Name: tmt sample preparation for proteomics facility submission and subsequent data analysis
Uploaded: 2020-06-08T14:00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis at JoVE.com

Vorremmo riconoscere la struttura proteomica UF-ICBR per la loro elaborazione dei nostri campioni. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dai National Institutes of Health R01 HL136759-01A1 (CAP).

Il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università della Florida ha approvato tutti gli studi sugli animali.
1. Preparazione dei reagenti
<ol><li>Preparare chaPS Lysis Buffer (150 mM KCl, 50 mM HEPES pH - 7,4, 0,1% CHAPS e 1 compressa da cocktail dell'inibitore della proteasi per 50 mL di buffer). Il tampone senza inibitori della proteasi può essere conservato a 4 gradi centigradi per un massimo di 6 mesi o tamponare con l'inibitore della proteasi immagazzinato a -20 gradi centigradi fino a 1 anno.</li>
	<li>Preparare 100 mM di bicarbonato di trietilenio (TEAB): Aggiungere 500 -L di 1 M TEAB a 4,5 mL di acqua ultrapura.</li>
	<li>Preparare 200 mM di tris (2 carboxyethyl) di cloridrato fosfina (TCEP): aggiungere 70 -L di 0,5 M TCEP, un reagente denaturante, a 70 -L di acqua ultrapura. Quindi aggiungere 35 l del TEAB di 1 M.</li>
	<li>Preparare il 5% di idrossilamina: Aggiungere 50 -L del 50% di idrossilamina a 450 - L di 100 mM di TEAB.</li>
</ol>2. Estrazione di proteine
<ol><li>Isolare il muscolo quadricipite da un topo eutanasia secondo un protocollo approvato IACUC. Congelare e mantenere a -80 gradi centigradi o continuare con il protocollo per l'uso immediato.</li>
	<li>Tagliare per isolare circa 10 mg di tessuto murino quadricipiti freschi o congelati. Separare le fibre utilizzando una pinzetta quando si lavora con il muscolo scheletrico. In alternativa, se si lavora con le impostazioni cultura delle cellule, si sospendono le celle da 3 x 106 celle in 300 - L di buffer di lissi di CHAPS e andare al passaggio 2.4.</li>
	<li>Omogeneizzare il tessuto utilizzando un disgregatore di perline utilizzando tubi da 2 mL riempiti con circa 200 - L di 1 mm perline di zirconia/silice e 500 L di tampone di lisi CHAPS. Scalare verso l'alto o verso il basso a seconda dei casi (ad esempio, 5 mg di tessuto in 250 luna di tampone di lisitis CHAPS).</li>
	<li>Eseguire la sonicazione (10x per 10 s ciascuno con 50% di ampiezza e intervalli di 30 s sul ghiaccio) per rilasciare proteine legate al DNA. Gli stessi risultati di degradazione del DNA possono essere ottenuti sia con la lisi di siringa passando il lisato 10x attraverso un ago 21 G attaccato a una siringa da 1 mL, sia con l'incubazione di benzonase (44 U/mL) a 37 gradi centigradi per 30 min.</li>
	<li>Centrifugare il lisato a 16.000 g per 10 min a 4 gradi centigradi e trasferire il sovrentrato in un nuovo tubo di centrifuga.</li>
</ol>3. Misurazione delle proteine
<ol><li>Determinare la concentrazione proteica del supernatante utilizzando protocolli prestabiliti (vedere Tabella dei materiali). NOTA: È meglio usare campioni a 2 og/L, ma possono essere utilizzati anche campioni meno concentrati. Se si utilizza un campione meno concentrato, sarà necessario regolare in modo appropriato i volumi dei reagenti di riduzione/alchilatura al punto 5.1.</li>
	<li>Preparare una diluizione di curva standard BSA utilizzando il buffer di lisi è CHAPS.</li>
	<li>Seguire le istruzioni del produttore e, dopo 15 min, leggere l'assorbimento a 750 nm.</li>
</ol>4. Riduzione/trattamento del reagente
<ol><li>Trasferire 200 g di proteine per condizione in un nuovo tubo di centrifuga e regolare ad un volume finale di 100 l utilizzando il buffer di lisi CHAPS. È possibile scalare fino a 200 anni quando la concentrazione proteica è troppo bassa, ma non dimenticare di regolare adeguatamente il volume del reagente di riduzione/alchilatura.</li>
	<li>Aggiungete 5 l dei 200 m TCEP e incubate i campioni a 55 gradi centigradi per 1 ora.</li>
	<li>Immediatamente prima dell'uso, preparare 375 mM di iodoacetamide sciogliendo un tubo di iodoacetamide (cioè 9 mg) in 132 . Proteggere questa soluzione dalla luce.</li>
	<li>Aggiungere al campione 5 ll di 375 mm di iodoacetamide e incubare per 30 min a temperatura ambiente (RT) protetti dalla luce.</li>
</ol>5. Precipitazioni metanolo/cloroformio20
<ol><li>Aggiungete 400 gradi di metanolo a ogni 100 litri di proteine e di campioni di vortice brevemente.</li>
	<li>Centrifuga a 9.000 x g per 10 s a RT. Questo per incorporare liquidi depositati sui lati del tubo campione.</li>
	<li>Aggiungere 100 l di cloroformio alla miscela e vagliare brevemente. Utilizzare 200 l di cloroformio se il campione ha un'alta concentrazione di fosforidi.</li>
	<li>Centrifuga a 9.000 x g per 10 s a RT. Questo per incorporare liquidi depositati sui lati del tubo campione.</li>
	<li>Aggiungere vigorosamente 300 l di acqua e vortice. È importante ottenere una soluzione omogenea.</li>
	<li>Centrifuga a 9.000 x g per 1 min a RT. Essere estremamente attenti a evitare di disturbare gli strati durante il trasferimento del tubo in un rack. NOTA: Il tubo dovrebbe ora contenere tre fasi: 1) Strato superiore (cioè supernatante), una miscela di acqua e metanolo; 2) Strato intermedio (cioè interfase), proteina precipitata bianca; e 3) Strato inferiore (cioè fase inferiore), cloroformio.</li>
	<li>Rimuovere con attenzione il super-natante.</li>
	<li>Aggiungere 300 l di metanolo alla restante fase interfase e bottom. Vortice vigorosamente.</li>
	<li>Centrifuga a 9.000 x g per 2 min a RT. Essere estremamente attenti a evitare di disturbare gli strati durante il trasferimento del tubo in un rack.</li>
	<li>Rimuovere con attenzione il super-natante.</li>
	<li>Aspirare delicatamente il più liquido possibile sotto un flusso d'aria (ad esempio, utilizzando un concentratore a vuoto) a RT fino a quando il pellet è solo un po 'umido (10 min). Poiché il tempo necessario può essere diverso per ogni campione, controllare ogni 2 min per valutare. Conservare il pellet a -80 gradi centigradi fino a un'ulteriore lavorazione.</li>
</ol>6. Digestione delle proteine
<ol><li>Risospendere il pellet proteico precipitato in 100 : L di tampone di lisi TEAB. NOTA: È facoltativo misurare la concentrazione proteica in questa fase.</li>
	<li>Immediatamente prima dell'uso, preparate 1 plusio ln aggiungendo 100 l-L della soluzione di stoccaggio della trypsin (50 mM di acido acetico) sul fondo della fiala di vetro di 100 g e incubate per 5 minuti a RT. Memorizzare rimanendo reagente in dosi monouso a -80 gradi centigradi.</li>
	<li>Aggiungete 2,5 litri di pofina per 100 g di proteine. Digerire il campione durante la notte a 37 gradi centigradi. Questo passaggio è fondamentale per la completa solubilità della proteina; queste condizioni. Dopo la digestione, è facoltativo misurare la concentrazione proteica utilizzando saggi proteici standard.</li>
</ol>7. Etichettatura dei peptidi
<ol><li>Immediatamente prima dell'uso, a crollare i reagenti del kit di etichette TMT a RT.</li>
	<li>Sciogliere ciascuna delle fiale tag TMT da 0,8 mg attraverso l'aggiunta di 41 litri di acetonitrile anidrido ad ogni tubo. Incubare il reagente per 5 min a RT con vortice occasionale. Centrifugare brevemente i tubi. NOTA: una concentrazione di 0,8 mg di tag TMT è di solito sufficiente per etichettare due set. Altri ricercatori, tuttavia, hanno dimostrato che questa concentrazione può essere ulteriormente ridotta e ancora produrre dati affidabili15.</li>
	<li>Aggiungere con cura 41 gradi di reagente per l'etichetta TMT a ogni campione da 100.</li>
	<li>Incubare la reazione per 1 h a RT.</li>
	<li>Aggiungere al campione 8 ll del 5% di idrossilamina e incubare per 15 min per placare la reazione.</li>
	<li>Dividere i campioni in quantità uguali in un nuovo tubo di centrifuga e conservarli a -80 gradi centigradi. NOTA: In questa fase i campioni sono stabili e possono essere inviati per la spettroscopia di massa. È facoltativo misurare la concentrazione a questo punto utilizzando saggi proteici standard.</li>
</ol>8. Spettroscopia di massa
<ol><li>Inviare i campioni a una struttura proteomica (questo studio ha usato la struttura UF ICBR Proteomics Core), dove tutti i campioni sono combinati e purificati utilizzando colonne di spin C18. NOTA: Discutere con la funzione principale come inviare i campioni prima di prepararli per confermare i passaggi esatti che preferiscono per gli invii.</li>
	<li>Richiedere le seguenti procedure per ogni campione multiplex combinato: estrazione di fase solida, HPLC (SCX, SE), punta zip e LC-MS/MS (2 h gradiente per ID proteina, if >10QE Plus).</li>
	<li>Una volta raccolti i dati, la struttura principale elaborerà i file RAW utilizzando il software fornito dal fornitore per l'identificazione delle proteine.</li>
</ol>9. Analisi dei dati
<ol><li>I dati vengono in genere recapitati dal core all'utente nel formato 7z, che può richiedere circa 16 GB di spazio su disco per ogni set di dati (in questo caso 11 esempi). Per l'elaborazione dei dati, assicurarsi che sia disponibile un computer di almeno 3,4 GHz.</li>
	<li>Estrarre i file utilizzando Il file Manager zip 7. Questi file estratti contengono dati RAW, file in formato pdStudy e file di formato pdResultView. Salvare tutti i file per ulteriori analisi.</li>
	<li>Aprire il file utilizzando proteome Discovery 2.2 Software. NOTA: il formato del file è "Nome file.pdStudy". Se viene aperto "Nome file.pdResultView", non è possibile selezionare l'esempio di controllo.</li>
	<li>Selezionare i campioni di controllo nel pannello "Campioni".</li>
	<li>Apri Risultato selezionando ID nel pannello "Risultati analisi".</li>
	<li>Esporta in un software per fogli di calcolo.</li>
	<li>Salvare i dati grezzi (tutte le proteine identificate).</li>
	<li>Aprire il file del foglio di calcolo. Questo conterrà tutte le proteine che sono state identificate.</li>
	<li>Nel file software del foglio di calcolo utilizzare la funzione "Filter" per lo screening "Protein FDR Confidence: Combined" in high (colonna B), " #UniquePeptides" superiore a 2 (colonna K),e uno dei valori "Abundance Ratio" vuoto esclusivamente ( colonnaS fino a W).</li>
	<li>Inserire una colonna per il calcolo "p-value" con la funzione TEST.</li>
	<li>Inserire una colonna per "Significato statistico" con la funzione IF(valore-p<0,05, "Significativo","NS")</li>
	<li>Utilizzare la funzione "Filter" per vagliare "Significato statistico" che mostri "Significato". Il risultato mostra le proteine analizzate con la rilevanza statistica nel gruppo di controllo e nel gruppo sperimentale.</li>
	<li>Determinare l'abbondanza significativamente più alta o più bassa dell'espressione proteica nel gruppo sperimentale rispetto al gruppo di controllo, inserire una colonna per "Regolazione" con la funzione IF(MEDIA(gruppodi controllo)>MEDIA(gruppo sperimentale),"Upregulated","Downregulated")</li>
</ol>10. Metodi per valutare hit significativi
<ol><li>Per identificare le interazioni proteina-proteina tra i risultati significativi identificati negli studi TMT, utilizzare Search Tool per il recupero di raggi e proteine interagenti (STRING) versione 11.021: <a href="https://string-db.org/" target="_blank">https://string-db.org/</a>
</li>
	<li>Per classificare in base a gruppi (ad esempio, funzione molecolare, processi biologici e classi proteiche) utilizzare l'analisi delle proteine attraverso il software di classificazione dell'ontologia PANTHER (Manthefica)22: <a href="http://www.pantherdb.org/" target="_blank">http://www.pantherdb.org/</a>
</li>
	<li>Per identificare le interazioni proteiche in una varietà di percorsi, utilizzare il software di analisi del percorso23.</li>
</ol>11. Caricamento dei dati proteomici su una banca di repository
<ol><li>Per inviare i dati proteomici al Proteomics IDEntificantions Database (PRIDE) o Mass Spectrometry Interactive Virtual Environment (MassIVE) includere le seguenti informazioni: i file delle liste di picco (file di spettro di massa elaborati in un formato standard come mzXML, mzML, o MGF), file dei risultati (identificazioni dello spettro in un formato standard come mzIdentML o mzTab) e file a spettro grezzo (file di spettro di massa grezzo in un formato non standard o specifico dello strumento, ad esempio . RAW o . WIFF).</li>
	<li>Per inviare, creare un account e includere informazioni quali affiliazione e dettagli del progetto. Quindi, selezionare i file elencati nel passaggio 11.1 e caricarli.</li>
	<li>Per creare un set di dati ufficiale, eseguire un flusso di lavoro di invio su questi file caricati. NOTA: dopo l'invio, il set di dati sarà privato nella banca del repository. Con l'opzione privata, i dati sono disponibili solo per gli utenti autorizzati. Sono disponibili due opzioni aggiuntive: 1) Set di dati condiviso, che consente di accedere ai revisori del journal e ai collaboratori; o 2) Set di dati pubblico, che verrà visualizzato nelle ricerche di set di dati pubblici. Un'altra caratteristica importante di questi repository è la possibilità di aggiornare i dati caricati e associare le pubblicazioni successive al set di dati esistente.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Graves, P. R., Haystead, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biologist's+guide+to+proteomics.">Molecular biologist's guide to proteomics.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 66 (1), 39-63 (2002).</li><li>Erdjument-Bromage, H., Huang, F. K., Neubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+for+Relative+Quantitation+of+Proteins+Using+Tandem+Mass+Tags+(TMT)+and+Mass+Spectrometry+(MS).">Sample Preparation for Relative Quantitation of Proteins Using Tandem Mass Tags (TMT) and Mass Spectrometry (MS).</a> Methods in Molecular Biology. 1741, 135-149 (2018).</li><li>O'Farrell, P. 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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Per preparare con successo i campioni per l'analisi proteomica utilizzando metodologie di etichettatura isotope stabile basata su TMT, è fondamentale eseguire estrazioni proteiche con molta attenzione a 4 gradi centigradi e utilizzare un buffer di lisi che contiene un cocktail inibitore della proteasi24,25. Il cocktail inibitore della proteasi è un reagente cruciale per evitare una degradazione inaspettata delle proteine durante la digestione delle proteine. Una differenza fondamentale tra il nostro protocollo e quello attuale fornito dal fornitore è che consigliamo vivamente l'uso del buffer di lisi CHAPS in base alla nostra esperienza con le cellule e i tessuti dei mammiferi. Suggeriamo anche di utilizzare un approccio di precipitazione della proteina metanolo/cloroformio sia per pellet cellulari che per tessuti.
Idealmente, l'estrazione delle proteine, la misurazione, la riduzione/alchilante dei trattamenti di reagenti e le precipitazioni di metanolo/cloroformio vengono tutte eseguite nello stesso giorno. Seguendo questa raccomandazione si tradurrà in concentrazioni proteiche più accurate per la successiva etichettatura. La fase di precipitazione delle proteine è importante per la rimozione di reagenti che interferiranno con la spettrometria di massa tandem. L'inclusione della fase di precipitazione migliora significativamente la risoluzione di TMT26. In sintesi, i principali vantaggi del nostro protocollo TMT sono l'elevata efficienza di etichettatura per diversi tipi di campioni, la sua riproducibilità e i dati affidabili acquisiti.
Poiché la natura multiplex di questa strategia proteomica non mirata TMT continua ad espandersi, migliorerà progressivamente la capacità dei ricercatori in un'ampia varietà di campi di fare nuove scoperte. In particolare nel campo biomedico, noi e altri abbiamo trovato questa tecnologia sempre più informativa negli studi che esplorano nuovi meccanismi di azione nella malattia e impatti relativi di varie terapie. Per tutti questi motivi, questa potente tecnologia integra il repertorio di altri approcci OMICS utilizzati nei moderni studi di ricerca e fornisce informazioni chiave che possono guidare l'ulteriore sviluppo terapeutico.

Il termine "proteomica" è stato inizialmente definito come la caratterizzazione su larga scala dell'intero complemento proteico di una cellula, tessuto o organismo1. Le analisi proteomiche consentono di sforare meccanismi e processi cellulari coinvolti nello sviluppo della malattia, percorsi terapeutici e sistemi sani utilizzando tecniche per eseguire la quantificazione relativa dei livelli di espressione proteica2. Le descrizioni iniziali di tali studi sono state pubblicate nel 1975 e hanno dimostrato l'uso dell'elettroforesi bidimensionale di gel di poliacrilammide (2D-PAGE) a questo scopo1,3. Il metodo 2D separa le proteine in base alla carica (messa a fuoco isoelettrica, IEF) e alla massa molecolare (elettroforesi del gel di solfato di sodio dodecyl, o SDS-PAGE)4. Per anni, la combinazione di 2D-PAGE e la successiva spettrometria di massa tandem eseguita su ogni componente del gel è stata la più comune tecnica di analisi dell'espressione proteica non mirata eseguita e identificata da numerosi profili di espressione proteica precedentemente sconosciuti5,6. Gli svantaggi generali dell'approccio 2D-PAGE sono che richiede molto tempo, non funziona bene per le proteine idrofobiche e ci sono limitazioni nel numero totale di proteine valutate a causa della bassa sensibilità7,8.
L'etichettatura isotopo stabile per aminoacidi nella coltura cellulare (SILAC) è diventato il prossimo approccio popolare per identificare e quantificare l'abbondanza di proteine nei campioni9. Consiste nell'etichettatura metabolica delle cellule che vengono incubate in media prive di un amminoacido essenziale standard e completate con una versione con etichetta isotopo di quello specifico aminoacido10. Il vantaggio di questa tecnica è la sua efficienza e l'etichettatura precisa9. La principale limitazione all'approccio SILAC è principalmente la riduzione del tasso di crescita cellulare causata dall'incorporazione dell'etichetta isotopa, che può essere particolarmente difficile nelle linee cellulari relativamente sensibili che modellano le malattie umane11.
Nel 2003, nel campo12è stata introdotta una nuova e robusta tecnica proteomica che coinvolge etichette isobariche in tandem (TMT). L'etichettatura TMT è un metodo potente grazie alla sua maggiore sensibilità per rilevare i livelli di espressione relativa delle proteine e le modifiche post-traduzionali13. A partire da questa data di pubblicazione, sono stati sviluppati kit TMT in grado di etichettare simultaneamente 6, 10, 11 o 16 campioni. Di conseguenza, è possibile misurare l'abbondanza di peptidi in più condizioni con repliche biologiche allo stesso tempo14,15,16. Recentemente abbiamo usato TMT per caratterizzare il profilo proteomico cardiaco di un modello murino della sindrome di Barth (BTHS)17. In questo modo, siamo stati in grado di dimostrare un diffuso miglioramento nei profili cardiaci dei topi BTHS trattati con la terapia genica e identificare nuove proteine colpite da BTHS che hanno rivelato nuovi percorsi terapeutici coinvolti nelle cardiomiopatie.
Qui, descriviamo un metodo dettagliato per eseguire analisi proteomiche quantitative TMT multiplex utilizzando campioni di tessuto o pellet cellulari. Può essere utile eseguire la preparazione e l'etichettatura del campione prima della presentazione a un nucleo perché i peptidi di tipo tryptic etichettati sono più stabili dei campioni congelati crudi, non tutti i nuclei hanno esperienza nella gestione di tutti i tipi di campioni e la preparazione di campioni in laboratorio può risparmiare tempo per i nuclei, che spesso hanno lunghi arretrati. Per una descrizione dettagliata della parte di spettroscopia di massa di questo processo si veda Kirshenbaum et al. e Perumal et al.18,19.
Il protocollo di preparazione di esempio prevede i seguenti passaggi principali: estrazione, quantificazione, precipitazioni, digestione ed etichettatura. I principali vantaggi di questo protocollo ottimizzato sono la riduzione dei costi di etichettatura, il miglioramento dell'estrazione delle proteine e la generazione coerente di dati di alta qualità. Inoltre, descriviamo come analizzare i dati TMT per vagliare migliaia di proteine in un breve lasso di tempo. Ci auguriamo che questo protocollo incoraggi altri gruppi di ricerca a considerare l'integrazione di questa potente metodologia nei loro studi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 50 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>90114</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Hydroxylamine, 5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>90115</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td>Reagent for protein digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous acetonitrile, LC-MS Grade</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51101</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonaze nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td>DNA shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond-Breaker TCEP solution, 5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>77720</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA standard</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>23209</td>
			<td>Reagent for protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>28300</td>
			<td>Reagent for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1145-1</td>
			<td>Reagent for protein precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablet</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td>Reagent for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Protein Assay</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0116</td>
			<td>Reagent for protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft Office</td>
			<td></td>
			<td>Software for data analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>VWR analog</td>
			<td>12621-104</td>
			<td>Equipment for protein digestion incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RDD002</td>
			<td>Reagent for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>Reagent for protein precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>90058</td>
			<td>Reagent for protein digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46436</td>
			<td>Reagent for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma Plot 14.0</td>
			<td>Sigma Plot 14.0</td>
			<td></td>
			<td>Software for data analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB120</td>
			<td>DNA shearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra Max i3x Multi-Mode Detection Platform</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Plate reader for protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>23275</td>
			<td>Reagent for protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Pierce Quantitative Fluorescent Peptide Assay</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>23290</td>
			<td>Reagent for protein measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Proteome Discoverer Software</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>OPTON-30945</td>
			<td>Software for data analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT 10plex Isobaric Label Reagent Set 0.8 mg, sufficient reagents for one 10plex isobaric experiment</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>90110</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT11-131C Label Reagent 5 mg</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A34807</td>
			<td>Reagent for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC-MS Grade</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51140</td>
			<td>Reagent for protein extraction</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tmt sample preparation for proteomics facility submission and subsequent data analysis

Le tecnologie proteomiche sono potenti metodologie che possono aiutare la nostra comprensione dei meccanismi di azione nei sistemi biologici, fornendo una visione globale dell'impatto di una malattia, di un trattamento o di altre condizioni sul proteoma nel suo complesso. Questo rapporto fornisce un protocollo dettagliato per l'estrazione, la quantificazione, la precipitazione, la digestione, l'etichettatura e la successiva analisi dei dati dei campioni di proteine. Il nostro protocollo di etichettatura TMT ottimizzato richiede una minore concentrazione di etichette tag e consente di ottenere dati costantemente affidabili. Abbiamo usato questo protocollo per valutare i profili di espressione delle proteine in una varietà di tessuti murini (cioè cuore, muscolo scheletrico e cervello) così come le cellule coltivate in vitro. Inoltre, dimostriamo come valutare migliaia di proteine dal set di dati risultante.

Cellule sane e malate sono state lised nel buffer CHAPS, preparate come descritto nel nostro metodo di etichettatura TMT, e presentate al Centro interdisciplinare per la ricerca biotecnologica (UF-ICBR) Proteomica Core for Liquid Chromatography con spettrometria di massa tandem. In seguito all'acquisizione e alla consegna dei dati dal nucleo, il set di dati è stato aperto nel software fornito dal fornitore e sono stati applicati i seguenti filtri di taglio: peptidi unici da 2 dollari, ioni di reporter per ogni campione di proteine presenti in tutti i canali e includono solo proteine significativamente modificate (p - 0,05). La tabella 1 riassume i dati: 39.653 peptidi totali, di cui 7.211 hanno peptidi uguali o superiori a due peptidi unici, e 3.829 includono ioni reporter per tutti i canali. I valori di p per questi 3.829 peptidi sono stati calcolati dal test di non test di Student e p 0,05 è stato considerato significativo. Inoltre, è stato utilizzato un taglio a cambi di piegatura per determinare la distribuzione relativa delle proteine da malattie rispetto a cellule sane: downregulated (blu) o upregulated (rosso) (Figura 1).
L'elenco dell'espressione proteica significativamente disregolata è stato valutato utilizzando il sistema di classificazione ontologia PANTHER e le analisi STRING. Le analisi panther hanno mostrato un elenco categorizzato di proteine basato su un'abbondanza significativamente inferiore (Figura 2A) o una maggiore abbondanza nelle cellule malate in base alla funzione molecolare (Figura 2B). Le analisi delle stringhe di proteine con un'abbondanza significativamente inferiore (Figura 2C) e superiore (Figura 2D) hanno identificato interazioni multiple e forti associazioni tra proteine.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60970/60970fig1.jpg"> Figura 1: Terreno vulcanico che mostra proteine la cui abbondanza non è stata significativamente alterata (nero), significativamente abbassata (blu) o significativamente aumentata (rosso) nelle cellule di controllo malate e sane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60970/60970fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60970/60970fig2.jpg"> Figura 2: Valutazioni rappresentative dei risultati significativamente sregolati identificati da PANTHER (A, B) e String (C, D) di proteine di abbondanza significativamente più basse o superiori. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60970/60970fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Peptidi totali</td>
			<td>Totale identificato</td>
			<td>2 peptidi unici</td>
			<td>Proteine quantificate</td>
			<td colspan="2">Proteine significativamente modificate</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Basso</td>
			<td>alto</td>
		</tr>
<tr>
<td>39653</td>
			<td>7211</td>
			<td>4457</td>
			<td>3829</td>
			<td>296</td>
			<td>108</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Tabella rappresentativa delle proteine quantificate per analisi del set di dati.

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TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Presentiamo un protocollo di etichettatura ottimizzato per tag di massa tandem (TMT) che include informazioni dettagliate per ciascuno dei seguenti passaggi: estrazione delle proteine, quantificazione, precipitazioni, digestione, etichettatura, presentazione a un impianto proteomico e analisi dei dati.

Preparazione del campione TMT per l'invio di strutture proteomiche e la successiva analisi dei dati

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

I principali vantaggi di questo protocollo sono che riduce i costi di etichettatura, migliora l'estrazione delle proteine e genera dati di alta qualità. I principali vantaggi del nostro protocollo sono l'elevata efficienza di etichettatura per i diversi tipi di campioni, la sua riproducibilità e l'acquisizione affidabile dei dati. Dopo aver isolato i campioni di tessuto muscolare del quadricipite da un topo eutanasiato secondo un protocollo approvato dalla IACUC, pesare 10 milligrammi di tessuto muscolare e utilizzare una pinzetta per separare le fibre muscolari.Per creare un lisato, trasferire il campione di tessuto separato in un tubo a due millilitri contenente 200 microlitri di perline di silice di zirconia millimetrica e 500 microlitri di tampone di lisi CHAPS. Posizionare i campioni in un disgregatore perline ed eseguire due esecuzioni sequenziali di 45 secondi. Dopo il secondo ciclo, per rilasciare la proteina legata al DNA, sonicare il campione 10 volte per 10 secondi per sonicazione ad un'ampiezza del 50% con intervalli di 30 secondi sul ghiaccio.Dopo l'ultima sonicazione, centrifugare il lysate e trasferire il supernatante in un nuovo tubo di centrifuga. Per il trattamento reagente riducente/alchilante, trasferire 200 microgrammi di proteine per condizione in nuovi tubi di centrifuga e utilizzare un tampone di lisi CHAPS fresco per portare il volume finale in ogni tubo fino a 100 microlitri. Successivamente, aggiungere cinque microlitri di TCEP a ciascun tubo e incubare i campioni a 55 gradi Celsius per un'ora.Al termine dell'incubazione, sciogliere nove milligrammi di iodoacetamide in 132 microlitri di TEAB da 100 millimolare e proteggere dalla luce la risultante soluzione di iodoacetamide da 375 millimolare. Quindi aggiungere cinque microlitri di iodoacetamide a ciascun campione e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente protetti dalla luce. Per la precipitazione metanolo/cloroformio, aggiungere 400 microlitri di metanolo a ciascuno 100 microlitri di proteine e vortice brevemente i campioni.Per incorporare i liquidi depositati ai lati dei tubi campione, centrifugare brevemente i campioni e aggiungere 100 microlitri di cloroformio a ciascun tubo. Dopo un breve vortice, centrifugare rapidamente di nuovo i tubi per raccogliere il liquido ai lati dei tubi e aggiungere 300 microlitri d'acqua ai campioni. Vortice vigorosamente per ottenere soluzioni omogenee e centrifugare i campioni per un minuto nelle stesse condizioni di centrifuga.Alla fine della centrifuga, trasferire accuratamente i tubi su un rack senza disturbare gli strati e rimuovere con cura il supernatante. Aggiungere 300 microlitri di metanolo alle restanti fasi inter e inferiori e vortice di nuovo vigorosamente i campioni. Centrifugare i campioni per due minuti e aspirare con cura i supernatanti.Quindi aspirare delicatamente più liquido possibile da ogni campione sotto un flusso d'aria fino a quando i pellet sono solo un po 'umidi. Valutare l'idratazione ogni due minuti per circa 10 minuti. Se necessario, i pellet possono essere conservati a meno 80 gradi Celsius fino a un'ulteriore lavorazione.Per digerire la proteina, rimescolare il pellet precipitato in 100 microlitri del tampone di lysis TEAB e aggiungere 100 microlitri di soluzione di stoccaggio della tripside sul fondo di una fiala di vetro di tripside da 100 microgrammi. Dopo cinque minuti a temperatura ambiente, aggiungere 2,5 microlitri della soluzione di tripina appena preparata per 100 microgrammi di proteine a ciascun campione e incubare i campioni a 37 gradi Celsius durante la notte. Per l'etichettatura peptidica, sciogliere ogni flaconcino a tag TMT da 0,8 milligrammi con 41 microlitridi di acetonitrile anidro per etichetta e incubare i reagenti per cinque minuti a temperatura ambiente con vortici occasionali mantenendo le etichette protette dalla luce.Al termine dell'incubazione, centrifugare brevemente le fiale e aggiungere con cura 41 microlitri di reagente per etichette TMT a ciascun campione di 100 microlitri per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, dissetare le reazioni con l'aggiunta di otto microlitri del 5% di idrossilammina per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi dividere i campioni in aliquote uguali in nuovi tubi di centrifuga per lo stoccaggio a meno 80 gradi Celsius.In questa acquisizione rappresentativa dei dati, sono stati analizzati 39.653 peptidi totali, di cui 4.457 avevano peptidi uguali o superiori a due peptidi unici e 3.829 includevano ioni reporter per tutti i canali. Un taglio del cambiamento di piega è stato utilizzato per determinare la distribuzione relativa delle proteine da malattie rispetto alle cellule sane con 296 proteine di abbondanza significativamente inferiore e 108 proteine di abbondanza significativamente più elevata osservate. L'analisi PANTHER ha mostrato una lista categorizzata di proteine basate su un'abbondanza significativamente inferiore o più elevata di cellule mascellate in base alla loro funzione molecolare.L'analisi delle stringhe delle proteine di abbondanza significativamente inferiore o superiore identificò ulteriormente molteplici interazioni e forti associazioni tra proteine. Ulteriori metodi possono essere eseguiti per identificare le interazioni proteina-proteina, per classificare le interazioni per gruppi e per identificare le interazioni in una varietà di percorsi. Le tecniche di proteomica sono potenti strumenti all'interno dei campi di ricerca biomedica per comprendere i meccanismi di sviluppo delle malattie fornendo informazioni dettagliate sull'abbondanza delle proteine.

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