チャールズ・ピノー、メラニー・ラガリグ、レジス・ラヴィーンの皆様に、植物サンプルのMALDIイメージングのサンプル調製に関するヒントやコツをお願いします。

1. サンプル準備
<ol><li>生物学的サンプルを入手し、それを新鮮でそのまま保つ(例えば、チューブに強制しないでください)か、それを凍結してください。提案されたプロトコルは、特定の組織の化合物を局所化するために、あらゆる種類の固体生物学的サンプル(すなわち、植物、動物、またはヒト組織)に適用される。</li>
	<li>クライオミクロトームを-20°Cに冷却します。 サンプルホルダーとブレードを同じ温度に保ちます。</li>
	<li>必要に応じて、オブジェクトを M1 埋め込みメディアに埋め込み、切断時に保持します。<ol>
<li>クライオミクロトームチャンバーに入れたプラスチック製の金型にマトリックスを注ぎます。迅速にサンプルを追加し、それをカバーするためにいくつかのより多くの埋め込み媒体を注ぎます。冷却中にマトリックスが固化するため、サンプルを金型の中央に維持します。 注:埋め込みは、すべての生物学的オブジェクトに必要ではありません。マウスの脳などの均質な物体は、埋め込み培地を必要とせず、凍結して切断することができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>埋め込みサンプルまたは冷凍サンプルをクライオミクロトームホルダーに置き、鋭利な刃で切ります。5~30μmの厚さは、異質性のために切断が困難な植物サンプルに適しています。切断の厚さと温度をサンプルに合わせ、最良の条件を見つけるためにいくつかのカットを行います。提供した例では、試料を−20°Cで切断した。 サンプルの劣化を避けるために、サンプルを0°C以下に保つことを検討してください。 注:クライオミクロトームの隣に置かれた双眼鏡顕微鏡を使用すると、スライスの品質を決定するのに役立ちます。組織はそのまま残る必要があります。</li>
	<li>慎重に鉗子または小さい絵筆を使用してITOコーティングされたスライドにスライスを移動し、その後、サンプルをウォームアップし、乾燥するためにスライドの下に指を置きます。すべてのサンプルが準備ができるまで、スライドをクライオミクロトームチャンバーに保管してください。熱ショックを避けるためにゆっくりとチャンバーからスライドを取り出します。 メモ:スライドのどちら側がITOコーティングされているかを確認するには、室温(RT)でスライドに水滴を置きます。ドロップは、ITOコーティングされた側に丸いままになるか、コーティングされていない側に平らになります。</li>
	<li>薄いマーカーペンまたは補正液を使用してスライド上にマークを描画し、マトリックスの堆積前に高解像度スキャナでスキャンします。このマークは、質量分析計内にあるサンプルのスライド上の正確な位置を決定するために使用されます。正確な基準点を得る最善の方法は、十字を描く方法です。</li>
</ol>2. マトリックス蒸着
<ol><li>MALDIマトリックスを準備する:70mgのαシアノ-4-ヒドロキシシンミン酸(HCCA)マトリックスを秤量し、0.2%TFAで水とメタノール溶液(50:50)の10 mLで希釈します。RTで10分間マトリックスを超音波処理します。超音波処理後に余分な固体マトリックスがあるかもしれません。 注: MALDI 行列の種類は、対象の検数に応じて使用できます。</li>
	<li>マトリックス蒸着ロボットを100%メタノールで洗浄します。</li>
	<li>メタノールと精密ワイプを使用して、スライドを清掃し、サンプルに触れることなく、マークを取り外すことなく、スライドを清掃します。サンプルのない領域のスライドの上にきれいなカバースリップを追加します。スライドのその部分は、マトリックスの堆積を追跡するために光学検出器の上に配置されます。 メモ:マトリックスの厚さを光学的に追跡するには、スライドとカバースリップが非常にきれいでなければなりません。</li>
	<li>マトリクス堆積のためにロボットを使用する:6 mLのマトリックス溶液を貯蔵所に入れ、2mLを100%メタノールを加えて、合計体積8mLを加える。 注:堆積に沿ったマトリックスの厚さの記録は自動で、USBスティックを使用して回復することができます。噴霧法の開発についてはここでは詳しく説明していません。</li>
</ol>3. データ取得
<ol><li>MALDIプレート上にマトリックスの1μLを置き、マトリックスピークを基準として質量分析計を較正します。質量分析計の取得方法の開発については、ここでは詳しく説明していません。<ol>
<li>ソースに MALDI プレートを挿入し、ftmsControl ソフトウェアの [ターゲットのロード] をクリックし、プレートがロードされるのを待ちます。</li>
		<li>MALDIプレートを表す画像内のスポットをクリックして、マトリクススポットの位置を選択します。</li>
		<li>ソフトウェアの [サンプル情報] タブで、サンプル名とフォルダを指定します。</li>
		<li>「取得」をクリックして取得を開始します。</li>
		<li>取り込み中に、レーザーが異なるスポットをポイントするように、マウス ポインタを[MALDI ビデオ] タブで少し動かします。</li>
		<li>取得が完了したら、[校正] タブに移動し、 2 次モードでHCCA キャリブレーションリストを選択し、 [自動] をクリックします。グローバルキャリブレーション結果は「キャリブレーションプロット」ウィンドウに表示され、SolariX XR 7Tの場合は0.2ppm未満である必要があります。</li>
		<li>キャリブレーションが正常に行われれば、[承諾] をクリックして、メソッドを保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>サンプルのマトリックスの堆積が完了したら、スライドをスライド アダプターに配置し、プラスチック カバーを使用してマークの位置を取得します。</li>
	<li>flexImagingソフトウェアでは、ソフトウェアで開く最初のウィンドウを使用して新しいイメージング実行を設定します。<ol>
<li>イメージング実行に名前を付け、 結果ディレクトリを選択して、[ 次へ] をクリックします。</li>
		<li>ラスター サイズ (つまり、ユーザー定義の測定領域) を指定し、使用する方法 (セクション 3.1 で調整) を選択し、[ 次へ] をクリックします。</li>
		<li>スライドをスキャンした後、ステップ 1.6 で取得したスライドの光学画像をロードし、[ 次へ] をクリックします。</li>
		<li>画像が広いウィンドウで開きます。スライドの位置を教えるためにスライド上のマークを使用してください: ftmsControlで、マークの正確な位置に MALDI ビデオ ウィンドウのターゲットを配置し 、felxImaging に戻って、光学画像上のまったく同じ点をクリックします。3 つの独立したポイントに対してこの操作を繰り返します。マークを付けたプラスチックカバーは、MALDIプレート上に置かれ、その位置を回復し、教えることを容易にします。 注:マークがマーカーで作られた場合、スライドの後ろに白い補正液を追加すると、教えの間に目立つ可能性があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>「計測領域の追加」ツールを使用して、flexImaging ソフトウェアのサンプルに対象領域を描画します。</li>
	<li>複数のサンプルを解析する場合は、イメージングの実行と"AutoXecute シーケンス" を保存します。</li>
	<li>複数のサンプルを分析する場合は、"AutoXecute バッチ ランナー" を使用してシーケンスを起動します。 注: データを定期的に安全な場所に同期してください。</li>
</ol>4. データ処理
<ol><li>生データをビジュアライゼーション ソフトウェア (SCiLS Lab) にインポートし、データセットを作成します。これは、このソフトウェアの2つの別々のステップで行われます。<ol>
<li>[バッチインポータ] ツールを使用して、生データを選択し、ターゲット ディレクトリを指定して、[インポート] をクリックします。</li>
		<li>インポート後、複数のデータセットを組み合わせて、さらに分析することができます。データセットを結合するには、"ファイル|新しい|データセット" ツール。</li>
		<li>取得に使用する計測器のタイプを選択し、インポートしたデータセットを追加するには「+"」をクリックし、オブジェクトをクリックしてドラッグして画像を配置します。</li>
		<li>マス範囲の設定を確認するか、必要に応じて、対象範囲を指定して変更します。[ 次へ ] をクリックしてインポートの概要を表示し、インポートを開始します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>サンプルの異なる組織や異なるサンプルで、関心のある m/z を視覚化します。 スペクトル をクリックして対象の m/z を選択するか、または m/z ボックスに値を入力します。<ol>
<li>異なる組織や異なるサンプル間で共局化または判別型の値を検索する必要がある場合は、統計的検定を実行して、関心のある m/z を決定します。ツールは [ツール] メニューで使用でき、このプロトコルでは説明しません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>対象の m/z (たとえば、共局化された、判別型化合物) を、[ オブジェクト ] タブから.csv ファイルとしてエクスポートします。データセット全体が大きすぎない場合 (つまり、最大 60,000 行) エクスポートすることもできます。赤い矢印で示された対象地域の右側にある [エクスポート] アイコンをクリックします。</li>
	<li>.csv ファイルをインポートして、アノテーション ソフトウェア (Metaboscape) に新しいデータセットを作成します。「プロジェクト」をクリック|CSV プロジェクトのインポート".正確な m/z のみが考慮され、同位体プロファイルが失われることに注意してください。 注: 5.0 ソフトウェア バージョンでは、同位体プロファイルを考慮できるため、より正確なアノテーションを実現する視覚化ソフトウェアからデータを直接インポートできます。</li>
	<li>一般に公開されているデータベースから派生できるカスタム作成のアナライト リストで、アナタイズします。テンプレートは、ソフトウェアによって提供され、アナライトリストを作成します。</li>
	<li>予測ソフトウェア(代謝産物予測)を使用して、アノセトされた化合物の代謝産物のインシリコ予測を行う。対象化合物の開発された式は、ソフトウェアでユーザーによって描画されるか、または.molファイルとしてインポートされるのいずれかが必要です。その後、この方法は単純なステップバイステップのプロトコルです。</li>
	<li>代謝産物のリストを回復し、分析対象リストを作成し、アノテーション ソフトウェアで使用して、予測された代謝物で生データに注釈を付けます。または、代謝物のリストが短い場合は、ステップ 4.8 で手動で検索します。</li>
	<li>可視化ソフトウェアの生データにおける代謝産物の組織分布を可視化する。</li>
	<li>予測ソフトウェアの代謝プロセスに関与する酵素の名前を右クリックして、目的の予測代謝産物を右クリックして回復します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhang, D., Gersberg, R. M., Ng, W. J., Tan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+pharmaceuticals+and+personal+care+products+in+aquatic+plant-based+systems:+A+review.">Removal of pharmaceuticals and personal care products in aquatic plant-based systems: A review.</a> Environmental Pollution. 184, 620-639 (2014).</li><li>Adeel, M., Song, X., Wang, Y., Francis, D., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+impact+of+estrogens+on+human,+animal+and+plant+life:+A+critical+review.">Environmental impact of estrogens on human, animal and plant life: A critical review.</a> Environment International. 99, 107-119 (2017).</li><li>Prosser, R. S., Sibley, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+health+risk+assessment+of+pharmaceuticals+and+personal+care+products+in+plant+tissue+due+to+biosolids+and+manure+amendments,+and+wastewater+irrigation.">Human health risk assessment of pharmaceuticals and personal care products in plant tissue due to biosolids and manure amendments, and wastewater irrigation.</a> Environment International. 75, 223-233 (2015).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+biochar+to+soils+may+result+in+plant+contamination+and+human+cancer+risk+due+to+exposure+of+polycyclic+aromatic+hydrocarbons.">Application of biochar to soils may result in plant contamination and human cancer risk due to exposure of polycyclic aromatic hydrocarbons.</a> Environment International. 121, 169-177 (2018).</li><li>Marsik, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+ibuprofen+in+higher+plants:+A+model+Arabidopsis+thaliana+cell+suspension+culture+system.">Metabolism of ibuprofen in higher plants: A model Arabidopsis thaliana cell suspension culture system.</a> Environmental Pollution. 220, 383-392 (2017).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+ibuprofen+by+Phragmites+australis:+uptake+and+phytodegradation.">Metabolism of ibuprofen by Phragmites australis: uptake and phytodegradation.</a> Environmental Science and Technology. 51 (8), 4576-4584 (2017).</li><li>Huber, C., Bartha, B., Harpaintner, R., Schr&#246;der, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+acetaminophen+(paracetamol)+in+plants-two+independent+pathways+result+in+the+formation+of+a+glutathione+and+a+glucose+conjugate.">Metabolism of acetaminophen (paracetamol) in plants-two independent pathways result in the formation of a glutathione and a glucose conjugate.</a> Environmental Science and Pollution Research. 16 (2), 206-213 (2009).</li><li>Thomas, F., C&#233;bron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+rhizosphere+effect+on+available+carbon+sources,+phenanthrene+degradation,+and+active+microbiome+in+an+aged-contaminated+industrial+soil.">Short-term rhizosphere effect on available carbon sources, phenanthrene degradation, and active microbiome in an aged-contaminated industrial soil.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1-15 (2016).</li><li>Villette, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+localization+of+micropollutants+and+associated+stress+response+in+Populus+nigra+leaves.">In situ localization of micropollutants and associated stress response in Populus nigra leaves.</a> Environment International. 126, 523-532 (2019).</li><li>Sandermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+metabolism+of+organic+xenobiotics.+Status+and+prospects+of+the+'Green+Liver'+concept.">Plant metabolism of organic xenobiotics. Status and prospects of the 'Green Liver' concept.</a> Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21st Century. , 321-328 (1999).</li><li>Sula, B., Deveci, E., &#214;zevren, H., Ekinci, C., Elbey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+and+histopathological+changes+in+the+skin+of+rats+after+administration+of+lead+acetate.">Immunohistochemical and histopathological changes in the skin of rats after administration of lead acetate.</a> International Journal of Morphology. 34 (3), 918-922 (2016).</li><li>Villette, C., Maurer, L., Wanko, A., Heintz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenobiotics+metabolization+in+Salix+alba+leaves+uncovered+by+mass+spectrometry+imaging.">Xenobiotics metabolization in Salix alba leaves uncovered by mass spectrometry imaging.</a> Metabolomics. 15, 122 (2019).</li><li>Khatib-Shahidi, S., Andersson, M., Herman, J. L., Gillespie, T. A., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Molecular+Analysis+of+Whole-Body+Animal+Tissue+Sections+by+Imaging+MALDI+Mass+Spectrometry.">Direct Molecular Analysis of Whole-Body Animal Tissue Sections by Imaging MALDI Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 78 (18), 6448-6456 (2006).</li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

このプロトコルの重要な部分はサンプルの準備です: サンプルはソフトで、そのままでなければなりません。サンプルの温度と厚さは、試験したサンプルの種類によって異なる場合がありますので、切断は最も困難な部分です。動物組織は通常均質で、切りやすくなる。植物サンプルは、多くの場合、異なる構造を組み込むため、ブレードが柔らかい、硬い、または空の血管組織に遭遇する?...

ゼノビオティックは、人間の活動のために世界中に広く分布しています。これらの化合物のいくつかは、水溶性であり、土壌1によって吸収され、植物組織2、3、4に蓄積すると食物連鎖に入る。植物は、他の生物の餌食である昆虫や草食動物によって食べられます。いくつかの異種生物の摂取と植物の健康への影響は5、6、7、8と記載されていますが、最近では組織レベル9で説明されています。したがって、ゼノビオティックの代謝がどこでどのように起こるのか、または特定の植物代謝産物が特定の組織10における異種生物蓄積に相関しているかどうかはまだ不明である。さらに、ほとんどの研究は、植物の異種生物製剤とその代謝産物の代謝を見落としているので、植物組織におけるこれらの反応についてはほとんど知られていない。
ここで提案されるのが、反応の基質および生成物の組織局在化に関連付けることができる生体試料中の酵素反応を調査する方法である。この方法は、分析が非標的であり、目的の分析対象のカスタムリストを使用して調査することができるので、1つの実験で生物学的サンプルの完全な代謝プロファイルを描くことができます。提供された候補のリストは、元のデータセットで追跡されます。目的の1つまたは複数の検体がサンプルに記載されている場合、特定の組織局在化は、関連する生物学的プロセスに関する重要な情報を提供することができる。その後、対象の検体を関連する生物学的法則を使用して、インシリコで修飾して、可能な製品/代謝産物を検索することができます。得られた代謝産物のリストは、関与する酵素を同定し、組織の反応を局所化することによって元のデータを分析するために使用され、発生する代謝過程を理解するのに役立ちます。他の方法は、生物学的サンプルで発生する反応の種類、目的の化合物の局在化、およびそれらの関連代謝産物に関する情報を提供しません。この方法は、新鮮で無傷の組織が利用可能であり、関心のある化合物をイオン化することができると、任意の種類の生物学的材料に使用することができます。提案された議定書はVilletteら12 で出版され、科学界が使用するためにここに詳述されている。

<table><tbody><tr><td>Cover slips</td><td>Bruker Daltonics</td><td>267942</td><td></td></tr><tr><td>Cryomicrotome</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>flexImaging</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ftmsControl</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GTX primescan</td><td>GX Microscopes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCCA MALDI matrix</td><td>Bruker Daltonics</td><td>8201344</td><td></td></tr><tr><td>ImagePrep</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ITO-coated slides</td><td>Bruker Daltonics</td><td>237001</td><td></td></tr><tr><td>M1-embedding matrix</td><td>ThermoScientific</td><td>1310</td><td></td></tr><tr><td>Metabolite Predict</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metaboscape</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Chemicals</td><td></td><td>No specific reference needed</td></tr><tr><td>MX 35 Ultra blades</td><td>Thermo Scientific</td><td>15835682</td><td></td></tr><tr><td>Plastic molds</td><td></td><td></td><td>No specific reference needed</td></tr><tr><td>SCiLS Lab</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SolariX XR 7Tesla</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td>The method proposed is not limited to this instrument</td></tr><tr><td>Spray sheets for ImagePrep</td><td>Bruker Daltonics</td><td>8261614</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>No specific reference needed</td></tr></tbody></table>

investigation of xenobiotics metabolism in salix alba leaves via mass spectrometry imaging

提示された方法は、異種生物薬にさらされたときに S.アルバ 葉の代謝プロファイルを確立するために質量分析イメージング(MSI)を使用しています。非標的アプローチを使用して、対象となる植物代謝産物および異種生物を特定し、植物組織に局在化して、特定の分布パターンを明らかにする。次いで、同定された異種生物由来の潜在的代謝産物(すなわち、異種物および共役体)のインシリコ予測が行われる。異種代謝産物が組織内に存在する場合、植物による変化に関与する酵素の種類が記録される。これらの結果は、葉の異種蓄積に応答して S.アルバ 葉で起こる生物学的反応の異なるタイプを記述するために使用された。代謝物は2世代で予測され、葉組織の異種生物を変換するための連続した生物学的反応の文書化を可能にした。

このプロトコルは、環境中の異種生物剤にさらされたS.アルバの木から採取された新鮮な葉に適用された。このプロセスを図1に示します。最初のステップは、目的のサンプルの薄いスライスを準備することです。植物サンプルは、組織が不均一であり、水や空気を含むことができるため、動物のサンプルよりも切断が困難であることが多いです。この難易度は、?...

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Investigation of Xenobiotics Metabolism In Salix alba Leaves via Mass Spectrometry Imaging

この方法は、異種生物薬にさらされたときに S.アルバ 葉の代謝プロセスを理解するために質量分析法イメージング(MSI)を使用しています。この方法により、特定の無傷組織内で、目的の化合物とその予測代謝産物の空間的局在化が可能になります。

質量分析イメージングによる サリックスアルバ 葉における異種生物学的代謝の研究

The method presented uses mass spectrometry imaging (MSI) to establish the metabolic profile of S. alba leaves when exposed to xenobiotics. Using a ...

investigation-xenobiotics-metabolism-salix-alba-leaves-via-mass

Research

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Investigation of Xenobiotics Metabolism In Salix alba Leaves via Mass Spectrometry Imaging

3.0K ビュー.  Université de Strasbourg. この方法は、異種生物薬にさらされたときに S.アルバ 葉の代謝プロセスを理解するために質量分析法イメージング(MSI)を使用しています。この方法により、特定の無傷組織内で、目的の化合物とその予測代謝産物の空間的局在化が可能になります。

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Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first separated into polar and non-polar fractions by a liquid-liquid phase extraction, and partially purified to facilitate downstream analysis. Both aqueous (polar metabolites) and organic (non-polar metabolites) phases of the initial extraction are processed to survey a broad range of metabolites. Metabolites are separated by different liquid chromatography methods based upon their partition properties. In this method, we present microflow ultra-performance (UP)LC methods, but the protocol is scalable to higher flows and lower pressures. Introduction into the mass spectrometer can be through either general or compound optimized source conditions. Detection of a broad range of ions is carried out in full scan mode in both positive and negative mode over a broad m/z range using high resolution on a recently calibrated instrument. Label-free differential analysis is carried out on bioinformatics platforms. Applications of this approach include metabolic pathway screening, biomarker discovery, and drug development.

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Untargeted metabolomics provides a hypothesis generating snapshot of a metabolic profile. This protocol will demonstrate the extraction and analysis of metabolites from cells, serum, or tissue. A range of metabolites are surveyed using liquid-liquid phase extraction, microflow ultraperformance liquid chromatography/high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) coupled to differential analysis software.

ウルトラパフォーマンス液体クロマトグラフィー - 高分解能質量分析（UPLC-HRMS）を使用した生物源から非標的メタボロミクス

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

化学

Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the exploration of renewable resources are necessary to overcome these challenges. Within the multinational framework MultiBioPro we are developing biorefinery pipelines to maximize the use of plant biomass. More specifically, we use poplar and tobacco tree (Nicotiana glauca) as target crop species for improving saccharification, isoprenoid, long chain hydrocarbon contents, fiber quality, and suberin and lignin contents. The methods used to obtain these outputs include GC-MS, LC-MS and RNA sequencing platforms. The metabolite pipelines are well established tools to generate these types of data, but also have the limitations in that only well characterized metabolites can be used. The deep sequencing will allow us to include all transcripts present during the developmental stages of the tobacco tree leaf, but has to be mapped back to the sequence of Nicotiana tabacum. With these set-ups, we aim at a basic understanding for underlying processes and at establishing an industrial framework to exploit the outcomes. In a more long term perspective, we believe that data generated here will provide means for a sustainable biorefinery process using poplar and tobacco tree as raw material. To date the basal level of metabolites in the samples have been analyzed and the protocols utilized are provided in this article.

Plant biomass offers a renewable resource for multiple products, including fuel, feed, food, and a variety of materials. In this paper we investigate the properties of tobacco tree (Nicotiana glauca) and poplar as suitable sources for a biorefinery pipeline.

バイオベースの産業の原料としてたばこ木とポプラの評価のための転写産物および代謝物プロファイリング

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the ...

環境学

Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we developed an excised leaf assay combined with a vegetative cloning strategy to normalize herbicide uptake and remove translocation as contributing factors in herbicide-resistant (R) and &#8211;sensitive (S) waterhemp populations. Biokinetic analyses of organic pesticides in plants typically include the determination of uptake, translocation (delivery to the target site), metabolic fate, and interactions with the target site. Herbicide metabolism is an important parameter to measure in herbicide-resistant weeds and herbicide-tolerant crops, and is typically accomplished with whole-plant tests using radiolabeled herbicides. However, one difficulty with interpreting biokinetic parameters derived from whole-plant methods is that translocation is often affected by rates of herbicide metabolism, since polar metabolites are usually not mobile within the plant following herbicide detoxification reactions. Advantages of the protocol described in this manuscript include reproducible, accurate, and rapid determination of herbicide degradation rates in R and S populations, a substantial decrease in the amount of radiolabeled herbicide consumed, a large reduction in radiolabeled plant materials requiring further handling and disposal, and the ability to perform radiolabeled herbicide experiments in the lab or growth chamber instead of a greenhouse. As herbicide resistance continues to develop and spread in dicot weed populations worldwide, the excised leaf assay method developed and described herein will provide an invaluable technique for investigating non-target site-based resistance due to enhanced rates of herbicide metabolism and detoxification.

This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.

摘出葉のアッセイで双子葉雑草除草剤代謝の速度を測定します

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing plant metabolites because it provides molecular weights with high sensitivity and specificity. Leaf spray MS is an ambient ionization technique where plant tissue is used for direct chemical analysis via electrospray, eliminating chromatography from the process. This approach to sampling metabolites allows for a wide range of chemical classes to be detected simultaneously from intact plant tissues, minimizing the amount of sample preparation needed. When used with a high-resolution, accurate mass MS, leaf spray MS facilitates the rapid detection of metabolites of interest. It is also possible to collect tandem mass fragmentation data with this technique to facilitate a compound identification. The combination of accurate mass measurements and fragmentation is beneficial in confirming compound identities. The leaf spray MS technique requires only minor modifications to a nanospray ionization source and is a useful tool to further expand the capabilities of a mass spectrometer. Here, fresh leaf tissue from Sceletium tortuosum (Aizoaceae), a traditional medicinal plant from South Africa, is analyzed; numerous mesembrine alkaloids are detected with leaf spray MS.

Leaf spray mass spectrometry is a direct chemical analysis technique that minimizes the sample preparation and eliminates chromatography, allowing for the rapid detection of small molecules from plant tissues.

リーフ スプレー質量分析: 植物組織由来の代謝産物を直接評価するの急速な周囲のイオン化法

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

生化学

Elucidating the Metabolism of 2,4-Dibromophenol in Plants

Crops can be extensively exposed to organic pollutants, since soil is a major sink for pollutants discarded into the environment. This creates potential human exposure through the consumption of pollutant-accumulated foods. Elucidating the uptake and metabolism of xenobiotics in crops is essential for the assessment of dietary exposure risk in humans. However, for such experiments, the use of intact plants requires long-term experiments and complex sample preparation protocols that can be affected by various factors. Plant callus cultures combined with high-resolution mass spectrometry (HRMS) may provide a solution for the accurate and time-saving identification of metabolites of xenobiotics in plants, as it can avoid interference from the microbial or fungal microenvironment, shorten the treatment duration, and simplify the matrix effect of intact plants. 2,4-dibromophenol, a typical flame retardant and endocrine disrupter, was chosen as the model substance due to its widespread occurrence in soil and its uptake potential by plants. Herein, plant callus was generated from asepsis seeds and exposed to sterile 2,4-dibromophenol-containing culture medium. The results showed that eight metabolites of 2,4-dibromophenol were identified in the plant callus tissues after 120 h of incubation. This indicates that 2,4-dibromophenol was rapidly metabolized in&#160;the plant callus tissues. Thus, the plant callus culture platform is an effective method to evaluate the uptake and metabolism of xenobiotics in plants.

The present protocol describes a simple and efficient method for the identification of 2,4-dibromophenol metabolites in plants.

植物における2,4-ジブロモフェノールの代謝を解明

Crops can be extensively exposed to organic pollutants, since soil is a major sink for pollutants discarded into the environment. This creates potential ...

Semi-Targeted Ultra-High-Performance Chromatography Coupled to Mass Spectrometry Analysis of Phenolic Metabolites in Plasma of Elderly Adults

A group of 23 elderly persons was given functional meals (a beverage and a muffin) specially formulated for the prevention of sarcopenia (age-related loss of muscle mass). Plasma samples were taken at the beginning of the intervention and after 30 days of consuming the functional meals. A semi-targeted ultra-high-performance chromatography coupled with tandem mass (UPLC-MS/MS) analysis was carried out to identify phenolic compounds and their metabolites. Plasma proteins were precipitated with ethanol and the samples were concentrated and resuspended in the mobile phase (1:1 acetonitrile: water) before injection into the UPLC-MS/MS instrument. Separation was carried out with a C18 reverse-phase column, and compounds were identified using their experimental mass, isotopic distribution, and fragment pattern. Compounds of interest were compared to those of data banks and the internal semi-targeted library. Preliminary results showed that the major metabolites identified after the intervention were phenylacetic acid, glycitin, 3-hydroxyphenylvaleric acid, and gomisin M2.

The goal of this protocol is to detect phenolic metabolites in plasma using a semi-targeted chromatography-mass spectrometry method.

高齢者の血漿中のフェノール代謝産物の質量分析に組み合わせた半標的超高速クロマトグラフィー

A group of 23 elderly persons was given functional meals (a beverage and a muffin) specially formulated for the prevention of sarcopenia (age-related loss ...

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like experimental conditions. Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is one such development and is particularly well-suited for the investigation of water-containing specimens. LAESI utilizes a mid-infrared laser beam (2.94 &mu;m wavelength) to excite the water molecules of the sample. When the ablation fluence threshold is exceeded, the sample material is expelled in the form of particulate matter and these projectiles travel to tens of millimeters above the sample surface. In LAESI, this ablation plume is intercepted by highly charged droplets to capture a fraction of the ejected sample material and convert its chemical constituents into gas-phase ions. A mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure ion source interface is employed to analyze and record the composition of the released ions originating from the probed area (pixel) of the sample. A systematic interrogation over an array of pixels opens a way for molecular imaging in the microprobe analysis mode. A unique aspect of LAESI mass spectrometric imaging is depth profiling that, in combination with lateral imaging, enables three-dimensional (3D) molecular imaging. With current lateral and depth resolutions of ~100 &mu;m and ~40 &mu;m, respectively, LAESI mass spectrometric imaging helps to explore the molecular structure of biological tissues. Herein, we review the major elements of a LAESI system and provide guidelines for a successful imaging experiment.

Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is an atmospheric-pressure ion source for mass spectrometry. In the imaging mode, a mid-infrared laser probes the distributions of molecules across a tissue section or a biofilm. This technique presents a new approach for diverse bioanalytical studies carried out under native experimental conditions.

LAESI質量分析による生体組織とバイオフィルムの大気圧分子イメージング

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like ...

生物学

<meta charset="utf8"></head><body>UPLC-TOF質量分析による Gynura bicolor の化学組成の同定

High-resolution Tandem Mass Spectrometry for Studying Chemical Constituents of Gynura bicolor DC

The separation and analysis of the desired chemical components are important subjects for the fundamental research of traditional Chinese medicine (TCM). Ultra-high-performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry (UPLC-Q-TOF-MS/MS) has gradually become a leading technology for the identification of TCM ingredients. Gynura bicolor DC. (BFH), a perennial stemless herb used for medicine and food in China has medicinal effects such as clearing heat, moistening the lung, relieving cough, dispersing stasis, and relieving swelling. Polyphenols and flavonoids contain numerous isomers, which hinder the identification of the complex compounds in BFH. This paper presents a systematic protocol for studying chemical constituents of BFH based on solvent extraction and integrated data via UPLC-Q-TOF-MS.
The method described here includes systematic protocols for sample pretreatment, MS calibration, MS acquisition, data processing, and analysis of results. Sample pretreatment includes collection, cleaning, drying, crushing, and extraction. MS calibration consists of multipoint and single-point correction. Data processing includes data importing, method establishment, analysis processing, and result presentation. Representative results of the typical fragmentation pattern of phenolic acids, esters, and glycosides in Gynura bicolor DC. (BFH) are presented in this paper. In addition, organic solvent selection, extraction, data integration, collision energy selection, and method improvement are discussed in detail. This universal protocol can be widely used to identify complex compounds in TCM.

<meta charset="utf8"></head><body>高分解能タンデム質量分析のための GynuraバイカラーDC サンプルの調製

We describe a general protocol that integrates high-resolution mass spectrometry analysis and molecular docking in traditional Chinese medicine research.

Gynura bicolor DCの化学成分を研究するための高分解能タンデム質量分析

The separation and analysis of the desired chemical components are important subjects for the fundamental research of traditional Chinese medicine (TCM). ...

質量分析イメージングによるサリックスアルバ葉における異種生物学的代謝の研究

要約

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ウルトラパフォーマンス液体クロマトグラフィー - 高分解能質量分析（UPLC-HRMS）を使用した生物源から非標的メタボロミクス

バイオベースの産業の原料としてたばこ木とポプラの評価のための転写産物および代謝物プロファイリング

摘出葉のアッセイで双子葉雑草除草剤代謝の速度を測定します

リーフスプレー質量分析: 植物組織由来の代謝産物を直接評価するの急速な周囲のイオン化法

植物における2,4-ジブロモフェノールの代謝を解明

高齢者の血漿中のフェノール代謝産物の質量分析に組み合わせた半標的超高速クロマトグラフィー

LAESI質量分析による生体組織とバイオフィルムの大気圧分子イメージング

Gynura bicolor DCの化学成分を研究するための高分解能タンデム質量分析

Gynura bicolor DCの化学成分を研究するための高分解能タンデム質量分析

Gynura bicolor DCの化学成分を研究するための高分解能タンデム質量分析

質量分析イメージングによる サリックスアルバ 葉における異種生物学的代謝の研究

要約

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ウルトラパフォーマンス液体クロマトグラフィー - 高分解能質量分析（UPLC-HRMS）を使用した生物源から非標的メタボロミクス

バイオベースの産業の原料としてたばこ木とポプラの評価のための転写産物および代謝物プロファイリング

摘出葉のアッセイで双子葉雑草除草剤代謝の速度を測定します

リーフ スプレー質量分析: 植物組織由来の代謝産物を直接評価するの急速な周囲のイオン化法

植物における2,4-ジブロモフェノールの代謝を解明

高齢者の血漿中のフェノール代謝産物の質量分析に組み合わせた半標的超高速クロマトグラフィー

LAESI質量分析による生体組織とバイオフィルムの大気圧分子イメージング

Gynura bicolor DCの化学成分を研究するための高分解能タンデム質量分析

Gynura bicolor DCの化学成分を研究するための高分解能タンデム質量分析

Gynura bicolor DCの化学成分を研究するための高分解能タンデム質量分析

質量分析イメージングによるサリックスアルバ葉における異種生物学的代謝の研究

リーフスプレー質量分析: 植物組織由来の代謝産物を直接評価するの急速な周囲のイオン化法