Utilizzando il protocollo come effetto biofisico di diversi attuatori optogenetici sull'attività cardiomiocitario può essere testato per aiutare nello sviluppo di esperimenti optogenetici nel tessuto cardiaco e in interi cuori. Combinando la tecnica del patch clamp con il tracciamento del sarcomero e le misurazioni della forza assistita in fibra di carbonio, possiamo studiare gli effetti della fotoattivazione GtACR1 sull'elettricità e la meccanica dei cardiomiociti ventricolari. L'inibizione optogenetica può potenzialmente essere utilizzata per la defibrillazione ottica.
GtACR1 è uno strumento optogenetico che consente il silenziamento dell'attività cardiaca. Questa tecnica è pienamente applicabile ad altri campi di ricerca come studi sulle cellule muscolari lisce e uni cellulari. Sebbene questo protocollo non possa essere utilizzato per lo screening ad alta produttività, fornisce un mezzo per l'analisi completa della funzione elettrica e meccanica dei cardiomiociti.
Quindi, come si suol dire, un'immagine dice più di mille parole. Quante altre informazioni possiamo ottenere in video? Alcuni dei nostri strumenti e tecniche coinvolti nello stiramento di singoli miociti e nella preparazione della sonda sono altamente intricati ed è molto più facile trasmetterli in un video rispetto a una descrizione.
Dopo che il sangue è stato lavato fuori dal cuore perfuso salino da un coniglio bianco neozelandese di nove-10 settimane, cambia il perfusato in una soluzione a basso calcio e ad alto contenuto di potassio e perfondi il cuore per altri due minuti dopo che il cuore smette di battere. Perfondere la soluzione enzimatica, iniziare a ricircolare la soluzione enzimatica nel serbatoio dopo due minuti di digestione e ridurre la velocità a 16 millilitri al minuto dopo cinque minuti di digestione. Una volta che il tessuto appare morbido dopo 40-50 minuti di digestione, tagliare il cuore dalla cannula e posizionare immediatamente il cuore nella soluzione di blocco.
Aggiungere la soluzione di blocco fino a quando il tessuto non è completamente coperto. Tagliare il ventricolo destro e il setto e separare il ventricolo sinistro. Rimuovere i muscoli papillari e utilizzare flessori fini e una pipetta per smontare delicatamente il tessuto per rilasciare le cellule per dissociazione meccanica.
Filtrare la sospensione cellulare attraverso una rete con pori quadrati di un millimetro e sedimentare le cellule mediante centrifugazione. Quindi resostigliere il pellet di cardiomiocita in una soluzione di blocco fresco. Per un esperimento di patch clamp, rivestire le copertine autoclavate in una piastra di Petri con 100 microgrammi per millilitro di laminina immediatamente prima della coltura cellulare.
Per l'esperimento in fibra di carbonio, rivestire le piastre petri con 0,12 grammi per millilitro di Poly-HEMA in una soluzione etanolo-acqua da 95 a cinque. Da dieci a 15 minuti dopo la sospensione dei cardiomiociti, rimuovere il supernatante e rimescolare le cellule nel mezzo di coltura. Dopo il conteggio, seminare le cellule su un coverslip in una piastra di Petri ad una densità target di 1,75 per 10 alle quattro cellule per millilitro.
Incubare le colture per tre o quattro ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Al termine dell'incubazione, sostituire il mezzo dalle colture di coverlip con un mezzo fresco contenente adenovirus di tipo cinque codificante per GtACR1-eGFP a una molteplicità di infezione di 75. Riportare le colture nell'incubatore per 48 ore.
Per eseguire un esperimento di patch clamp, utilizzare un estrattore di micropipette per estrarre pipette patch da 1,7 a 2,5 megaohm dai capillari in vetro di calce soda e inizializzare il software di acquisizione dati. Posizionare un coverslip con cellule nella camera di misura contenente soluzione esterna e selezionare il cardiomiocita in base alla sua fluorescenza eGFP. Quindi, riempire una pipetta patch con soluzione interna e attaccare la pipetta al supporto della pipetta inserendo il filo di registrazione in argento rivestito in cloruro d'argento nella soluzione interna.
Impostare il test della membrana in modo che applichi impulsi da 10 millivolt per 15 millisecondi con una linea di base di zero millivolt. Dopo aver raggiunto la configurazione collegata alle celle, passare alla modalità cella intera con un potenziale di detenzione di meno 60 millivolt nel software di acquisizione dati. Quindi applicare delicatamente la pressione negativa per accedere all'intera configurazione cellulare ruttando la membrana.
Una rottura riuscita sarà evidenziata da un aumento immediato della capacità misurata. Registrare i protocolli di fotoattivazione in modalità morsetto di tensione a meno 74 millivolt con impulsi di luce di 300 millisecondi o potenziali di azione in modalità clamp di corrente a zero picoampere. Per produrre le fibre di carbonio, montare prima la pipetta sui supporti della pipetta dell'estrattore.
Tirare i capillari di vetro in due pipette con una lunghezza totale affusolata di circa 11 millimetri e un diametro interno finale di circa 30 micrometri. Successivamente, utilizzare un microscopio stereo per allineare un capillare nel cerchio di orientamento e piegarlo fino a 45 gradi spingendo verso il basso sulla punta del capillare con un bender. Riscaldare il filamento fino a quando il capillare mantiene l'angolo di 45 gradi anche dopo che la bender è stata rimossa.
Dopo aver piegato il capillare, utilizzare forcette fini dotate di tubi morbidi per esegnare una fibra di carbonio dal tubo e inserirla nella punta fine del capillare. Spingere la fibra nel capillare fino alla piegatura. Tagliare le fibre di carbonio in modo che proienino due millilitri dalla punta del capillare e utilizzare colla cianoacrilato per fissare le fibre alla sezione anteriore di ogni capillare.
Per calibrare le fibre, fissare un capillare a un supporto controllato da un micromanipolatore e da un motore piezo. Spostare il capillare verso il sensore e allinearlo rispetto al sensore. Posizionare la punta della fibra a contatto con il sensore di forza senza produrre alcuna forza.
Il movimento totale del motore piezo è di 60 micrometri. Spostare il motore piezo in sei passi da 10 micrometri verso il sensore di forza. Il sensore ha una sensibilità di 0,05 millinewton per volt e un intervallo di forza da zero a 0,5 millinewton.
Leggere la tensione misurata per ogni passaggio e rimuovere la fibra di carbonio dal sensore. Per registrare la forza di contrarre i cardiomiociti, rivestire la superficie di un coverglass con Poly-HEMA e posizionarlo nella camera di misura. Riempire la camera con soluzione da bagno esterna.
Attaccare entrambi i capillari caricati in fibra di carbonio al micromanipolatore dello stadio e allinearli ad angolo in modo che le fibre di carbonio siano quasi orizzontali alla superficie della camera di misura. Per verificare se le fibre sono allineate correttamente, concentrarsi sulla superficie della camera di misura, abbassare la prima fibra e spostare la fibra orizzontalmente. La punta della fibra dovrebbe scivolare sulla superficie della camera di misura.
Seguire la stessa procedura per la seconda fibra. Con le luci spente, aggiungere alcune gocce di sospensione cellulare coltivata alla camera e applicare brevi impulsi di luce verde per selezionare le celle che si contraggono in risposta alla stimolazione della luce verde. Per attaccare la prima fibra, comprimere delicatamente la cella abbassando la fibra, quindi rilasciare la pressione.
Attaccare la seconda fibra parallela alla prima all'altra estremità del cardiomiocita per avere un numero massimo di sarcomeres tra le due fibre. Dopo aver attaccato entrambe le fibre, sollevare le fibre in modo che la cella non sia più a contatto con la superficie della camera. Mettere a fuoco i sarcomer, impostare la finestra di tracciamento della lunghezza del sarcomero tra le fibre e utilizzare il modulo di rilevamento dei bordi per tenere traccia della piegatura della fibra.
Impostare le aree di rilevamento con le finestre rosse e verdi e definire una soglia alla prima derivata della traccia di intensità della luce. Accelerare otticamente la cella mentre si traccia la lunghezza del sarcomero e la piegatura della fibra. In questo caso, abbiamo camminato a 0,25 hertz.
Dopo aver registrato almeno 15 contrazioni otticamente suscitate, il campo stimola elettricamente la cella. Trovare la soglia per ottenere le contrazioni e applicare 1,5 volte la tensione di soglia per il stimolazione elettrica. Per un protocollo di inibizione, applicare stimoli elettrici per suscitare contrazioni e quindi esporre la cellula a un impulso luminoso sostenuto a varie intensità di luce.
Registrare almeno 15 contrazioni dopo l'inibizione indotta dalla luce. GtACR1 è espresso in cardiomiociti di coniglio coltivati. La fotoattivazione GtACR1 ad un'intensità luminosa di quattro milliwatt per millimetro al quadrato per 300 millisecondi si traduce in grandi correnti dirette verso l'interno a meno 74 millivolt con una corrente di picco misurata di 245 picoampere.
In questo esperimento rappresentativo, i potenziali d'azione sono stati attivati elettricamente con iniezioni di corrente 1,5 volte la soglia o otticamente con impulsi di luce di 10 millisecondi. I cardiomiociti a ritmo ottico hanno dimostrato un'insorgenza di potenziale d'azione più lenta. I potenziali d'azione innescati elettricamente sono stati inibiti sotto una luce sostenuta.
Anche iniezioni di corrente più elevate e 1,5 volte la soglia durante l'applicazione della luce sostenuta non provocano potenziali d'azione. Il cardiomiocita ha generato una forza di contrazione di 232 micronewton per millimetro al quadrato al momento della stimolazione elettrica e 261 micronewton per millimetro al quadrato dopo il ritmo ottico. Impulsi prolungati di luce verde inibivano le contrazioni con le contrazioni ricorrenti post-inibizione generando una forza contrattile inferiore in linea con la perdita di calcio diastolica da cardiomiociti di coniglio.
Si consiglia di praticare le tecniche prima di condurre un esperimento, in particolare perché posizionare le microbi al buio può essere impegnativo. è molto importante quando si analizza la contrattilità dei cardiomiociti in quanto può influenzare la produzione di forza e il rilassamento. Vari post-carichi possono anche essere applicati per l'analisi della contrazione isotonica e auxotonica.
Queste tecniche consentono la caratterizzazione degli effetti biofisici dell'attivazione di attuatori optogenetici di nuova sviluppo nei cardiomiociti, che è fondamentale per selezionare lo strumento optogenetico più adatto per ogni esperimento. Si prega di essere consapevoli del fatto che la trasduzione dell'adenovirus e tutti i passaggi successivi alla trasduzione devono essere eseguiti in condizioni di biosicurezza di livello II.
