La ricerca sulle malattie cardiache viene spesso eseguita in piccoli e mammiferi come i roditori. Tuttavia, la fisiologia del cuore umano differisce significativamente da quella del cuore del roditore. Il nostro protocollo utilizza cardiomiociti differenziati dalle cellule iPS umane per modellare le malattie cardiache ischemiche e quantificare i danni e la compromissione funzionale dei cardiomiociti ischemici.
Questo protocollo può fornire un metodo conveniente per lo screening personalizzato dei farmaci utilizzando cellule iPS derivate da singoli pazienti, l'adeguata gestione delle cellule iPS, come nell'uso di mezzi freschi, e cambiare il mezzo lentamente e puntualmente è fondamentale per garantire una differenziazione di successo in cardiomiociti funzionali. A dimostrare la procedura con Yun Liu, Yin Liang e Mengxue Wang sarà Chen Wang, dottorando di un laboratorio. Per indurre la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo in cellule cardiache, rivestire prima i pozzi di una piastra di coltura di 96 pozzi con 100 microlitri di 1.675 microgrammi per millilitro di laminina in PBS.
Dopo un'incubazione di 30 minuti a 37 gradi Celsius, vedere tre volte 10 alla quarta cellula staminale in 200 microlitri di mezzo di manutenzione IPS integrati con 10 micromolari Y27632 in ogni pozzo e riportare la piastra all'incubatore di coltura cellulare. Dopo 24 ore, sostituire i super mezzi con 200 microlitri di mezzo di crescita IPS per pozzo e restituire la piastra all'incubatore di coltura cellulare per altri due o tre giorni. Quando le celle raggiungono la confluenza dal 70 all'80%.
Sostituire il mezzo in ogni pozzo con 200 microlitri di mezzo di differenziazione preri riscaldato A e riportare la piastra all'incubatore di coltura cellulare per altre 48 ore. Al termine dell'incubazione ha lentamente sostituito il supernatante in ogni pozzo con 200 microlitri di mezzo di differenziazione prerivolto B e ha restituito la piastra all'incubatore di colture cellulari. Dopo due giorni, sostituire i supernaganti con 200 microlitri di mezzo di manutenzione cardiomiocitare preri riscaldato per pozzo e restituire la piastra all'incubatore di coltura cellulare per un massimo di 30 giorni.
Per valutare la contrattilità dei cardiomiociti, installare l'immagine di particelle velocimetria immagine j plugin e utilizzare un microscopio a contrasto di fase e l'obiettivo forche per registrare immagini video delle cellule a circa 20 fotogrammi al secondo per circa 10 secondi. Quindi salva il file video come analizzato la nostra API e crea una struttura di cartelle come indicato. Per analizzare campi vettoriali bidimensionali discreti di spostamento cellulare, avviare VG e selezionare plugin, macro e modificare per aprire l'analisi vettoriale.
ijm, quindi fare clic su esegui l'analisi verrà eseguita automaticamente. Per il trattamento ischemico, sostituire il supernatante in ogni pozzo con 200 microlitri di dmem senza glucosio e siero, quindi posizionare la piastra in una camera ipossia, quindi infondere gas azoto nella camera, mantenendo la concentrazione interna di ossigeno al 2% e la concentrazione di anidride carbonica al 5% per 24 ore. Differenziando con successo le cellule, dimostra una contrazione spontanea osservata al microscopio con il 50% dei pozzi di coltura che in genere mostrano una contrazione spontanea in meno di 20 giorni.
La proteina marcatore cardiaco può anche essere usata per confermare una differenziazione di successo Le cellule del gruppo ischemico mostrano tipicamente una minore vitalità nei test MTT e una contralità inferiore rispetto a quelle del gruppo di controllo normossico. Il rapporto tra cellule positive propidio ioduro è anche più alto nel gruppo ischemico, che nel gruppo di controllo, indicando una maggiore incidenza di danni cellulari. È importante individuare con precisione le regioni di interesse nella piastra di cattura per consentire il confronto della contrattilità dei cardiomiociti.
Questa tecnica può essere utilizzata per lo screening farmacologico, utilizzando cellule iPS derivate dal paziente. Fornisce inoltre una piattaforma unica per chiarire ulteriormente i meccanismi alla base delle malattie cardiache ischemiche
