La riproducibilità è una delle principali preoccupazioni quando si inducono cardiomiociti derivati da cellule staminali. Utilizzando questi metodi, l'alta purezza e i cardiomiociti di alta qualità possono essere generati da iPS per il loro uso in studi funzionali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è un metodo semplice, affidabile, economico ed estremamente potente per ottenere preparati purificati e di alta qualità di cardiomiociti derivati da iPSC.
Per la passatura cellulare, sciacquare le cellule con un millilitro di PBS senza calcio e magnesio per sette-10 minuti prima di sostituire il PBS con un millilitro di mezzo di passaging. Utilizzando un sollevatore di celle, raschiare delicatamente le cellule dal fondo dei pozzi e utilizzare pipetta sterile in vetro a due millilitri per dissociare meccanicamente le cellule staccate. Quando le cellule si sono alzate in piccoli ammassi come visibili al microscopio, aggiungere il mezzo di passaging per dividere le cellule con un rapporto da uno a sei.
Successivamente, aspirare la matrice qualificata delle cellule staminali embrionali umane dalla piastra dei sei pozzi. Quindi aggiungere un millilitro di mezzo passante e un millilitro di cellule dissociate a ciascun pozzo e lasciare che le cellule crescano fino a raggiungere la confluenza dal 70 all'80% prima di iniziare una differenziazione cardiaca. Almeno 30 minuti prima di dissociare i CRM iPSC, pulire i singoli vetrini con etanolo al 70% e posizionare il coperchio scivola nei singoli pozzi di una piastra sterile a sei pozzetti.
Quando i foglietti di copertura si sono asciugati, aggiungere da 250 a 300 microlitri di soluzione a matrice qualificata di cellule staminali embrionali umane direttamente al centro di ogni slittamento di copertura e posizionare la piastra dei sei pozzi nel cappuccio di coltura tissutale. Per dissociare l'iPSC-CM metabolicamente selezionato aggiungere un millilitro di 0,25% di tripside sterile con EDTA a ciascun pozzo per un'incubazione di cinque minuti a 35 gradi celsius e utilizzare una pipetta a 1000 microliter per dissociare meccanicamente le cellule fino a quando non è stata raggiunta una sospensione a singola cella. Estrarre le cellule in un tubo conico sterile da 15 millilitri e lavarli bene con due millilitri di RPMI 20 medio per pozzo.
Quindi aggiungere i lavaggi al tubo e pelletare le cellule per centrifugazione. Rimospendare le cellule in un volume sufficiente di mezzo per ottenere una concentrazione di cellule tre volte 10 alla quinta per 250 microlitri di concentrazione di cellule. Utilizzare una punta di pipetta da 1000 millilitri per dissociare le cellule fino a quando la soluzione non sembra essere omogenea.
Quindi aspirare 250 microlitri di cellule in una punta di pipetta da 1000 microlitri e erogare lentamente l'intero volume di soluzione su uno slittamento di copertura codificato a matrice qualificata di cellule staminali embrionali umane. Quando tutte le cellule sono state seminate, posizionare con cura il piatto nell'incubatrice di coltura cellulare durante la notte. Aggiungendo delicatamente due millilitri di D7 medio a ciascuno bene la mattina successiva.
Quando gli iPSC-CRM selezionati raggiungono almeno tre mesi, trattare le cellule con due microlitri di Fura-2 AM per 10 minuti a 37 gradi Celsius e alimentare il sistema di analisi del calcio. Avviare ArcLamp e collegare i tubi dalla pompa all'ingresso e alle uscite appropriate e il filo elettronico dallo stimolatore alla camera. Posizionare la camera sul sistema.
Riempire il tubo ProFusion che attraversa il riscaldatore fluido inline con soluzione Tyrode riscaldata di 37 gradi Celsius e regolare le dimensioni della fotocamera e dell'apertura dell'inquadratura per ridurre al minimo l'area di sfondo. Fissare il coperchio di vetro seminato con iPSC-CRM nella camera e aggiungere delicatamente 500 microlitri della soluzione di Tyrode direttamente sopra lo scivolo di copertura. Inizia a profusare la camera con la soluzione di Tyrode a una velocità di 1,5 millilitri al minuto e usa uno stimolatore elettrico per accelerare le macchine iPC-Cms con 1 stimolazione del campo hertz a 10 volt ogni quattro millisecondi per tre o cinque minuti.
Quando tutto il colorante è stato lavato fuori dalla camera, regolare la finestra di visualizzazione nella regione in alto a sinistra dello scivolo di copertura e iniziare la registrazione. Dopo aver raccolto un flusso coerente da cinque a 10 picchi, fare clic su Pausa per interrompere temporaneamente la registrazione e spostare lo stadio del microscopio in un'area adiacente per l'estremità opposta dello slittamento di copertura prima di riprendere la registrazione. Dopo aver scansionato la caduca di calcio su tutto il coperchio scivolare allo stesso modo per un periodo di 10 minuti analizzare i dati con un software di analisi della traccia di florescence appropriato secondo le istruzioni del produttore.
Questo protocollo genera cardiomiociti altamente puri che acquisiscono un fenotipo ventricolare simile a un adulto in coltura nel tempo. Come valutato dalla colorazione immuno fluorescente per le isoforme atriali e ventricolari MLC2, la maggior parte delle cellule generate da questo protocollo sono isoforme atriali MLC2 positive al giorno 30 dopo l'induzione della differenziazione cardiaca. Mentre le isoforme ventricolari MLC2 sono espresse in molti numeri nello stesso momento.
Con l'aumentare del tempo in coltura, si osserva un passaggio completo alle isoforme MLC2. Questi dati sono stati confermati anche dalla quantificazione citometrica del flusso della percentuale di cellule che esprimono cellule del marcatore MLC2 atriale e ventricolare. L'ampiezza del calcio è significativamente aumentata nelle macchine virtuali iPSC al giorno 90, simile a quella osservata per le macchine virtuali per topi adulti.
È importante notare che la contaminazione delle cellule non cardiache può influenzare la maturazione funzionale delle iPSC-CRM umane durante la differenziazione. Inoltre, quando si registrano transitori di calcio in iPSC-CRM è necessario consentire alle cellule di stabilizzarsi a 37 gradi Celsius sotto stimolazione costante per almeno 200 secondi e limitare le registrazioni a un'ora specifica per garantire risultati riproducibili. Ricordarsi di confermare che gli iPSC presentano una morfologia omogenea e di consentire alle cellule di crescere fino al 70-80% di confluenza prima di iniziare una differenziazione cardiaca.
La qualità pura nei cardiomiociti immaturi derivati dall'iPS potrebbe mostrare caratteristiche funzionali alterate, che non riflettono il fenotipo reale, ma potrebbero essere interpretate erroneamente come il fenotipo mato. Pertanto, ottenere cardiomiociti puri e di alta qualità è importante per fornire risultati coerenti e riproducibili.
