Nous remercions Peter Staeheli pour fournir souris B6.A2G-MX1 et Semra Özcelik pour avis technique. Ce travail a été soutenu par la Fondation allemande pour la recherche par le biais SFB829 et KN536 / 16, et le Köln Fortune Programme / Faculté de médecine, Université de Cologne.

Déclaration éthique. La préparation de feuilles épidermiques à partir d&#39;animaux sacrifiés est effectuée en stricte conformité avec les recommandations du Guide de Landesamt für Natur, Umwelt et Verbraucherschutz, Rhénanie du Nord-Westphalie (Allemagne). L&#39;étude a été approuvée par LANUV NRW (Nombre 8.84-02.05.20.13.018). 1. Préparation d&#39;instruments et Culture Media <ol><li> Cultiver feuilles épidermiques dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) / glucose élevé dipeptide contenant de la glutamine, 10% de FCS, 100 UI / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine (ci-après dénommé &quot;DMEM&quot;). </li><li> Pour la préparation de feuilles épidermiques, dissoudre soigneusement dispase II poudre (5 mg / ml) dans du PBS chauffé (jusqu&#39;à 37 ° C). Filtrer la solution à travers un filtre de 0,22 um et l&#39;utiliser directement pour le traitement. </li><li> Pour la préparation de l&#39;épiderme tout montures 13, préparer blocage chamoiser avec du lait en poudre 0,5%, 0,25% de gélatine à partir de peau de poisson d&#39;eau froide et de 0,5% de Triton X-100 dans du TBS. Permettre aux substances à dissoudre par l&#39;incubation du mélange pendant au moins 2 heures à température ambiante sur un mélangeur rotatif. Préparer également 0,2% de Tween 20 dans du PBS comme tampon de lavage. Pour la fixation, la préparation de 3,4% et 4% de formaldehyde dans du PBS. </li><li> Pour l&#39;immunocoloration de cryosections, préparer le tampon de blocage avec 5% de sérum de chèvre normal et 0,2% de Tween 20 dans du PBS. Pour la fixation, préparer 0,5% de formaldéhyde dans du PBS. </li></ol> 2. Préparation des feuilles de épidermiques de la peau murine <ol><li> Préparation de l&#39;épiderme de la peau du nouveau-né de retour pour des études d&#39;infection <ol><li> Placez une souris décapitée (1 à 3 jours après la naissance) dans un plat de dissection et couper les extrémités et la queue près du torse pour permettre une élimination efficace de la peau du torse complet. Lors de la dépose des extrémités, essayez de garder les coupes aussi faible que possible de diamètre. </li><li> Fixer le torse avec une pince fine une courbend déplacez doucement ciseaux à embout arrondi sous la peau du crâne caudal le long du dos de séparer la peau du torse. Fendez la peau le long du dos. </li><li> Pour l&#39;analyse FACS, l&#39;isolement des kératinocytes ou la préparation de l&#39;ARN, décoller la peau complète du torse en utilisant une pince pour fixer le tissu et les ciseaux à embout arrondi pour pousser le torse. Pour la préparation de cryocoupes ou montures entières ne prendre que des morceaux de la peau du dos. </li><li> Hacher la peau du dos avec un scalpel dans 1-2 pièces d&#39;environ 10 x 10 mm. Mettez les morceaux dans un puits d&#39;une plaque à 6 puits avec ~ 1 ml de PBS stérile. Assurez-vous que le côté dermique face au fond. </li><li> Remplacer PBS par 1,5 ml dispase II (5 mg / ml de PBS) et incuber pendant soit 30 min à 37 ° C (pour les montages entiers) ou O / N à 4 ° C. Laver 3 fois avec du PBS. Retirez délicatement l&#39;épiderme comme une feuille intacte en utilisant une pince pour fixer les derme sous-jacent et les autres pince pour soulever l&#39;épiderme. Utilisez une paire de jumelles pour faire de cette étape EASy. Transférer la feuille épidermique dans du DMEM avec sa face basale vers le bas. Utilisez les feuilles immédiatement pour des expériences d&#39;infection. REMARQUE: Utilisez la préparation de l&#39;épiderme de la peau du nouveau-né principalement pour l&#39;analyse FACS, l&#39;isolement des kératinocytes ou la préparation de l&#39;ARN. En raison de sa fragilité, la préparation de feuilles infectées pour cryocoupes ou montures entières est moins approprié. </li></ol></li><li> Préparation de l&#39;épiderme de la peau adulte de queue pour des études d&#39;infection <ol><li> Euthanasier les souris à l&#39;âge de 1 à 3 mois par dislocation cervicale. Prenez la queue à la place de la peau en arrière depuis les follicules pileux à long embarqués sur le dos entravent séparation des feuilles épidermiques intactes. Coupez la queue de souris sacrifiées et fente en longueur avec un scalpel. </li><li> Décoller la peau de l&#39;os et le hacher avec un scalpel en morceaux d&#39;environ 5 x 5 mm. Mettez jusqu&#39;à 4 pièces dans un puits et procéder à l&#39;incubation dans dispase II tel que décrit à la section 2.1.5 REMARQUE: Utilisez tai adultel peau pour préparer cryocoupes ou montures entières. Alternativement à l&#39;utilisation immédiate, les queues peuvent être stockés ou transportés pendant environ 24 heures à 4 ° C sans perte d&#39;efficacité de l&#39;infection importante. Si les queues sont tenus à 48 h, feuilles épidermiques pourraient difficilement être infectées par le HSV-1. </li></ol></li><li> La dissociation de l&#39;épiderme pour une analyse FACS REMARQUE: La détection de l&#39;expression de protéine de surface par analyse FACS nécessite des techniques de dissociation de cellules appropriées qui ne nuisent pas à la surface de la cellule et la protéine d&#39;intérêt. <ol><li> Incuber feuilles épidermiques nouveau-nés dans une plaque à 6 puits avec la partie basale de 1,5 ml / solution de dissociation cellulaire bien recombinant basé trypsine pendant 15 min à température ambiante et pendant 15 minutes à 37 ° C. </li><li> Arrêtez l&#39;incubation en ajoutant 3 ml de DMEM. Dissocier les kératinocytes en utilisant une pince fine courbes se déplacer doucement l&#39;épiderme dans la plaque de 6 puits de sorte que les kératinocytes se dissout. Recueillir la suspension cellulaire et répétez cette étape 3 foisen utilisant toujours DMEM frais. Remarque: Cette procédure de dissociation est approprié pour détecter nectin-1 sur la surface des kératinocytes. </li><li> En variante, incuber les feuilles épidermiques sur une solution de dissociation cellulaire sans enzyme (CDS) pendant 15 min à la température ambiante et 15 min à 37 ° C. Incuber un autre 15 minutes à température ambiante pour rincer délicatement les kératinocytes par pipetage CDS haut et en bas. </li><li> Recueillir la suspension cellulaire et répétez l&#39;étape de rinçage 3 fois avec des ingrédients frais DMEM. REMARQUE: Cette dissociation est adapté pour détecter l&#39;expression de surface de HVEM. L&#39;inconvénient de la solution de la CDS est que moins de cellules sont dissociées avec une solution de dissociation cellulaire basé trypsine recombinante. En plus de l&#39;expression de surface, l&#39;expression cytoplasmique ou nucléaire telle que ICP0 expression peut être analysée par FACS après dissociation des feuilles infectées avec épidermiques solution de dissociation cellulaire à base de trypsine recombinante. </li></ol></li><li> La dissociation de l&#39;épiderme pour isoler les kératinocytes ou exARN tractus <ol><li> Mettre feuilles épidermiques nouveau-nés dans une plaque à 6 puits avec la face basale vers le fond de la boîte qui contient de 1,5 ml / solution de dissociation cellulaire à base de trypsine et recombinant. Incuber pendant 30 min à température ambiante. Ajouter 3 ml de DMEM et de dissocier les kératinocytes en utilisant une pince fine courbes se déplacer doucement l&#39;épiderme dans le plat. </li><li> Recueillir la suspension cellulaire et répétez cette étape 3 fois avec des ingrédients frais DMEM. Utiliser cette suspension de cellules à extraire l&#39;ARN ou à la culture des kératinocytes primaires murins. </li></ol></li></ol> 3. L&#39;infection des feuilles épidermiques avec HSV-1 <ol><li> Préparer une solution de souche HSV-1 17 en poids de 11 à au moins 500 ul de DMEM et remplacer le milieu par la solution de virus à laquelle les feuilles épidermiques sont flottantes. Ce point de temps est défini comme le temps 0 12. Effectuer l&#39;infection d&#39;une feuille épidermique dans un puits d&#39;une plaque de 24 puits à 37 ° C. Le calcul du titre de virus est basé sur le nombre estiméde cellules dans la couche basale de l&#39;épiderme par feuille (environ 2 x 10 5 cellules par feuille 5 x 5 mm). </li><li> Infect avec HSV-1 à environ 100 unités formant des plages (PFU) / cellule et remplacer le milieu contenant le virus par du milieu DMEM à 1 h pi NOTE: En cas de feuilles épidermiques de la peau du nouveau-né, gardez à l&#39;esprit que les feuilles commencent à se dissocier pendant l&#39;incubation. </li></ol> 4. Visualisation des cellules infectées <ol><li> Épidermique entier Mounts 13 <ol><li> Fixer feuilles épidermiques avec 3,4% de formaldéhyde, soit pendant 2 heures à la température ambiante ou O / N à 4 ° C. Laver deux fois avec du PBS et bloquer avec du lait en poudre 0,5%, 0,25% de gélatine à partir de peau de poisson d&#39;eau froide et de 0,5% de Triton X-100 dans du TBS pendant 1 heure à température ambiante 14. </li><li> Incuber les feuilles O / N avec la souris anti-ICP0 (anticorps monoclonal 11060) 15 dilué 1:60 dans un tampon de blocage à la température ambiante. Pour visualiser le réseau de filaments intermédiaires incuber simultanément avec polyclonaux de lapin anti-kératine souris 14 (100 ng / ml). </li><li> Laver 4 à 5 fois avec du PBS-0,2% de Tween 20 pendant 4 heures à température ambiante. Incuber O / N avec AF488 conjugué anti-IgG de souris (1 ug / ml), anti-IgG de lapin de AF555-conjugué (1 ug / ml), et le DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole) (100 ng / ml) dans du tampon de blocage à température ambiante. </li><li> Laver avec du PBS-0,2% de Tween 20 pendant 4 heures à température ambiante. Monter épidermiques feuilles avec leur côté basale sur une lame d&#39;échantillon, intégrer dans un milieu de montage fluorescent et couvrent avec des lamelles. </li></ol></li><li> Épidermique cryosections <ol><li> Feuilles épidermiques adultes ont été fixées dans du formaldehyde à 4% dans du PBS pendant 20 min à température ambiante et on les lave 2 fois avec du PBS. Feuilles fixes Intégrer dans le tissu milieu de congélation et de gel dans de l&#39;azote liquide. Couper 8-10 um sections avec un cryomicrotome. </li><li> Fixer les sections à nouveau avec 0,5% de formaldehyde dans du PBS pendant 10 min à température ambiante, laver 2 fois avec du PBS, bloc avec 5% de sérum de chèvre normal et 0,2% de Tween 20 dans du PBS pendant 30 min à température ambiante, puis la coloration pendant 60 min avec mouse anti-ICP0 (anticorps monoclonal 11060) 15 dilué 1:60 dans du tampon de blocage, puis 3 fois avec le tampon de lavage de blocage. </li><li> Puis incuber avec AF488 conjugué IgG anti-souris (1 pg / ml) et DAPI (100 ng / ml) dans du tampon de blocage pendant 45 min à température ambiante et laver 3 fois. Incluez sections en milieu de montage fluorescent et couvrir avec des lamelles. </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Lorsque des feuilles épidermiques de la peau des adultes à partir de souris C57BL / 6 sont infectées par le HSV-1 à environ 100 PFU / cellule, on observe infection dans presque toutes les cellules de la couche basale de l&#39;épiderme interfolliculaire tandis que des doses de virus plus bas en corrélation avec les cellules moins infectée, et une plus lente progression de l&#39;infection. En général, les follicules pileux présentent un nombre variable de cellules infectées; alors que la plupart des petits plut...

Herpes simplex virus (HSV) peut provoquer une série de maladies chez l&#39;homme des lésions cutanéo-muqueuses de simples doux aux infections mortelles. HSV de type 1 (HSV-1) est dominante associée à des infections oro-faciales et l&#39;encéphalite, tandis que le HSV de type 2 (HSV-2) provoque plus susceptibles infections génitales 1. Bien qu&#39;il y ait des progrès significatifs dans la compréhension comment HSV pénètre dans les cellules en culture, déclenche l&#39;infection et produit descendance virale, nous savons peu de choses sur la voie d&#39;invasion virale (s) dans les tissus au niveau cellulaire 2. Pour les études de HSV peau ou des infections des muqueuses, les souris, les lapins et les cochons d&#39;Inde ont été utilisés comme modèles animaux. Infection de la peau a été établie par une injection intradermique ou par grattage de la peau en la présence du virus, et développement de la maladie a été corrélée avec la production de virus. Ces méthodes ont permis de comprendre les différents aspects de la pathogenèse de la maladie, et sont utilisés pour évaluer les médicaments antiviraux. Pour étudier l&#39;infection HSV au tissue niveau, les modèles organotypiques de peau humaine ont été appliquées. Comme le taux d&#39;infection est limité dans ces cultures en radeau, seul un nombre limité d&#39;études portant sur ​​l&#39;infection, la propagation virale et les effets des composants antiviraux ont été publiées 3-6. Afin de caractériser les déterminants cellulaires qui jouent un rôle lors de HSV-1 infection dans l&#39;épithélium intact, nous avons établi un protocole pour les ex vivo des études d&#39;infection de l&#39;épiderme murins 7. Peau été préparé à partir des nouveau-nés ou des queues de souris adultes. Depuis HSV-1 n&#39;a pas pu infecter des échantillons de peau qui ont été effectués, dans un milieu submergées contenant le virus, nous avons séparé l&#39;épiderme du derme par la dispase II traitement. Après flottant des feuilles épidermiques sur un milieu contenant le virus, les cellules infectées peuvent être visualisés dans la couche épidermique de base à différents moments après l&#39;infection (pi) 7. Pour visualiser le début de l&#39;infection dans des cellules individuelles avant une réplication viralend production de virus, nous avons coloré avec un anticorps dirigé contre la protéine de cellule infectée 0 (ICP0), qui est l&#39;une des premières protéines exprimées au cours de l&#39;infection par HSV-1. La localisation cellulaire de ICP0 passe par des phases distinctes lors d&#39;une infection précoce. Bien que ICP0 est présent dans des foyers nucléaires pendant un stade précoce de l&#39;expression virale de gènes, de relocalisation ICP0 vers le cytoplasme indique une phase ultérieure de l&#39;infection 8. Nous avons utilisé le test infection ex vivo de feuilles épidermiques à partir de différents modèles de souris pour tester le rôle potentiel de divers facteurs cellulaires lors de l&#39;infection. Pour faire face à l&#39;impact de Rac1 comme un régulateur clé de la dynamique de l&#39;actine, nous avons infecté des souris de l&#39;épiderme avec une deletion spécifique de kératinocyte du gène 9 Rac1. Ce modèle nous a permis d&#39;étudier les conséquences de Rac1 déficiente sur l&#39;efficacité du HSV-1 chez les couches de kératinocytes épidermiques. La comparaison de l&#39;épiderme infectées de la même portée de contrôle rémis au jour de pas de différence significative, ce qui indique que l&#39;absence de Rac1 n&#39;a eu aucun effet sur ​​l&#39;initiation de l&#39;infection dans la couche basale de l&#39;épiderme 7. L&#39;utilisation de modèles supplémentaires de souris nous a permis d&#39;aborder des récepteurs cellulaires qui médiatisent l&#39;entrée dans l&#39;épiderme. Infecter les feuilles épidermiques à partir de soit nectin-1 ou des souris déficientes en HVEM avec HSV-1 a révélé que la première entrée du virus dans les tissus dépend fortement de la présence d&#39;une 10-nectine. De plus, nos résultats démontrent que HVEM peut également servir de récepteur dans l&#39;épiderme de souris, bien que moins efficacement que nectin-1 10. Pour répondre à la répartition spatiale des cellules infectées dans les couches épidermiques, on visualise de ICP0 expression dans des coupes de tissus épidermiques et montures entières (figure 1). Dans cryocoupes de peau complet, pas de cellules exprimant ICP0 sont détectés (figure 1). En revanche, les cryosections de feuilles épidermiques démontrent cytoplasmiqueICP0 expression dans la couche basale déjà à trois heures pi (Figure 1). Au temps plus tard, la propagation virale à suprabasale couches peuvent être visualisés. La répartition spatiale des cellules infectées dans la couche basale peut être facilement suivie dans épidermiques montures entières (Figure 1). Lors de l&#39;infection par le HSV-1 à 100 PFU / cellule, environ 50% des kératinocytes basales de l&#39;épiderme interfolliculaires montrer expression ICP0 à 1,5 h pi A ce point de temps la plupart des cellules infectées expriment ICP0 nucléaire. La relocalisation de ICP0 vers le cytoplasme indiquant un stade ultérieur de l&#39;expression du gène précoce est présente dans presque toutes les cellules à 3 h pi (Figure 1). Ces modes de visualisation de cellules infectées ex vivo sur HSV-1 infection fournissent un test puissant pour étudier l&#39;effet des inhibiteurs ou des composants cellulaires mutées supprimés / sur l&#39;entrée virale et la propagation dans le tissu.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM/high glucose/GlutaMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td align="right">31966047</td>
			<td>needed for cultivation of epidermal sheets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dispase II powder</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">4942078001</td>
			<td>has to be solved in heated PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enzyme-free cell dissociation solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5914</td>
			<td>needed for very gentle dissociation of epidermal sheets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE select cell dissociation solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12563-029</td>
			<td>needed for dissociation of epidermal sheets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chelex 100 resin</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>142-2832</td>
			<td>needed for chelation of polyvalent metal ions from the fetal calf serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gelatin from cold water fish skin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7765</td>
			<td>needed for minimization of non-specific antibody binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 14 Polyclonal Antibody (AF64) (conc.: 1 mg/ml)</td>
			<td>Covance</td>
			<td>PRB-155P</td>
			<td>used to visualize the intermediate filament keratin 14 which is a marker of the basal layer of the epidermis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor&#174; 488 conjugate (conc.: 2 mg/ml)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>used as secondary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor&#174; 555 conjugate (conc.: 2 mg/ml)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21429</td>
			<td>used as secondary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI dihydrochloride)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (conc.: 0.1 mg/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">36670</td>
			<td>used to counterstain the nucleus</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo infection of murine epidermis with herpes simplex virus type 1

Pour entrer dans son hôte humain, le type de virus de l&#39;herpès simplex de type 1 (HSV-1) doit surmonter la barrière de la muqueuse des surfaces, la peau ou cornée. HSV-1 cibles kératinocytes au cours de l&#39;entrée initiale et établit une infection primaire dans l&#39;épithélium, qui est suivie par une infection latente de neurones. Après la réactivation, les virus peuvent devenir évident dans les établissements cutanéo-muqueuses qui apparaissent sous forme de vésicules cutanées ou des ulcères des muqueuses. Comment HSV-1 envahit peau ou les muqueuses et atteint ses récepteurs est mal comprise. Pour enquêter sur la route d&#39;invasion du HSV-1 dans le tissu épidermique au niveau cellulaire, nous avons établi un modèle ex vivo de l&#39;infection de l&#39;épiderme murins, qui représente le site de l&#39;infection primaire et récurrent dans la peau. L&#39;essai comprend la préparation de la peau de souris. L&#39;épiderme est séparé du derme par traitement dispase II. Après flottant feuilles épidermiques sur un milieu contenant le virus, le tissu est fixe et l&#39;infection peut être visualisée à différents moments après l&#39;infection parla coloration des cellules infectées avec un anticorps contre le HSV-1 précoce immédiat de protéine ICP0. ICP0 cellules exprimant peut être observé dans la couche basale de kératinocytes déjà à 1,5 heures après l&#39;infection. Avec de plus longs temps d&#39;infection, les cellules infectées sont détectés dans les couches suprabasales, ce qui indique que l&#39;infection ne se limite pas aux kératinocytes basaux, mais le virus se propage à d&#39;autres couches dans le tissu. Utilisation de feuilles épidermiques de différents modèles de souris, le protocole d&#39;infection permet de déterminer l&#39;implication des constituants cellulaires qui contribuent à l&#39;invasion de HSV-1 dans le tissu. En outre, le dosage est adapté pour tester des inhibiteurs dans les tissus qui interfèrent avec les étapes initiales d&#39;entrée, la propagation de cellule à cellule et la production de virus. Ici, nous décrivons l&#39;ex vivo protocole d&#39;infection en détail et présentons nos résultats en utilisant des souris de Nectin-1- ou HVEM déficient.

La difficulté de la méthode consiste à préparer des feuilles épidermiques dans lequel HSV-1 peut pénétrer à partir de la couche basale. L&#39;étape critique est la séparation de l&#39;épiderme du derme par traitement dispase II, qui, en fonction de la souche de souris, doit être adaptée. La concentration de dispase II peut varier de 2,5 à 5 mg / ml, et le temps d&#39;incubation de 20 à 45 min. La coloration du filament intermédiaire protéines de kératine 14 permet facilement prédire si la couche basal...

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Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.

Ex Vivo infection de murin épiderme avec le virus Herpes simplex de type 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

11.1K vues.  University of Cologne. The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.

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Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

Ex vivo l&#39;imagerie de cellules T dans murin tranches avec des ganglions lymphatiques et la microscopie confocale Widefield

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Recherche

Immunologie et infection

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent reactivation events that ensure transmission and contribute to clinical disease. Current antivirals do not impact the latent reservoir and there are no vaccines. While the molecular details of lytic replication are well-characterized, mechanisms controlling latency in neurons remain elusive. Our present understanding of latency is derived from in vivo studies using small animal models, which have been indispensable for defining viral gene requirements and the role of immune responses. However, it is impossible to distinguish specific effects on the virus-neuron relationship from more general consequences of infection mediated by immune or non-neuronal support cells in live animals. In addition, animal experimentation is costly, time-consuming, and limited in terms of available options for manipulating host processes. To overcome these limitations, a neuron-only system is desperately needed that reproduces the in vivo characteristics of latency and reactivation but offers the benefits of tissue culture in terms of homogeneity and accessibility.
Here we present an in vitro model utilizing cultured primary sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG) (Figure 1) to study HSV-1 latency and reactivation that fits most if not all of the desired criteria. After eliminating non-neuronal cells, near-homogeneous TrkA+ neuron cultures are infected with HSV-1 in the presence of acyclovir (ACV) to suppress lytic replication. Following ACV removal, non-productive HSV-1 infections that faithfully exhibit accepted hallmarks of latency are efficiently established. Notably, lytic mRNAs, proteins, and infectious virus become undetectable, even in the absence of selection, but latency-associated transcript (LAT) expression persists in neuronal nuclei. Viral genomes are maintained at an average copy number of 25 per neuron and can be induced to productively replicate by interfering with PI3-Kinase / Akt signaling or the simple withdrawal of nerve growth factor1. A recombinant HSV-1 encoding EGFP fused to the viral lytic protein Us11 provides a functional, real-time marker for replication resulting from reactivation that is readily quantified. In addition to chemical treatments, genetic methodologies such as RNA-interference or gene delivery via lentiviral vectors can be successfully applied to the system permitting mechanistic studies that are very difficult, if not impossible, in animals. In summary, the SCG-based HSV-1 latency / reactivation system provides a powerful, necessary tool to unravel the molecular mechanisms controlling HSV1 latency and reactivation in neurons, a long standing puzzle in virology whose solution may offer fresh insights into developing new therapies that target the latent herpesvirus reservoir.

The protocol describes an efficient and reproducible model system to study herpes simplex virus type 1 (HSV-1) latency and reactivation. The assay employs homogenous sympathetic neuron cultures and allows for the molecular dissection of virus-neuron interactions using a variety of tools including RNA interference and expression of recombinant proteins.

Un système de neurones primaires de la culture pour l&#39;étude de l&#39;herpès simplex virus de latence et de réactivation

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

Isolation par cytométrie en flux des cellules primaires murins épithéliales alvéolaires de type II pour les études fonctionnelles et moléculaires

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Trans-vivo Delayed Type Hypersensitivity Assay for Antigen Specific Regulation

Delayed-type hypersensitivity response (DTH) is a rapid in vivo manifestation of T cell-dependent immune response to a foreign antigen (Ag) that the host immune system has experienced in the recent past. DTH reactions are often divided into a sensitization phase, referring to the initial antigen experience, and a challenge phase, which usually follows several days after sensitization. The lack of a delayed-type hypersensitivity response to a recall Ag demonstrated by skin testing is often regarded as an evidence of anergy. The traditional DTH assay has been effectively used in diagnosing many microbial infections.
Despite sharing similar immune features such as lymphocyte infiltration, edema, and tissue necrosis, the direct DTH is not a feasible diagnostic technique in transplant patients because of the possibility of direct injection resulting in sensitization to donor antigens and graft loss. To avoid this problem, the human-to-mouse "trans-vivo" DTH assay was developed 1,2. This test is essentially a transfer DTH assay, in which human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and specific antigens were injected subcutaneously into the pinnae or footpad of a na&iuml;ve mouse and DTH-like swelling is measured after 18-24 hr 3. The antigen presentation by human antigen presenting cells such as macrophages or DCs to T cells in highly vascular mouse tissue triggers the inflammatory cascade and attracts mouse immune cells resulting in swelling responses. The response is antigen-specific and requires prior antigen sensitization. A positive donor-reactive DTH response in the Tv-DTH assay reflects that the transplant patient has developed a pro-inflammatory immune disposition toward graft alloantigens.
The most important feature of this assay is that it can also be used to detect regulatory T cells, which cause bystander suppression. Bystander suppression of a DTH recall response in the presence of donor antigen is characteristic of transplant recipients with accepted allografts 2,4-14. The monitoring of transplant recipients for alloreactivity and regulation by Tv-DTH may identify a subset of patients who could benefit from reduction of immunosuppression without elevated risk of rejection or deteriorating renal function.
A promising area is the application of the Tv-DTH assay in monitoring of autoimmunity15,16 and also in tumor immunology 17.

We describe a valuable diagnostic assay that could potentially be used to decide the withdrawal of immunosuppression after transplant without elevated risk of graft rejection. The assay uses the principles of Delayed Type Hypersensitivity and provides accurate assessment of both donor specific effector and regulatory immune responses mounted by recipients.

Trans-vivo de type hypersensibilité retardée test pour le règlement spécifique de l&#39;antigène

Delayed-type hypersensitivity response (DTH) is a rapid in vivo manifestation of T cell-dependent immune response to a foreign antigen (Ag) that the host ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Évaluation de l&#39;efficacité et la toxicité des ARNs Ciblage VIH-1 Production pour utilisation en thérapie génique ou des médicaments

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under controlled laboratory conditions. Ex vivo infection of human tissues with human immunodeficiency virus (HIV), among other viruses, has been successfully used to investigate early disease pathogenesis, as well as a platform to test the efficacy and toxicity of antiviral drugs. In the present protocol, we explain how to process and infect with HIV-1 tissue explants from human tonsils and cervical mucosae, and maintain them in culture on top of gelatin sponges at the liquid-air interface for about two weeks. This non-polarized culture setting maximizes access to nutrients in culture medium and oxygen, although progressive loss of tissue integrity and functional architectures remains its main limitation. This method allows monitoring HIV-1 replication and pathogenesis using several techniques, including immunoassays, qPCR, and flow cytometry. Of importance, the physiologic variability between tissue donors, as well as between explants from different areas of the same specimen, may significantly affect experimental results. To ensure result reproducibility, it is critical to use an adequate number of explants, technical replicates, and donor-matched control conditions to normalize the results of the experimental treatments when compiling data from multiple experiments (i.e., conducted using tissue from different donors) for statistical analysis.

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Infection of human tissues with human immunodeficiency virus (HIV) ex vivo provides a valuable 3D model of virus pathogenesis. Here, we describe a protocol to process and infect tissue specimens from human tonsils and female genital mucosae with HIV-1 and maintain them in culture at the liquid-air interface.

Ex Vivo Infection de la muqueuse génitale humain tissu lymphoïde et femelle avec le Virus de l’immunodéficience humaine 1 et Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

Un modèle de Culture primaire de cellules bursite de poulet Ex Vivo pour étudier la bursite infectieuse Virus pathogenèse

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is responsible for the proteasomal degradation of host restrictive factors and the subsequent viral gene activation. ICP0 contains a canonical nuclear localization sequence (NLS). It enters the nucleus immediately after de novo synthesis and executes its anti-host defense functions mainly in the nucleus. However, later in infection, ICP0 is found solely in the cytoplasm, suggesting the occurrence of a nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. Presumably ICP0 translocation enables ICP0 to modulate its functions according to its subcellular locations at different infection phases. In order to delineate the biological function and regulatory mechanism of ICP0 nuclear-to-cytoplasmic translocation, we modified an immunofluorescent microscopy method to monitor ICP0 trafficking during HSV-1 infection. This protocol involves immunofluorescent staining, confocal microscope imaging, and nuclear vs. cytoplasmic distribution analysis. The goal of this protocol is to adapt the steady state confocal images taken in a time course into a quantitative documentation of ICP0 movement throughout the lytic infection. We propose that this method can be generalized to quantitatively analyze nuclear vs. cytoplasmic localization of other viral or cellular proteins without involving live imaging technology.

ICP0 undergoes nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. The molecular mechanism of this event is not known. Here we describe the use of confocal microscope as a tool to quantify ICP0 movement in HSV-1 infection, which lays the groundwork for quantitatively analyzing ICP0 translocation in future mechanistic studies.

Analyse temporelle de la Translocation nucléaire-à-cytoplasmique d’une Herpès Simplex Virus 1 protéine par microscopie confocale par immunofluorescence

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, such as type 2 diabetes and nonalcoholic steatohepatitis (NASH). Recent research has established that pro-inflammatory immune cells infiltrate obese hypertrophic adipose tissue and liver. Given the emerging importance of immune cells in the context of metabolic homeostasis, there is a critical need to quantify and characterize their modification during the development of type 2 diabetes and NASH. However, animal models that induce pathophysiological features typical of human NASH are sparse.
In this article, we provide a detailed protocol to identify immune cell subsets isolated from liver and adipose tissue in a reliable mouse model of NASH, established by housing high-fat diet (HFD) mice under non-specific pathogen-free (SPF) conditions without a barrier for at least seven weeks. We demonstrate the handling of mice in non-SPF conditions, digestion of the tissues and identification of macrophages, natural killer (NK) cells, dendritic cells, B and T cell subsets by flow cytometry. Representative flow cytometry plots from SPF HFD mice and non-SPF mice are provided. To obtain reliable and interpretable data, the use of antibodies, accurate and precise methods for tissue digestion and proper gating in flow cytometry experiments are critical elements.
The intervention to restore physiological antigen exposure in mice by housing them in non-SPF conditions and unspecific exposure to microbial antigens could provide a relevant tool for investigating the link between immunological alterations, diet-induced obesity and related long term complications.

A simple and reliable diet-induced rodent animal model for nonalcoholic steatohepatitis (NASH) is described, achieved through non-SPF housing of the animals and administration of a specific high-fat diet. We describe identification of hepatic and adipose immune cell subsets to recapitulate human immunological conditions by exposing mice to environmental germs.

Un modèle avancé de murine pour la stéatohépatite non alcoolisée en association avec le diabète de type 2

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

Test ELISA in Vitro pour évaluer la puissance vaccinale contre la rage

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...