Le virus oncolytique de l’herpès simplex est une forme émergente d’immunothérapie du cancer. Un système efficace de propagation, de purification et de détermination titerique du virus est essentiel pour l’utilisation dans les études expérimentales. Cette méthode est très simple et peut être facilement adoptée dans n’importe quel laboratoire de niveau de biosécurité deux pour recevoir un stock viral de haute qualité pour les études précliniques.
La production d’un stock viral pur et de haute qualité est cruciale car il est utilisé pour étudier la réponse immunitaire anticancéreuse et pour développer une nouvelle forme d’immunothérapie du cancer à base de virus. Ce protocole peut être utilisé pour purifier n’importe quel virus de l’herpès simplex de type sauvage ou génétiquement modifié. Ce protocole devrait être facile à lire et facile à suivre pour une personne qui n’a jamais exécuté cette technique avant.
Les matériaux et réactifs énumérés doivent être en place avant d’essayer cette technique pour la première fois. Commencez par laver les flacons T-150 centimètres carrés avec du DPBS de glucose deux fois élevé complété par 1% IFCS. Aspirer le DPBS et ajouter sept millilitres d’inoculum de virus par flacon.
Balancer délicatement les fioles pendant cinq minutes et incuber à 37 degrés Celsius pendant 1,5 à 2 heures. Ensuite, retirez l’inoculum et ajoutez 25 millilitres de DMEM complétés par 1% d’IFCS à chaque fiole. Après incubation à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant deux à quatre jours, recueillir 20 millilitres du surnageant de culture de chaque fiole dans des tubes à centrifuger de 50 millilitres.
À l’aide d’un grattoir à cellules, grattez les cellules du fond des fioles. Ajouter environ 15 millilitres du surnageant de culture précédemment recueilli dans chaque fiole pour porter le volume à 20 millilitres, puis utiliser une pipette sérologique stérile de 10 millilitres pour laver doucement le fond des fioles plusieurs fois. Recueillir les cellules avec du milieu dans des tubes à centrifuger coniques de 50 millilitres placés sur de la glace.
Centrifuger les tubes à 300 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Ressusciter soigneusement chaque pastille dans 1,25 millilitres de tampon viral, ou VB, et 1,25 millilitres de surnageant de culture précédemment recueilli. Mélanger toutes les pastilles remises en suspension dans un tube de centrifugeuse conique de 50 millilitres.
Enciquez les cellules remises en suspension à l’aide de glace carbonique et d’éthanol à 100% et stockez-les à moins 80 degrés Celsius. Décongeler les cellules congelées précédemment cassées dans un bain d’eau chaude à 37 degrés Celsius et soniquer pendant une minute pendant trois cycles dans un bain-marie. Ajouter 175 unités de benzonase nucléase et deux microlitres de deux chlorures de magnésium millimolaires par millilitre du lysat cellulaire et du vortex.
Après une incubation de 30 minutes et un bain d’eau tiède à 37 degrés Celsius, placez le tube sur de la glace. Faire tourner le lysat cellulaire à 300 fois G pendant 10 minutes. Recueillir le surnageant dans un nouveau tube de centrifugeuse conique de 50 millilitres et ressusciter la pastille cellulaire dans 500 microlitres de VB. Désignez-le comme granulé un.
Faites tourner à nouveau le surnageant collecté à 500 fois G pendant 10 minutes et conservez le surnageant séparément dans un tube de centrifugation conique frais de 50 millilitres pour l’utiliser plus tard. Ressusciter la pastille cellulaire dans 500 microlitres de VB, en la désignant comme pastille deux. Mélanger le pastille remise en suspension un et le granulé deux dans un nouveau tube de centrifugation de 1,75 millilitre et vortex et sonique deux fois au bain-marie avant de faire tourner les tubes à 400 fois G pendant 10 minutes.
Recueillir le surnageant à partir d’un tube de centrifugation de 1,7 millilitre et le combiner avec le tube de centrifugation conique de 50 millilitres précédemment collecté. Filtrez le surnageant à travers un filtre à membrane PVDF stérile de cinq micromètres dans un nouveau tube à centrifuger de 50 millilitres appelé tube un. Ajoutez un millilitre de VB au tube de centrifugation de 50 millilitres, vidé après avoir filtré le surnageant de l’étape précédente, le vortex, et passez-le à travers le même filtre à membrane PVDF placé sur le tube un.
Passez le filtrat du tube un à travers un filtre à membrane MCE stérile de 0,8 micromètre placé sur un nouveau tube à centrifuger de 50 millilitres appelé tube deux. Ajoutez un millilitre de VB au tube vidé un, vortex, et passez-le à travers le même filtre MCE placé sur le tube deux. Passez le filtrat du tube deux à travers un filtre PVDF stérile de 0,45 micromètre placé sur un nouveau tube centrifuge de 50 millilitres étiqueté tube trois.
Comme décrit précédemment, répétez le lavage du tube deux avec un millilitre de VB pour ajouter du filtrat au tube trois. Dans cette analyse représentative, l’effet cytopathic a pu être observé dans les cellules de Vero à 36, 48, et 72 heures d’infection d’oHSV avec l’arrondi des cellules affectées. Le niveau croissant de CPE au fil du temps est évident tel que visualisé par l’expression de mCherry.
À 72 heures d’infection de poteau, des plaques virales ont été souillées avec X-gal pour visualiser l’oHSVs avec l’expression de lacZ. Il est essentiel de nettoyer doucement les cellules infectées par le virus et de laver doucement le fond du ballon pour garder intactes toutes les cellules infectées par le VHS afin d’obtenir un stock viral à titre élevé.
