Misurazioni quantitative accurate delle proteine sono fondamentali per comprendere la cooperazione dinamica e spaziale tra le proteine per comprendere la malattia fino alla biologia. L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di fornire un flusso di lavoro quantitativo integrato di proteomica per campioni di tessuto, combinando il profilo proteico senza etichetta e basato su etichette per la scoperta di biomarcatori. In questo studio, abbiamo utilizzato lo strumento Orbitrap Fusion per quantificare le proteine utilizzando approcci basati su etichette e senza etichette.
La lisi tissutale è uno dei passaggi più cruciali per il successo di un esperimento LC-MS-MS. Prendi 30 mg di tessuto in un tubo che batte le perle. Dopo il lavaggio con il PBS, aggiungere 300 microlitri di tampone di lisi dell'urea contenente otto urea molare, Tris, NaCl e MgCl2.
Utilizzando un sonicatore a sonda, lisi il contenuto del tessuto. Ripeti questa operazione per un altro ciclo. Se si osserva un tessuto intatto sul fondo del tubo, aggiungere perle di zirconio al tubo e omogeneizzare il tessuto usando un battitore di perle per 90 secondi, con cinque minuti di incubazione sul ghiaccio.
Centrifugare i campioni intorno a 6000 G per 15 minuti a quattro gradi Celsius per separare i detriti cellulari dal surnatante. Raccogliere il surnatante in un tubo fresco e mescolare uniformemente la soluzione. Quantificare la concentrazione proteica nel llisito tissutale utilizzando il reagente di Bradford.
Per questo, misurare l'OD del campione a 595 nanometri ed estrapolarlo utilizzando un grafico standard come mostrato in questa schermata. Dopo la quantificazione delle proteine, eseguire 10 microgrammi di llisi tissutale su gel SDS-PAGE al 12% per verificare la qualità dei lasati. Il primo passo nella digestione in soluzione comporta la riduzione dei legami disolfuro, utilizzando TCEP.
Dopo l'aggiunta di TCEP, incubare il contenuto del tubo per un'ora a 37 gradi Celsius. Il passo successivo prevede l'alchilazione per impedire la ricomatura dei legami disolfuro ridotti. Aggiungere un agente alchilante come la iodoacetammide e incubare il tubo al buio per 10 minuti.
Dopo l'incubazione, abbassare la concentrazione finale di urea a meno di un molare diluendo con quattro-otto volumi di tampone di diluizione. A questo punto, è consigliabile controllare il pH. Il passo successivo prevede l'aggiunta di tripsina al tubo e l'incubazione del tubo durante la notte per una digestione efficiente.
Il giorno successivo, asciugare i peptidi digeriti in un concentratore di vuoto e procedere alla fase di dissamatrice. Per eseguire la dissalo dei peptidi, utilizzare le punte dello stadio C18. Attivare la punta dello stadio C18 aggiungendo 50 microlitro di metanolo, centrifugare la punta a 1000 G per due minuti.
Ora, aggiungere 50 microlitro di acetonitrile in acido formico allo 0,1% per lavare la punta del palco e, di nuovo, centrifugare la punta. Ricostituire i peptidi digeriti essiccati in 50 microlitri di acido formico allo 0,1%. Aggiungere i peptidi ricostituiti nella punta dello stadio attivato.
Ripetere questo passaggio almeno quattro volte. Per lavare il campione, aggiungere 50 microlitro di acido formico allo 0,1% e ripetere la fase di centrifugazione. Per l'eluizione dei peptidi, aggiungere 50 microlitri di 40% ACN in acido formico allo 0,1% e passarlo attraverso la punta dello stadio mediante centrifugazione.
Ripetere questo passaggio con 50% e 60% ACN in acido formico 0,1% e raccogliere il filtrato in un tubo fresco. Asciugare i peptidi dissalettati usando un concentratore a vuoto. Prima dell'esecuzione di LC-MS-MS, quantificare i peptidi utilizzando il metodo Scopes.
Per questo, caricare due microlitri di campione ricostituito nel pozzettilo di una piastra microgocce e misurare l'assorbanza a 205 nanometri e 280 nanometri. Calcola la concentrazione dalla formula descritta in questa diapositiva. Una volta che i peptidi dissali sono essiccati, sono pronti per la quantificazione basata sull'etichetta.
Per l'etichettatura iTRAQ, i peptidi essiccati devono essere ricostituiti in 20 microlitri di tampone di dissoluzione, forniti nel kit di etichettatura iTRAQ. Ricostituire le etichette aggiungendo etanolo dal flaconcino fornito nel kit e mescolare accuratamente. Si consiglia di eseguire tutti i passaggi secondo le istruzioni del produttore.
Aggiungere le etichette iTRAQ omogeneamente miscelate ai rispettivi tubi e consentire la reazione di etichettatura. Alla fine della reazione, spegnere qualsiasi etichetta non legata in eccesso nel tubo aggiungendo acqua di grado MS e incubare da mezz'ora a un'ora. Ora, trasferire tutto il contenuto etichettato in un singolo tubo e asciugare i peptidi etichettati.
Dopo aver ricostituito i campioni in acido formico allo 0,1%, aprire l'autocampionatore di NanoLC e posizionare i campioni all'interno dell'autocampionatore. Una volta che i campioni sono stati inseriti nell'autocampionatore, è importante impostare i giusti parametri per la cromatografia liquida e la spettrometria di massa. Qui, descriviamo i parametri sia per la quantificazione senza etichetta che per la quantificazione basata su iTRAQ utilizzando LC-MS.
In caso di quantificazione senza etichetta, è stato utilizzato un gradiente di 120 minuti come iniezione di un singolo campione non sezionato. Questa durata può essere aumentata o diminuita in base alla complessità del campione. In questo esperimento, è stato impostato un flusso di 300 nanolitri al minuto con il seguente gradiente per la soluzione B, che è l'80% di acetonitrile in acido formico all'1%, in questo caso.
Allo stesso modo, possiamo impostare un gradiente per un esperimento iTRAQ. Poiché i campioni non sono sottoposti a frazionati, è stato utilizzato un gradiente di 90 minuti. I parametri MS sia per la quantificazione senza etichetta, sia per la quantificazione basata sull'etichetta iTRAQ, possono essere visti qui.
Il primo passo prevede l'impostazione della modalità applicazione facendo clic sui parametri globali. Selezionare la modalità peptide e impostare la durata del metodo in base al gradiente LC utilizzato. Definire i parametri di scansione per l'esperimento.
Facendo clic sull'opzione MS-OT, i parametri diventano visibili. Il tipo di rilevatore in uso è impostato su Orbitrap. L'altra opzione disponibile su questo strumento include una trappola ioio.
La risoluzione è stata impostata su 60.000 e si può scegliere tra diverse opzioni disponibili, a seconda delle esigenze e del tipo di esperimento. L'intervallo di massa è normale e l'intervallo di scansione è impostato da 375 a 1700. Gli altri parametri sono predefiniti per MS Application.
La soglia di intensità è stata impostata e lo stato di carica impostato nell'intervallo da due a sei. L'esclusione dinamica è stata impostata su 40 secondi e la tolleranza di massa è stata mantenuta a 10. Il set successivo di parametri include i parametri MS-MS.
La modalità di isolamento è stata selezionata con quadrupolo, finestra di isolamento impostata a due, offset di isolamento è stato impostato su off e il tipo di attivazione è solitamente HCD per l'esperimento di proteomica. L'energia di collisione può essere riparata o può essere assistita. I campioni etichettati richiedono energie di collisione più elevate, quindi, per gli esperimenti iTRAQ, è consigliabile che l'energia di collisione sia impostata su 35, mentre per gli esperimenti LFQ può essere impostata su 30.
Il tipo di rivelatore utilizzato qui è Orbitrap. La modalità intervallo di scansione sarà automatica. Gli altri parametri sono predefiniti per gli esperimenti iTRAQ e l'esperimento quantitativo senza etichetta.
Cliccando sul riepilogo si otterrà una panoramica di tutti i parametri LC e MS utilizzati per l'esperimento. Puoi dare un'occhiata a ogni singolo parametro e fare la correzione di bozze. Una volta fatto, fai clic sul file e salvalo come file di metodo.
Una volta salvato, puoi eseguire il metodo e otterrai i file raw. E poi quei file raw possono essere analizzati utilizzando il software Proteome Discoverer. Questa figura mostra la copertura della sequenza di BSA in tre repliche tecniche, che è il 91% nelle tre repliche.
Questo indica la riproducibilità dello strumento. Ora, questa figura mostra l'uniformità nel numero di corrispondenze spettrali peptidiche, peptidi e proteine identificate in tre diversi campioni biologici, il che, ancora una volta, dà un'idea della riproducibilità dello strumento. Qui, il diagramma di Venn rappresenta le proteine comuni ed esclusive identificate in tre diversi campioni in esperimenti senza etichetta e esperimenti basati su etichette.
Questi grafici a barre mostrano il numero di corrispondenze spettrali peptidiche, gruppi peptidici, proteine totali, gruppi proteici e numero di proteine dopo l'1% FDR, identificati nell'esperimento LFQ e iTRAQ. La proteomica tissutale di campioni biologici ci consente di esplorare nuovi potenziali biomarcatori associati a diversi stadi di progressione della malattia. Il protocollo descritto per l'analisi proteomica quantitativa dei tessuti fornisce dati di buona copertura riproducibili.
L'uso di repliche tecniche garantisce una buona riproducibilità, anche se i campioni vengono eseguiti in momenti diversi. Qui, abbiamo mostrato l'analisi di campioni di tessuto utilizzando due metodi di quantificazione: proteomica senza etichetta e basata su etichette. La selezione delle tecniche proteomiche quantitative può dipendere dal numero di campioni, dalla disponibilità di piattaforme MS e dalla questione biologica da affrontare.
