigoureusement les cellules dans le mélange de lyse contenant 29 oL de 2x Roti-Load, 1 L 100 mM MgCl2 et 12,5 U/mL de benzonase.</li>
		<li>Pour la lyse cellulaire et la digestion de l'ADN à l'aide de benzonase, incuber les échantillons à 37 oC pendant 10 min. Par la suite, dénaturer les protéines à 95 oC pendant 10 min.</li>
		<li>Effectuez des analyses SDS-PAGE et Western blot pour vérifier les niveaux de protéines de LC3BI/II, p62, ICP0/5 et GAPDH.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Interférence du flux autophagique induit par HSV-1 par électroporation des iDC utilisant FIP200-siRNA
REMARQUE : Le protocole actuel pour l'électroporation de siRNA a été modifié de Prechtel et autres (2007) et Gerer et autres (2017).
<ol><li>Transférer les iDC (12 x 106) au jour 3,5 après l'adhérence dans un tube de 50 ml. Par la suite, centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min et jeter le supernatant. En parallèle, effectuer une analyse cytométrique du débit pour surveiller l'état de maturation tel que décrit à l'étape 2 (Utiliser la vie/violet mort au lieu de CD80-PacBlue).</li>
	<li>Laver délicatement les iDC dans 5 ml d'OptiMEM sans phenol rouge et centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min. Jetez le supernatant et resuspendez doucement les iDC dans 200 'L d'OptiMEM sans phenol rouge, en ajustant une concentration cellulaire de 6 x 106/100 'L. Ne placez pas les cellules sur la glace et évitez les altérations de température. Avancez rapidement et évitez les longues périodes d'incubation des iDC dans OptiMEM sans rouge phénol.</li>
	<li>Transférer soit 75 pmol de siRNA SPÉCIFIQUE à la FIP200, soit 75 pmol de siRNA brouillé, en tant que contrôle, dans des cuvettes électro de 4 mm et ajouter 100 l (6x106 cellules) de la suspension cellulaire. Pulsation directe iDCs en utilisant l'appareil d'électroporation I, en appliquant les réglages suivants: 500 V pour 1 ms.<ol>
<li>Avant la procédure expérimentale, préparer les suspensions de siRNA selon les instructions du fabricant, aliquot et les stocker à -20 oC. Décongelez-les et gardez-les sur la glace lorsque vous utilisez ces siRNAs pour l'électroporation. Avant d'électroporating les échantillons, effectuer une impulsion d'essai.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Après l'électroporation, transférer directement l'iDC dans des assiettes de 6 puits avec un milieu DC frais et réchauffé (complété par 40 U/mL de GM-CSF et 250 U/mL d'IL-4). Ensemencer les cellules à une concentration finale de 1 x 106/mL et les placer dans un incubateur. Ne pas rincer les cellules de l'électro cuvette.</li>
	<li>Après 48 h, d'abord examiner la morphologie des iDC électroporated microscopiquement. Puis, récolter les cellules à l'aide d'un ferrailleur de cellules et les transférer dans des tubes de 15 ml. Rincer les puits avec 1 ml de PBS complété par 0,01% EDTA et transférer la solution dans les tubes respectifs.</li>
	<li>Par la suite, divisez 6 x 106 iDCs par condition de siRNA comme décrit dans les étapes suivantes.<ol>
<li>Utilisez 0,5 x 106 cellules pour évaluer l'état de maturation et la viabilité cellulaire tel que décrit à l'étape 2. Utilisez les anticorps suivants : CD11c-PE-Cy5, CCR7-PE-Cy7, CD83-APC, MHCII-APC-Cy7 et Life/Dead violet.</li>
		<li>Utilisez 1 x 106 cellules pour les analyses western blot pour vérifier l'efficacité de knockdown FIP200-spécifique. Transférer et récolter les cellules dans un tube de safelock de 1,5 ml par centrifugation à 3390 x g pendant 1,5 min. Préparer les lysates cellulaires tels que décrits à l'étape 3.4 et effectuer des analyses de tache occidentale.</li>
		<li>Utilisez les cellules restantes (4,5 x 106) pour les expériences d'infection par le VHS-1. Pour chaque condition expérimentale, transférer 2,25 x 106 iDC dans des tubes de 2 ml et soit les infecter avec HSV1 à un MOI de 2 ou ajouter mNT tampon comme un contrôle simulé. Effectuer l'infection telle que décrite à l'étape 3.3.</li>
		<li>À 20 hpi, récoltez les cellules à l'aide d'un grattoir cellulaire et préparez les lysates cellulaires pour les analyses de tache occidentale telles que décrites à l'étape 3.4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Modulation de la voie autophagosome-lysosomal dans les MDC HSV-1-infectés utilisant l'électroporation de KIF1B/2A-siRNA
<ol><li>Transférer les iDC (24 x 106) au jour 4 après l'adhérence dans un tube de 50 ml. Par la suite, centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min et jeter le supernatant.</li>
	<li>Resuspendre doucement les iDC dans 8 ml de PBS, pour ajuster une concentration cellulaire finale de 3 x 106/mL. Transférer 3 x 106 cellules dans des tubes de 1,5 ml et récolter les cellules à 3390 x g pendant 1,5 min.</li>
	<li>Resuspendre les iDC dans 100 L de tampon P3 contenant le mélange de supplément (selon les instructions du fabricant; appareil kit d'électroporation II) et soit (i) 75 pmol de siRNA KIF1B-spécifique, (ii) 75 pmol de siRNA KIF2A-spécifique, ou (iii) les deux. Utilisez (iv) la quantité respective de siRNA brouillé comme un contrôle. Préparer deux tubes pour chaque condition de siRNA (6 x 106 cellules) et transférer les suspensions en cuvettes électro séparées. Pulsez directement les iDC appliquant l'impulsion « EH-100 » à l'aide de l'appareil d'électroporation II.<ol>
<li>Avant la procédure expérimentale, préparer les suspensions de siRNA selon les instructions du fabricant, aliquot et les stocker à -20 oC. Décongelez-les et gardez-les sur la glace lorsque vous utilisez ces siRNAs pour l'électroporation. Ne placez pas les iDC sur la glace et évitez les altérations de température. Passez à autre chose rapidement et évitez une longue incubation d'iDC dans le PBS ou le tampon P3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Directement après l'électroporation, ajouter 500 l de RPMI 1640 préréchauffé aux cuvettes électro. Incuber les cellules dans un incubateur pendant 5-10 min. Transférer les iDC dans des assiettes de 6 puits avec un milieu DC fraîchement réchauffé (complété par 40 U/mL de GM-CSF et 250 U/mL d'IL-4). Combinez les conditions respectives en un seul puits, ensemencez les cellules à une concentration finale de 1 à 106/mL et placez-les dans un incubateur.</li>
	<li>4 h après l'incubation, ajouter le cocktail de maturation contenant les cytokines énumérés à l'étape 1.2.2. REMARQUE : Préparer un échantillon de DC non électroporated (1 x 106) comme contrôle pour les analyses cytométriques de débit 2 jours après électroporation. Traiter les cellules témoins de façon analogue aux échantillons électroporated.</li>
	<li>Deux jours après l'électroporation, récolter les cellules par resuspension et le transférer dans des tubes de 15 ml. Rincer les puits avec 1 ml de PBS et transférer les suspensions dans les tubes respectifs. Fractionner 6 à 106 DC par condition de siRNA tel que décrit dans les étapes suivantes :<ol>
<li>Utilisez 0,25 x 106 DC (électroporated et non électroporated) pour vérifier l'état de maturation et la viabilité cellulaire tel que décrit à l'étape 2. Utilisez les anticorps suivants : CD80-PE-Cy5, CD83-APC, CD86-PE, MHCII-APC-Cy7 et Life/Dead violet.</li>
		<li>Utilisez 0,75 x 106 cellules pour les analyses de tache occidentale pour évaluer l'efficacité de knockdown KIF1B/2A-spécifique. Recueillir les cellules dans un tube de safelock de 1,5 ml par centrifugation à 3390 x g pendant 1,5 min. Préparer les lysates cellulaires tels que décrits à l'étape 3.4 et effectuer des analyses de tache occidentale.</li>
		<li>Utilisez les cellules restantes (5 x 106) de chaque condition de siRNA et effectuez des expériences d'infection de HSV-1. Pour chaque condition expérimentale, transférer 2,5 x 106 iDC dans des tubes de 2 ml et soit les infecter avec hSV-1 à un MOI de 2 ou ajouter mNT tampon comme un contrôle simulé. Effectuer l'infection telle que décrite à l'étape 3.3.</li>
		<li>À 20 h après l'infection, récoltez les cellules par résuspension et préparez des lysates cellulaires pour les analyses de tache occidentale pour vérifier l'induction du chiffre d'affaires autophagique induit par HSV-1, comme décrit ci-dessus à l'étape 3.4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Les auteurs n'ont rien à révéler.

La portée du protocole actuel comprend (i) la manipulation des iDC humains dérivés de monocytes ainsi que des mDC, (ii) leur infection par le VHS-1, (iii) leur traitement avec des composés connus pour inhiber l'autophagie, et (iv) leur électroporation avec siRNA à l'aide de deux différentes configurations techniques. En utilisant le protocole actuel, le flux autophagique peut être bloqué dans les iDC infectés par le VhS-1 ou induit dans les MDC infectés par le VHS-1.
Puisque les DC, et en particulier les iDC, sont des cellules très vulnérables, travailler avec ces cellules implique des étapes plutôt délicates. Pour la génération DC, nous recommandons d'utiliser des PBMC fraîchement isolés, et d'éviter leur cryoconservation, afin d'obtenir des rendements cellulaires plus élevés. De plus, lors de la manipulation des iDC pendant les expériences, y compris leur culture ultérieure, prévenir les altérations de température sévères ou prolongées. Dans le cas contraire, les iDC pourraient subir des changements phénotypiques et il est donc nécessaire de vérifier leur phénotype immature par cytométrie de flux. Notez, contrairement à leurs homologues matures, iDC s'ils n'ont pas de marqueurs distincts, tels que CD80, CD83, et CD8628,29. L'infection des iDC et des MDC avec HSV-1 est une méthode bien établie2,3,4,5,6,10. Nous et d'autres avons montré que les CD sont très sensibles à l'infection par le VHS-1, lorsqu'un MOI de 1 ou 2 a été utilisé (figure 2). Dans nos mains, le maintien du volume du milieu de l'infection à de faibles niveaux (1-3 x 106 cellules dans 250-350 L) conduira à une meilleure efficacité de l'infection.
Une approche classique pour interférer avec une voie cellulaire distincte donnée est l'utilisation de composés spécifiques. Une variété de modulateurs différents de l'autophagie, c'est-à-d. activateurs ainsi que des inhibiteurs, sont actuellement disponibles30. En ce qui concerne hSV-1-induit autophagie dans DCs, Turan et al., (2019) a récemment montré les effets inhibiteurs de la spautin-1 et la bafilomycine-A1 (BA1) sur le chiffre d'affaires autophagique dans iDCs10. Cette technique pour l'inhibition de l'autophagie est appropriée pour la combinaison avec une infection ultérieure de HSV-1, puisque ni le taux d'infection ni le statut de maturation des DCs (particulièrement iDCs) n'est altéré. Dans les applications futures, cette approche basée sur l'inhibiteur pourrait être appliquée également en combinaison avec d'autres agents infectieux, les conditions de stress, telles que la famine, ainsi que pour différents types de cellules. Cependant, lors de l'utilisation d'inhibiteurs, des limitations se posent dans la détermination de la concentration appropriée pour une inhibition efficace de l'autophagie, sans affecter gravement la viabilité cellulaire. La principale limitation lors de l'utilisation d'inhibiteurs est, cependant, l'apparition d'effets indésirables potentiels hors cible ou indésirables, ce qui pourrait conduire à des résultats trompeurs31,32.
La deuxième approche pour interférer avec l'autophagie, couverte dans le protocole actuel, est le knockdown spécifique utilisant siRNA33,34,35. D'une part, nous avons utilisé l'appareil d'électroporation I pour acérer spécifiquement l'expression de FIP200, inhibant ainsi le roulement autophagique induit par HSV-1 dans les iDC. D'autre part, nous avons réduit au silence deux protéines KIF différentes (c.-à-d., KIF1B et KIF2A), en utilisant l'appareil d'électroporation II, pour faciliter le flux autophagique dans les MDC infectés par le VHS-1. Les deux protocoles d'électroporation ont donné lieu à une ablation presque complète de FIP200 dans les iDC, et de KIF1B/KIF2A dans les MDC, qui a été vérifiée par des analyses de taches occidentales(figure 4A, figure 5A). Contrairement à l'appareil d'électroporation I, qui n'affecte pas la viabilité des DC, l'électroporation des MDC à l'aide de l'appareil d'électroporation II entraîne des taux légèrement plus élevés de cellules mortes (Figure 4B, Figure 5B ). Par conséquent, dans les applications futures, l'appareil d'électroporation je devrais être utilisé de préférence pour les deux, iDCs et mDCs. Remarquablement, les deux techniques siRNA-basées, pour moduler le flux autophagique, sont compatibles avec l'infection suivante de HSV-1 des iDCs ou des MDC. En outre, ni le phénotype immature des iDCs ni le phénotype mûr des MDCs n'est altéré après électroporation.
L'électroporation des iDC utilisant l'ARNs fiP200-spécifique est une méthode efficace et très spécifique pour le knockdown de gène aussi bien que l'inhibition du flux autophagique sur l'infection de HSV-1. En plus du silence spécifique de FIP200, ce protocole peut être adapté pour faire taire d'autres composants autophagiques, participant à différentes étapes pendant la cascade autophagique. Cependant, l'identification de la cible appropriée pour l'inhibition efficace de l'autophagie par l'ARNar comprend plusieurs aspects préoccupants. Tout d'abord, l'efficacité de knockdown des gènes liés à l'autophagie (ATG) n'est pas nécessairement positivement corrélée avec l'inhibition efficace de l'autophagie et est fortement dépendante de la protéine spécifique ATG qui est réduite au silence36. Deuxièmement, les protéines ATG distinctes sont en outre impliqués dans des voies distinctes de l'autophagie, de ainsi leur ablation pourrait également conduire à des effets secondaires indésirables37,38,39. Troisièmement, différents ATG peuvent avoir des fonctions redondantes, de ce fait, le renversement d'un composant peut ne pas être suffisant pour inhiber l'autophagie(p. ex. ., beclin-1 et beclin-2)40.
En outre, l'appareil d'électroporation I-basé protocole d'électroporation des DCs est également approprié pour les ARNM, et pourrait être utilisé pour une variété de types de cellules primaires supplémentaires, tels que PBMCs25. Ce système fournit donc une stratégie générale pour livrer des espèces d'ARN distinctes dans différents types de cellules primaires. En conclusion, nous présentons deux protocoles pour inhiber le flux autophagique, en utilisant une approche inhibitrice ou siRNA-basée combinée avec l'infection suivante de HSV-1 des iDCs. En outre, nous décrivons une approche d'électroporation de siRNA pour induire le flux autophagique dans les MDCs sur l'infection de HSV-1.

La génération de cellules dendritiques d'origine monocyte humaine (DC) constitue un modèle in vitro approprié pour étudier les fonctions et la biologie de ce type important de cellules immunitaires. L'isolement ainsi que la différenciation des monocytes en DC s'est bien établi ces dernières années1,2. L'infection des DC avec l'herpès-herpès simplex virus de type 1 (HSV-1) sert de système modèle pour étudier les modulations HSV-1-négociées de la biologie DC2,3,4,5,6 . Ceci est particulièrement important pour élucider comment les herpèsvirus amortissent ou inhibent les réponses immunitaires antivirales puissantes, pour établir la latence dans les niches immunisées-privilégiées à l'intérieur de l'hôte7,8. À cet égard, les herpèsvirus sont des agents pathogènes très efficaces qui sont largement répandus dans toute la population atteignant une prévalence séro-jusqu'à 90 % selon la région géographique9. Pour comprendre et peut-être prévenir cela, plus d'informations sur les modulations HSV-1-négociées du système immunitaire de l'hôte, et en particulier des cellules immunitaires telles que les DC, sont nécessaires.
Une observation complètement nouvelle concernant l'interaction des DC avec HSV-1 a été récemment publiée par Turan et al.10. Les auteurs ont démontré que l'accomplissement de la réplication de HSV-1 dépend strictement du statut de maturation des DC. Dans les iDC, la réplication complète du HSV-1 est facilitée par des mécanismes dépendants de l'autophagie. Tandis que HSV1 induit l'autophagie dans les deux, iDCs et MDCs, flux autophagique est observé seulement dans iDCs. Ceci facilite à son tour l'évacuation nucléaire des capsides virales par la dégradation autophagique des lamins nucléaires dans les iDC. Pour obtenir des informations mécanistes sur cette voie de dégradation induite par le HSV-1 dans les cDI par rapport aux CDM, de nouvelles stratégies efficaces sont essentielles pour étudier le flux autophagique.
La macroautophagie (autophagie) est un procédé multi-étapes bien conservé ciblant les protéines intracellulaires ou les organites entiers pour la digestion lysosomal11. Simplistement, l'autophagie peut être divisée en (i) initiation, (ii) nucléation de membrane, (iii) expansion de vésicule, et (iv) phase de fusion autophagosome-lysosome12. Pendant l'initiation (i), des composants tels que le complexe activé ULK1/2 kinase, contenant la protéine d'interaction kinase focale d'adhérence de 200 kD (FIP200), sont essentiels pour activer le complexe beclin-1-Vps34-AMBRA1. Par la suite, la nucléation membranaire (ii) initie la formation de phagophore13, qui engloutit les cargaisons cytoplasmiques qui sont marquées par des molécules telles que p6214. Pendant l'expansion de vésicule et la maturation d'autophagophore (iii) microtubule-associé chaîne de lumière de protéine 3 (LC3)-I est converti en sa forme lipidique LC3-II qui est insérée dans la membrane autophagosomal. Ainsi, les taux de conversion LC3-I à -II sont un indicateur de l'induction de l'autophagie en reflétant la formation d'autophagosomes matures15,16. Lors de la fusion autophagosome-lysosome (iv), non seulement la cargaison autophagique, mais aussi les protéines associées p62 et LC3-II subissent une dégradation (par exemple, par hydrolyse). Ainsi, la perte de p62 et LC3-II servent de marqueurs pour le flux autophagique17. La fusion des autophagosomes avec des lysosomes, et donc suivant le chiffre d'affaires autophagique, est fortement dépendante de la localisation lysosomale intracellulaire. Ceci est, entre autres, réglementé par les membres de la famille kinesin KIF1B et KIF2A, qui ont été montrés pour affecter négativement autophagosome-lysosome fusion18. Fait intéressant, l'expression protéique de KIF1B et KIF2A est induite lors de la maturation DC et est donc responsable du flux autophagique inefficace dans les MDC infectés par le VhS-1, qui entrave la réplication complète du HSV-110.
Les tentatives expérimentales de moduler l'autophagie comprennent l'utilisation de composés connus pour induire ou inhiber cette voie particulière19,20,21. Dans cette étude, nous décrivons deux stratégies inhibitrices pour bloquer le chiffre d'affaires autophagique dans les iDC HSV-1-infectés. Le premier composé utilisé dans nos expériences est spécifique et puissant inhibiteur de l'autophagie-1 (spautin-1), qui a été décrit pour promouvoir la dégradation complexe beclin-1-Vps34-AMBRA1 au cours de la phase d'initiation de l'autophagie22. Le deuxième composé utilisé dans la présente étude est la bafilomycine-A1 (BA1), un inhibiteur de V-ATPase qui bloque les événements autophagiques tardifs (c.-à-d.la fusion autophagosome-lysosome aussi bien que l'acidification autolysosome)23,24. L'utilisation de l'un ou l'autre de ces deux inhibiteurs avant l'infection d'iDC avec HSV-1 inhibe potentiellement l'autophagie, mais ne perturbe pas l'expression efficace de gène viral. Ainsi, cette stratégie basée sur l'inhibiteur avant l'infection à HSV-1 offre un outil puissant pour inhiber le flux autophagique induit par le VhS-1 qui peut facilement être étendu pour une pléthore de différents types de cellules et de virus, qui induisent également potentiellement l'autophagie.
Pour surmonter un inconvénient majeur d'une approche basée sur les inhibiteurs (c.-à-d., des effets hors cible non spécifiques), nous avons développé une méthode basée sur le siRNA pour bloquer le flux autophagique dans les iDC (hSV-1-infectés). La technique de l'électroporation de siRNA représente une stratégie alternative puissante, par l'ablation sélective de l'expression des protéines distinctes (c.-à-d., composants autophagiques). Dans nos expériences, les iDC ont été électroporated avec l'ARNde FIP200-spécifique utilisant l'appareil d'électroporation I (voir tableau des matériaux) et un protocole modifié décrit par Gerer et autres (2017) et Prechtel et autres (2007), pour inhiber l'autophagie pendant le phase d'initiation25,26. Cette technique nous a permis de frapper spécifiquement l'expression FIP200 dans les iDC, sans interférer avec la viabilité cellulaire et leur phénotype immature deux jours après l'électroporation. Il convient de noter que l'infection au VHS-1 a été établie dans ces iDC électroporated reflétés par une expression efficace des protéines virales. Cette technique basée sur l'ARNre offre un avantage unique (c.-à-d., qu'une variété de différents composants autophagiques, même en combinaison), peut être spécifiquement ciblée pour l'ablation de leur expression.
Dans cette étude, nous décrivons en outre une méthode siRNA-basée pour induire le flux autophagique également dans HSV-1-infecté mDCs. Dans ce cas, les iDC ont été électroporated avec siRNA visé contre KIF1B et KIF2A avant la maturation de DC utilisant l'appareil d'électroporation II (voir tableau des matériaux). Puisque les deux protéines sont upregulated pendant la maturation de DC et connues pour réguler négativement la fusion des autophagosomes avec des lysosomes10,18, leur flux autophégique fortement induit de knockdown dans les MDCs sur l'infection de HSV-1. Ainsi, la technique basée sur le siRNA nous a permis d'induire spécifiquement le chiffre d'affaires autophagique en interférant avec l'expression de protéine de KIF dans les MDC, et pourrait ainsi imiter leurs niveaux d'expression dans les iDCs.
En résumé, nous présentons deux méthodes distinctes pour inhiber le flux autophagique dans les iDC HSV-1-infectés. Alors que la première approche basée sur l'inhibiteur constitue un moyen facile, bon marché et rapide d'interférer avec la dégradation autophagique, la deuxième technique basée sur le siRNA est plus spécifique et une méthode très appropriée pour soutenir et vérifier les résultats de l'inhibiteur à base Expériences. En outre, nous décrivons une méthode pour induire le flux autophagique également dans les MDC HSV-1-infectés, par l'intermédiaire du knockdown siRNA-négocié de deux protéines de KIF.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4D-Nucleofector Core Unit (electroporation apparatus II)</td>
			<td>Lonza (Basel, Switzerland)</td>
			<td>AAF-1002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB-Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td>
			<td>H4522</td>
			<td>Dendritic cell cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACD-A</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td>
			<td>9007281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (electroporation kit apparatus II)</td>
			<td>Lonza (Basel, Switzerland)</td>
			<td>V4XP-3024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td>GE Healthcare (Solingen, Germany)</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td>Western Blot Detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse-IgG (mouse, polyclonal, HRP)</td>
			<td>Cell Signaling (Leiden, Netherlands)</td>
			<td>7076</td>
			<td>Western Blot detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit-IgG (goat, polyclonal, HRP)</td>
			<td>Cell Signaling (Leiden, Netherlands)</td>
			<td>7074</td>
			<td>Western Blot detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bafilomycin A1</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td>
			<td>tlrl-baf1</td>
			<td>inhibition of autophagy and lysosomal degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Canto II Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences (Heidelberg, Germany)</td>
			<td>338962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blotting Chamber Fastblot B44</td>
			<td>Biometra (G&#246;ttingen, Germany)</td>
			<td>846-015-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR7 (mouse, Pe-Cy7)</td>
			<td>BioLegend (Fell, Germany)</td>
			<td>557648</td>
			<td>Flow cytometry 
			Dilution: 1:100 
			Clone: G043H7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c (mouse, Pe-Cy5)</td>
			<td>BD Biosciences (Heidelberg, Germany)</td>
			<td>561692</td>
			<td>Flow cytometry 
			Dilution: 1:100 
			Clone: B-ly6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 (mouse, PE)</td>
			<td>BD Biosciences (Heidelberg, Germany)</td>
			<td>555398</td>
			<td>Flow cytometry 
			Dilution: 1:100 
			Clone: M5E2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 (mouse, FITC)</td>
			<td>BD Biosciences (Heidelberg, Germany)</td>
			<td>555332</td>
			<td>Flow cytometry 
			Dilution: 1:100 
			Clone: UCHT1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD80 (mouse, V450)</td>
			<td>BD Biosciences (Heidelberg, Germany)</td>
			<td>560442</td>
			<td>Flow cytometry 
			Dilution: 1:100 
			Clone: L307.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD83 (mouse, APC)</td>
			<td>eBioscience Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany)</td>
			<td>17-0839-41</td>
			<td>Flow cytometry 
			Dilution: 1:200 
			Clone: HB15e</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86 (mouse, PE)</td>
			<td>BD Biosciences (Heidelberg, Germany)</td>
			<td>553692</td>
			<td>Flow cytometry 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Cell Imaging</td>
			<td>System AMG/Life Technologies (Carlsbad, USA)</td>
			<td>AMF4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIP200 (rabbit)</td>
			<td>Cell Signaling (Leiden, Netherlands)</td>
			<td>12436</td>
			<td>Western Blot detection 
			Dilution: 1:1000 
			Clone: D10D11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (mouse)</td>
			<td>Merck Millipore (Massachusetts, USA)</td>
			<td>AB2302</td>
			<td>Western Blot detection 
			Dilution: 1:5000 
			Clone: MAB374</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II apparatus (electroporation apparatus I)</td>
			<td>BioRad Laboratories GmbH (M&#252;nchen, Germany)</td>
			<td>165-2112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF (4x104 U/mL)</td>
			<td>Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany)</td>
			<td>130-093-868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA&#8208;DR (mouse, APC-Cy7)</td>
			<td>BioLegend (Fell, Germany)</td>
			<td>307618</td>
			<td>Flow cytometry 
			Dilution: 1:200 
			Clone: L243</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43</td>
			<td>BioVex</td>
			<td></td>
			<td>DC infection 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICP0 (mouse)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA)</td>
			<td>sc-53070</td>
			<td>Western Blot detection 
			Dilution: 1:1000 
			Clone: 11060</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICP5 (mouse)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA)</td>
			<td>sc-56989</td>
			<td>Western Blot detection 
			Dilution: 1:1000 
			Clone: 3B6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1&#946; (0.1x106 U/mL)</td>
			<td>Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany)</td>
			<td>1411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4 (1x106 U/mL)</td>
			<td>Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany)</td>
			<td>130-093-924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6 (1x106 U/mL)</td>
			<td>Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany)</td>
			<td>1404-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant LAS 4000</td>
			<td>GE Healthcare (Solingen, Germany)</td>
			<td>28955810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIF1B (mouse)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA)</td>
			<td>sc-376246</td>
			<td>Western Blot detection 
			Dilution: 1:1000 
			Clone: E-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIF2A (mouse)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA)</td>
			<td>sc-271471</td>
			<td>Western Blot detection 
			Dilution: 1:1000 
			Clone: D-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3B (rabbit)</td>
			<td>Cell Signaling (Leiden, Netherlands)</td>
			<td>3868</td>
			<td>Western Blot detection 
			Dilution: 1:1000 
			Clone: D11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Lonza (Basel, Switzerland)</td>
			<td>17-605E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Violet dead cell stain kit</td>
			<td>Life Technologies (Carlsbad, CA, USA)</td>
			<td>L34964</td>
			<td>L/D staining in Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Alere Technologies AS (Oslo, Norway)</td>
			<td>04-03-9391/01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesiumchloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>A537.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megafuge 2.0 RS</td>
			<td>Heraeus (Hanau, Germany)</td>
			<td>75015505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N, N, N&#39;, N&#39;-Tetramethylethylendiamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer counting chamber</td>
			<td>Brand (Wertheim, Germany)</td>
			<td>717805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Cell culture flasks (175.0 cm2)</td>
			<td>Thermo Scientific (Rockford, USA)</td>
			<td>159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p62 (rabbit)</td>
			<td>Cell Signaling (Leiden, Netherlands)</td>
			<td>88588</td>
			<td>Western Blot detection 
			Dilution: 1:1000 
			Clone: D5L7G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler prestained protein ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany)</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16 %</td>
			<td>Alfa Aesar, Haverhill, USA</td>
			<td>43368.9M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfectSpin 24 Plus</td>
			<td>Peqlab (Erlangen, Germany)</td>
			<td>C2500-R-PL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGE2 (1 mg/mL)</td>
			<td>Pfizer (Berlin, Germany)</td>
			<td>BE130681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Lonza (Basel, Switzerland)</td>
			<td>17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein gel system MiniProtean II</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories GmbH (M&#252;nchen, Germany)</td>
			<td>1652960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RestoreTM Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific, Rockford, USA</td>
			<td>21059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Platform wt 15</td>
			<td>Biometra (G&#246;ttingen, Germany)</td>
			<td>042-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RotiBlock</td>
			<td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>A151.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti-Load 1 (4x)</td>
			<td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>K929.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotiphorese Gel 30 (37.5:1)</td>
			<td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>3029.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Lonza (Basel, Switzerland)</td>
			<td>12-167F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>2326.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf (Hamburg, Germany)</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-&#945; (10 &#956;g/mL)</td>
			<td>Peprotech (Hamburg, Germany)</td>
			<td>300-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>4855.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution (0.4 %)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>9127.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 0.2 &#956;m nitrocellulose membrane</td>
			<td>GE Healthcare (Solingen, Germany)</td>
			<td>10600001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WhatmanTM Chromatography Paper 3 mm Chr</td>
			<td>Fisher Scientific GmbH (Schwerte, Germany)</td>
			<td>3030917</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sirna electroporation to modulate autophagy in herpes simplex virus type 1-infected monocyte-derived dendritic cells

Le virus de l'herpès simplex type-1 (HSV-1) induit l'autophagie dans les deux cellules dendritiques immatures (iDC) ainsi que dans les cellules dendritiques matures (MDC), tandis que le flux autophagique n'est observé que dans les iDC. Pour obtenir des connaissances mécanistes, nous avons développé des stratégies efficaces pour interférer avec le chiffre d'affaires autophagique induit par le HSV-1. Une stratégie basée sur l'inhibiteur, pour moduler l'autophagie induite par le HSV-1, constitue le premier choix, car il s'agit d'une méthode facile et rapide. Pour contourner les effets hors cible non spécifiques potentiels de tels composés, nous avons développé une stratégie alternative basée sur le siRNA, pour moduler le chiffre d'affaires autophagique dans les iDC s'ils étaient infectés par le VHS-1. En effet, l'électroporation des iDC avec l'ARNde FIP200-spécifique avant l'infection de HSV-1 est une méthode très spécifique et réussie pour aérer l'expression de protéine de FIP200 et ainsi pour inhiber le flux autophagique. Les deux méthodes présentées ont comme conséquence l'inhibition efficace du chiffre d'affaires autophagique HSV-1-induit dans iDCs, par lequel la technique siRNA-basée est plus spécifique de cible. Une approche siRNA-basée additionnelle a été développée pour réduire sélectivement au silence l'expression de protéine de KIF1B et de KIF2A, facilitant le chiffre d'affaires autophagique sur l'infection de HSV-1 dans les MDCs. En conclusion, la technique de l'électroporation de siRNA représente une stratégie prometteuse, pour aplanir sélectivement l'expression des protéines distinctes et pour analyser leur influence sur une infection de HSV-1.

Dans ce manuscrit, nous décrivons des méthodes pour interférer avec l'autophagie HSV-1-induite dans les cellules dendritiques. Cela comprend la génération d'iDC et de MDC dérivés de monocytes humains, qui ont été analysés phénotypiquement par cytométrie du débit (Figure 1). Le jour 4 après l'adhérence, les DC montrent un phénotype immature caractérisé par l'expression faible de CD80, CCR7, et CD83 aussi bien que l'expression élevée de CD11c et intermédiaire de MHCII. Étant donné que les signaux CD3 et CD14 sont absents, les contaminations par les lymphocytes T et les monocytes peuvent être exclues. Le jour 6 après l'adhérence (c.-à-d., jour 2 après l'induction de la maturation), Les DC montrent un phénotype mûr reflété par une augmentation significative de cD80, CCR7, CD83, et MHC-II expression de surface. L'infection par une souche HSV-1 exprimant le PFGe (figure 2) entraîne une infection presque complète des iDC(figure 2A panneau supérieur) ou des MDC (figure 2A panneau inférieur, figure 2B), selon la base signaux GFP forts analysés par microscopie de fluorescence aussi bien que cytométrie de flux.
Comme démontré dans notre rapport récent, HSV-1 induit l'autophagie à la fois dans les iDCetet, cependant, le chiffre d'affaires autophagique se produit dans iDCs seulement10. Dans une première approche, nous avons traité les iDC et les MDC avec spautin-1 (Figure 3A) - pour bloquer l'initiation à l'autophagie - ou la bafilomycine-A1 (BA1; Figure 3B) - pour inhiber la fusion finale autophagosome-lysosome. Sur l'infection de HSV-1 des iDCs en l'absence de spautin-1 et BA1, le flux autophagique est reflété par le déclin de l'expression p62 et LC3B, respectivement. En revanche, l'infection de HSV-1 des mDCs en l'absence de spautin-1 n'affecte pas l'expression p62, alors que le traitement de spautin-1 et BA1 induise une accumulation de LC3B-II. Cela reflète l'induction de l'autophagie, mais un échec du chiffre d'affaires autophagique dans les MDC. Dans iDCs, le prétraitement de spautin-1 restaure fortement la dégradation autophagique de p62 sur l'infection de HSV-1, due à l'inhibition de l'autophagie pendant la phase d'initiation. Sur le pré-traitement avec BA1, les iDC simulés et HSV-1-infectés montrent une forte accumulation des niveaux de protéine de LC3B-II, indiquant l'inhibition réussie du chiffre d'affaires autophagique par bloquant la fusion autophagosome-lysosome en retard. Conformément à cela, le prétraitement spautin-1 et BA1 des MDCs a également comme conséquence le p62 stable et les niveaux accrus de protéine de LC3B-II, respectivement.
Dans une deuxième méthode pour altérer le flux autophagique, l'électroporation de siRNA ciblant FIP200 est examinée concernant sa capacité à bloquer le flux autophagique dans les iDC HSV-1-infectés. Comme le montre la figure 4A, des niveaux de protéines FIP200 fortement réduits ont été détectés dans les iDC 48 h après l'électroporation, par rapport au contrôle de l'ARNc. À l'heure actuelle, les iDC ne montrent aucun signe de mort cellulaire (figure 4B) et maintiennent leur phénotype immature (figure 4C). L'infection des iDC FIP200-silence avec HSV-1 indique une forte diminution du flux autophagique comparé à leurs homologues siRNA-traités de contrôle (figure 4D). Ceci est accompagné par des niveaux accrus de protéines de LC3B ainsi que p62 lorsque FIP200 est réduit au silence dans les iDC infectés par le VHS-1.
Dans une tentative inverse, nous avons étudié si l'ablation siRNA-négociée de kIF1B et d'expression de protéine de KIF2A permet le chiffre d'affaires autophagosomal-lysosomal également dans HSV-1-infecté MDCs. Ainsi, les iDC ont été électroporated à l'aide de siRNAs spécifiques ciblant l'une ou les deux de ces protéines, et les cellules ont ensuite été mûrises (figure 5). 2 jours après l'électroporation, les MDC montrent une forte réduction de l'expression des protéines KIF1B et/ou KIF2A, lorsque des siARN spécifiques ont été utilisés (figure 5A). Cette méthode n'a pas non plus entraîné la mort cellulaire importante(figure 5B) ni des changements dans leur état de maturation phénotypique (figure 5C). Soutenant l'importance de KIF1B et KIF2A pendant la dégradation autophagosomal-lysosomal, leur épuisement avant l'infection de HSV-1 facilite un flux autophagique accru dans les MDCs. Ceci se reflète par une diminution des niveaux résiduels de protéines p62, contrairement à l'état de contrôle respectif (figure 5D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60190/60190fig01.jpg"> Figure 1 : Caractérisation phénotypique des iDC et des CDM dérivés du monocyte humain à l'aide de la cytométrie du débit. Des DC ont été générés et tachés d'anticorps spécifiques pour vérifier leur pureté :( A) CD3 pour exclure les contaminations de cellules T, (B) CD14 pour exclure la contamination par des monocytes, et (C) CD11c comme marqueur pour les DC. Pour évaluer leur état de maturation phénotypique, les anticorps suivants ont été utilisés : (D) CD80, (E) CCR7, (F) CD83, et (G) MHCII. Ces molécules sont fortement exprimées sur les MDC et permettent ainsi la discrimination entre le phénotype immature et mature de DC. Les données ont été analysées à l'aide de FCS express 5.0. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60190/60190fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60190/60190fig02.jpg"> Figure 2 : Analyses cytométriques microscopiques et d'écoulement des iDC et des CDM infectés par le VHS-1. les iDC et les CDM ont été infectés par une souche HSV-1 exprimant l'EGFP (HSV-1 EGFP), afin de permettre la quantification du taux d'infection en fonction du signal GFP. (A) Analyses microscopiques des iDC et iDC infectés par le HSV-1 infectés par le GPF et les CDM infectés à un MOI de 2, comparativement à leurs homologues non infectés, à 24 hpi. Pour visualiser les cellules infectées, la fluorescence du GFP a été surveillée. La barre d'échelle représente 400 m. (B) Mesure cytométrique de flux des MDC simulés ou infectés par le HSV-1 pendant la cinétique de l'infection. Les panneaux supérieurs (histogrammes doublés noirs) présentent un état simulé, les panneaux inférieurs (histogrammes remplis de noir) montrent les cellules infectées par le VHS-1 après les points de temps indiqués après l'infection. Les données ont été analysées à l'aide de FCS express 5.0. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60190/60190fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60190/60190fig03.jpg"> Figure 3 : Spautin-1 et b afilomycine-A1 modulent le flux autophagique dans les iDC infectés par le VhS-1. iDCs et mDCs ont été traités avec (A) spautin-1 ou (B) ) bafilomycine-A1 (BA1) pendant 1 h avant l'infection. Les cellules ont par la suite été infectées par un simulacre ou un infection par le VhS-1 (HSV1-RFPVP26) à l'aide d'un MOI de 2. Après 16-18 h, des DC ont été moissonnés et des lysates de protéine ont été soumis au blotting occidental pour déterminer l'expression de p62 ou de LC3B-I/-II comme marqueurs autophagiques, ICP0 comme contrôle d'infection, et GAPDH comme contrôle de chargement. Les niveaux de protéines LC3B-I et LC3B-II ont été quantifiés et normalisés à la protéine de référence GAPDH utilisant Bio1D (densité optique). Le rapport entre les signaux LC3B-II normalisés et les signaux LC3B-I normalisés est indiqué. Ce chiffre a été modifié et adapté de © 2019 Turan et coll. initialement publié dans JCB. https://doi.org/10.1083/jcb.20180115110. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60190/60190fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60190/60190fig04.jpg"> Figure 4 : Analyse du flux autophagique dans les iDC infectés par le VHS-1 lors de l'électroporation DE l'ARNC FIP200-si. iDCs ont été électroporated avec le siRNA de commande ou le siRNA FIP200-spécifique utilisant l'appareil d'électroporation I. (A) DCs ont été analysés concernant l'efficacité de FIP200 knockdown 48 h après électroporation, en effectuant des analyses occidentales de tache. (B) La viabilité cellulaire ainsi que (C) état de maturation a été analysée avant l'électroporation (histogrammes bleu clair) et 48 h post (histogrammes bleu foncé et gris) électroporation par cytométrie de flux. Les valeurs médianes pour trois donneurs différents sont indiquées. Après avoir confirmé le knockdown efficace de FIP200 et le phénotype immature, les cellules ont été HSV-1-infectées (HSV-1 EGFP) utilisant un MOI de 2. Les données ont été analysées à l'aide de FCS express 5.0. (D) À 20 h après l'infection, les cellules ont été soumises à des analyses de tache occidentale pour déterminer l'expression de LC3B-I/-II et p62 comme marqueurs autophagiques. ICP5 a été détecté comme contrôle d'infection, et GAPDH comme contrôle de chargement. Les panneaux A et D ont été modifiés et adaptés à partir de © 2019 Turan et coll. publiés à l'origine dans JCB. https://doi.org/10.1083/jcb.20180115110. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60190/60190fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60190/60190fig05.jpg"> Figure 5 : ablation par iRNA de KIF1B et/ou KIF2A module le chiffre d'affaires autophagique dans les MDC h.1-infectés. les iDC ont été électroporated avec le siRNA KIF1B-spécifique et/ou KIF2A-spécifique, aussi bien que siRNA de commande, utilisant l'appareil d'électroporation II. À 4 h après l'électroporation, la maturation a été induite par l'addition d'un cocktail de maturation. À 48 h après l'électroporation, les DC ont été analysés en ce qui concerne (A) l'efficacité du knockdown de KIF par l'intermédiaire du ballonnement occidental, (B) viabilité cellulaire aussi bien que leur (C) état phénotypique de maturation utilisant des analyses cytométriques de flux (deux différents donateurs sont montrés). "w/o EP" signifie sans électroporation, mais après induction de maturation; « EP de contrôle post » signifie après électroporation à l'aide du siRNA de contrôle ; " post KIF1B, KIF2A, KIF1B/2A EP " signifie post électroporation à l'aide de siRNA spécifiques kIF1B et/ou KIF2A. Après avoir confirmé l'élimination efficace de KIF1B et/ou KIF2A et du phénotype mature, les cellules ont été infectées par le VHS-1 (HSV-1 EGFP) à l'aide d'un MOI de 2. Les données ont été analysées à l'aide de FCS express 5.0. (D) Les cellules ont été soumises à des analyses de tache occidentale 20 h après l'infection, afin d'évaluer l'expression de p62 comme marqueur autophagique. ICP5 a été utilisé comme un contrôle de l'infection, et GAPDH comme contrôle de chargement. Les figures A et D ont été modifiées et adaptées à partir de ©2019 Turan et coll. initialement publiés dans JCB. https://doi.org/10.1083/jcb.20180115110. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60190/60190fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

Watch this Scientific Journal Video about siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells at JoVE.com

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

Dans cette étude, nous présentons des stratégies inhibitrices et siRNA-basées pour interférer avec le flux autophagique dans le virus simplex d'herpès type-1 (HSV-1)--infecté des cellules monocyte-dérivées de monocyte-dérivées.

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells SiRNA Electroporation to Modulate Autophagie in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...

Notre protocole décrit des méthodes pour interférer efficacement avec le chiffre d’affaires autophagique induit par HSV-1 dans les cellules dendritiques. Et en particulier, nous comparons un inhibiteur basé avec une stratégie basée sur le siRNA pour bloquer l’autophagie avant l’infection. Bien que l’interférence basée sur les inhibiteurs avec l’autophagie comporte des effets potentiels et spécifiques hors cible, notre stratégie développée basée sur le siRNA est plus spécifique à la cible.Fait important, les deux techniques présentées n’affectent pas les stades de maturation de la maladie. Petra Muhl-Zurbes, technicienne, et Alexandra Duthorn, étudiante diplômée, de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Commencez par récolter des cellules dendritiques immatures ou des iDC en rinçant doucement les cellules lâchement adhérentes du fond du flacon de culture cellulaire le quatrième jour après l’adhérence.Ajoutez un cocktail de maturation aux cellules pour générer des cellules dendritiques matures ou des MDC. Deux jours après l’induction de la maturation, rincer les mDC à partir du fond de la fiole de culture cellulaire. Répétez le rinçage deux fois, puis transférez les iDC et les mDC dans des tubes de 50 millilitres dans leur milieu de culture respectif.Récolter les cellules par centrifugation à 300 fois g pendant cinq minutes. Resuspendez doucement les cellules en cinq à 10 millilitres de RPMI 1640 par flacon de culture cellulaire et combinez les suspensions DC respectives dans un tube. Quantifiez ensuite les cellules à l’aide d’une chambre de comptage en vous assurant d’éviter les changements de température lors de la manipulation des CD.Transférer deux millions d’iDC ou de mDC dans un tube de deux millilitres, les centrifuger à 3 390 fois g pendant 1 1/2 minute et jeter le supernatant. Doucement, le resuspendre les cellules dans le milieu de l’infection. Inhiber la voie de dégradation lysosomale autophagosomale en ajoutant 10 spautin-1 micromolaire ou un micromolaire bafilomycine A1 au milieu de l’infection une heure avant l’infection.Ajouter DMSO pour le contrôle non traité et incuber les cellules sur un bloc chauffant à 37 degrés Celsius avec secousses à 300 RPM. Pour les études d’infection, inoculer les cellules avec des virions HSV-1 à une multiplicité d’infection de deux. Ajouter le volume respectif de tampon MNT comme un simulacre de contrôle et d’incuber les cellules sur un bloc chauffant à 37 degrés Celsius pendant une heure avec des secousses.Une heure après l’infection, recueillir les cellules par centrifugation à 3390 fois g pendant 1-1/2 minutes, puis aspirer l’inoculum doucement et resuspendre les cellules dans dc moyen. Maquette de graines traitée et cellules infectées par le HSV-1 à une concentration finale d’un million de cellules par millilitre dans une plaque de six puits. À 16 à 24 heures après l’infection, récoltez les iDC à l’aide d’un grattoir cellulaire ou de mDC en rinçant, transférez les cellules dans un tube de verrouillage sécuritaire de 1,5 millilitre et recueillez-les par centrifugation à 3 390 g pendant 1 1/2 minutes.Répétez la récolte et la centrifugation avec les cellules restantes dans les puits, puis lavez la pastille une fois avec un millilitre de PBS et résépendez vigoureusement les cellules dans le mélange de lyse. Incuber les échantillons à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis chauffer à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes. Effectuez l’analyse de la page SDS et de la tache occidentale pour vérifier les niveaux de protéines LC3B1 et LC3B2, P62, ICP0 et ICP5, et GAPDH.Le jour 3.5 après l’adhérence, transférer 12 millions d’iDC dans un tube de 50 millilitres, les centrifuger à 300 fois g pendant cinq minutes, puis jeter le supernatant. En parallèle, effectuez une analyse cytométrique du débit pour surveiller l’état de maturation. Lavez doucement les iDC en cinq millilitres d’Opti-MEM sans phénol rouge et centrifugez-les à 300 fois g pendant cinq minutes.Jetez le supernatant et resuspendez les cellules dans 200 microlitres d’Opti-MEM ajustant la concentration cellulaire à six millions de cellules pour 100 microlitres. Ajouter 75 picomoles de siRNA spécifique ou brouillé FIP200 à quatre électrocuvettes millimétriques et transférer 100 microlitres de la suspension cellulaire dans la cuvette respective. Pulsez directement les iDC à l’aide d’un appareil d’électroporation.Après l’électroporation, transférer les iDC dans des plaques de six puits avec un milieu de DC frais préchauffé, ensemencer les cellules à une concentration finale d’un million de cellules par millilitre et les placer dans l’incubateur. Après 48 heures, examiner la morphologie des iDC électroporés au microscope, puis récolter les cellules avec le grattoir cellulaire et les transférer dans des tubes de 15 millilitres. Rincer les puits avec un millilitre de PBS complété par 0,1%EDTA et transférer la solution dans les tubes respectifs.Ensuite, divisez les cellules pour chaque condition de siRNA comme décrit dans le manuscrit. Utilisez 500 000 cellules pour évaluer l’état de maturation et la viabilité des cellules, utiliser un million de cellules pour l’analyse des taches occidentales pour vérifier l’efficacité de knockdown spécifique fip200 et utiliser les cellules restantes pour les expériences d’infection HSV-1. Les iDC et les MDC générés ont été phénotypiquement analysés par cytométrie de flux afin d’exclure la contamination par d’autres types de cellules et de vérifier leur état de maturation.Les cellules ont été tachées d’anticorps CD3 et CD14 pour exclure la contamination des lymphocytes T et des monocytes respectivement. Les cellules ont été tachées pour CD11c qui sert de marqueur général fortement exprimé pour les CD. Pour évaluer l’état de maturation, des anticorps CD80, CCR7, CD83 et MHCII ont été utilisés parce que ces molécules sont fortement exprimées sur les CD matures.La microscopie de fluorescence et la cytométrie d’écoulement ont été employées pour déterminer l’infection avec EGFP exprimant HSV-1. Les signaux GFP forts indiquent une infection presque complète des IDC et des MDC. L’analyse occidentale de tache a été employée pour déterminer si la spautin-1 ou la bafilomycine A1 inhibent le flux autophagique dans les cellules infectées de HSV-1.Dans les iDC, le flux autophagique est démontré par le déclin de l’expression P62 et LC3B en l’absence respectivement de spautin-1 et de bafilomycine A1. En revanche, l’infection de HSV-1 des mDC en l’absence de spautin-1 n’affecte pas l’expression de P62 tandis que le traitement de spautin-1 et de BA1 a induit une accumulation de LC3B-II qui reflète l’induction de l’autophagie mais un échec du chiffre d’affaires autophagique dans les MDC. La réduction des niveaux de protéine FIP200 avec électroporation de siRNA provoque également une forte diminution du flux autophagique dans les iDC infectés par le HSV-1.Ce protocole d’électroporation basé sur le siRNA pour l’inhibition de l’autophagie n’affecte pas la viabilité cellulaire, le phénotype d’image ou l’établissement de l’expression de protéine HSV-1 dans les iDC. Nos protocoles d’électroporation offrent la possibilité de fournir des espèces distinctes d’ADN ou d’ARN dans la maladie et d’autres types de cellules primaires. Par la suite, une variété d’analyses moléculaires, fonctionnelles et d’infection peuvent être exécutées.La stratégie basée sur le siRNA pour le silencing d’expression dans la maladie ouvre la voie à explorer la fonction de n’importe quelle protéine d’intérêt, également combinée avec des analyses fonctionnelles suivantes.

Research

JoVE Journal

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