Le protocole aide les étudiants à identifier clairement les infections individuelles et à effectuer le test facilement, ce qui rend plus efficace la quantification du titre viral. Ce protocole intègre une procédure simple de fixation et de coloration qui produit des résultats fiables et reproductibles. Cette méthode peut fournir un aperçu de la précision et de l’efficacité des traitements antiviraux contre les maladies.
Les obstacles les plus difficiles de ce protocole d’affaissement sont le nombre de cellules pour les plaques d’ensemencement, en s’assurant que les cellules ne se surchargent pas, ne se dessèchent pas ou ne se rayent pas tout au long du processus. On peut aussi éprouver des difficultés dans la nature méticuleuse globale de ce protocole. Cependant, la pratique est un contributeur majeur au succès de cette expérience.
Pour commencer, terminez la dilution de l’échantillon en ajoutant du virus aux cellules en une seule séance de laboratoire. Diluer en série chaque échantillon de virus plaquer dans le PBS. Utilisez généralement des dilutions 10 fois pour un suivi plus précis.
Conservez toutes les dilutions virales sur la glace jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à ajouter ces échantillons de virus dilués aux cellules. Retirer le milieu de culture cellulaire d’un ou deux puits à l’aide d’une pipette. Ajouter soigneusement l’échantillon de virus dilué goutte à goutte à chaque monocouche de cellules goutte à goutte à travers le côté de chaque puits.
Répétez le processus pour un ou deux puits jusqu’à ce que toute la plaque soit remplie avec les échantillons de virus en cours de plaque. Bercez doucement toute la plaque à la main. Ensuite, incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant une heure pour permettre l’adsorption du virus.
Toutes les 10 minutes, retirez la plaque de l’incubateur, secouez-la doucement à nouveau pour propager le virus plus uniformément dans chaque puits, puis replacez-la dans l’incubateur. Pour réduire la possibilité de compter par inadvertance l’inoculum non absorbé, retirez l’échantillon de virus des puits à l’aide d’une pointe de pipette de 1000 microlitres et jetez l’échantillon dans un bécher à déchets. Placez 2,5 millilitres d’une superposition de méthylcellulose sur la plaque et replacez-la dans l’incubateur.
Désinfectez le bécher à déchets, généralement avec l’ajout d’eau de Javel, d’un iodophore ou d’un virucide similaire, avant de le retirer de l’armoire de biosécurité. Après l’incubation de deux jours, retirez la superposition de méthylcellulose d’un ou deux puits à la fois à l’aide d’une pipette et placez-la dans un bécher à déchets. Ajouter environ deux millilitres de violet cristallin à 1 % dans de l’éthanol à 50 % à chaque puits.
Incuber la plaque avec tous les puits remplis de la tache pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. À ce stade, désinfectez le bécher à déchets comme démontré précédemment. Lavez vigoureusement les assiettes à l’eau du robinet jusqu’à ce que le ruissellement soit clair.
Assurez-vous qu’il y a environ 10 fois plus de différences dans le nombre de plaques dans chaque série de dilution. La figure illustre une diminution de 10 fois du nombre de plaques où le nombre dénombrable de plaques se situait entre 10 et moins quatre pour les trois répétitions. Les trois premières images de la figure représentent des plaques dans la dilution 10 à moins trois.
Cependant, la rangée du bas montre les résultats lorsqu’un test de plaque n’est pas bien effectué. Il y a très peu de plaques visibles à partir d’une dilution dans les zones visibles autour du sommet où les cellules Vero se sont entièrement soulevées du substrat. De même, cette figure montre des problèmes de dessèchement ou de mauvaise manipulation des cellules pendant le dosage de la plaque.
Cependant, cette figure montre de manière critique un mauvais ensemencement des cellules Vero. Chaque puits montre des taches violettes plus foncées, indiquant que les cellules ne sont pas bien réparties dans le puits et empilées les unes sur les autres en grappes. Pour de meilleurs résultats, assurez-vous que le virus se propage uniformément dans la plaque pour éviter les plaques agglomérées Les tests de plaque sont plus efficaces que d’autres méthodes quantitatives car ils ne comptent que les virus vivants.
De cette façon, une véritable efficacité antivirale peut être établie. De plus, cette technique nous a permis de quantifier la présence virale sur les fomites et d’explorer l’efficacité de l’administration de médicaments à partir de nouveaux dispositifs médicaux dans notre secteur de la recherche sur le virus de l’herpès.
