הפטוציטים ראשוניים של עכברים חשובים במחקרי כבד. במיוחד עבור חילוף חומרים של גלוקוז, ובדיקות תרופות בכבד. מבחינת זמן תהליך הבידוד יכול לגזול זמן רב והאנרגיה יקרה.
פרוטוקול זה יכול לספק דרך יעילה לבודד הפטוציטים ראשוניים של עכברים. זה זמן וידידותי לעבודה. דורש מעט מאוד שלבים עם כל האזורים הזמינים באופן מסחרי.
התחילו על ידי שימוש במשאבה הפריסטלטית כדי להתחיל לשאוב מים מזוקקים כפולים מחוממים במהירות של 4 מ"ל לדקה, למשך חמש דקות. לאחר מכן החליפו את צינור השאיבה ממים למדיום זלעפות מחומם. ניטור בועת האוויר בין המים למדיום הזלוף.
יעזור לעקוב אחר זרימת מדיום הזלוף דרך המערכת. לאחר מכן יש לחטא את בטנו של עכבר נקבת C57 שחור 6J בן שמונה שבועות מורדם עם 70% אתנול. ובעזרת מספריים, חתכו את הבטן כדי לחשוף את הכבד, וריד הפורטל והווריד הנבוב התחתון.
ואז לעצור את המשאבה peristaltic. לאחר הקפדה על כך שצינור השאיבה מכיל מדיום פרפוזיה ולא מים. מכניסים קטטר של 24 מדים לתוך הווריד הנבוב התחתון.
הפעילו מחדש את המשאבה וחתכו את וריד הפורטל פתוח. בזמן שמדיום הזלוף נשאב, לחץ על וריד הפורטל כל דקה כדי לאפשר לנוזל להגיע לכל פינה בכבד. יש להמשיך לשאוב במשך כשלוש עד חמש דקות או עד שהנוזל השטוף מתבהר.
לאחר מכן שנה את צינור השאיבה ממדיום הזלוף למדיום הפיזור של הקולגנאז. ולחץ על וריד הפורטל בכל דקה כדי לאפשר לנוזל להגיע לכל פינה בכבד. ממשיכים לשאוב עד שכל 25 מ"ל של מדיום הדיספוזה של הקולגנאז מתרוקנים.
לאחר מכן לבודד את כל הכבד ללא כיס המרה. והניח אותו ב -30 מ"ל של מדיום שטיפה בצלחת פטרי על קרח. שימוש במלקחיים קורע את הכבד לחתיכות כדי לשחרר הפטוציטים ראשוניים לתמיסה.
בשלב זה, מדיום הכביסה הופך לתמיסה עכורה המכילה הפטוציטים ראשוניים משוחררים וחתיכות כבד קטנות. סנן את התמיסה העכורה הזו דרך מסננת תאים של 70 מיקרון, לתוך 20 מ"ל של 1X לכל שיחה HBSS בצינור של 50 מ"ל על קרח. ומערבבים את התמיסה על ידי היפוך הצינור 20 פעמים.
הצנטריפוגה הבאה את הפתרון. לאחר מכן במכסה התרבית רקמה, שאפו את הסופרנטנט. ולשטוף את הכדור עם 30 מ"ל של מדיום שטיפה קרה.
גלול את התאים שוב עם צנטריפוגה. הסר את ה-supernatant, והשעה מחדש את הכדור ב-25 מ"ל של מדיום התרבית. ספרו את התאים וצלחו אותם על צלחות התרבית הרצויות.
על פי התכנון הניסויי. לאחר הציפוי, הפטוציטים ראשוניים מבודדים היו מחוברים היטב בשעה אחת והורחבו במלואם לאחר 12 שעות. בהפטוציטים המבודדים, רמות ה-mRNA של סמני הפטוציטים, כגון טרנסתירטין, CD95, ASGR1 ו-ASGR2 עלו באופן משמעותי בהשוואה לכבד כולו.
לעומת זאת, הנוכחות של תאי מערכת החיסון, תאי סטלטים ותאי אנדותל הייתה נמוכה יותר. כפי שמעידה ירידה חדה ב-CD45, קולגן מסוג 1 אלפא 1, ותאי אנדותל 2 קינאז 2 רמות mRNA. מציע כי פרוטוקול זה יכול להפחית מאוד את ההפרעות של תאים אחרים בכבד.
לאחר ציפוי רמות ASGR1 ו- ASGR2 ירדו עם הזמן, אך נותרו דומות לכבד כולו עד לנקודת הזמן של 12 שעות. במיוחד עבור ASGR1. רמת הביטוי של CD81 הקשורה לממברנה הייתה עקבית במשך עד 48 שעות.
לשם השוואה, ביטוי קולטן 4 דמוי אגרה עלה בדרך כלל והפך לגבוה יותר מרמות in vivo לאחר 48 שעות. מבחני רגישות לאינסולין הראו כי אינסולין מקדם באופן משמעותי את הזרחון של שני ה-AKT ב-serine 473. ותיבת מזלג 01 בסרין 256, בהפטוציטים.
המציין את הרגישות של הפטוציטים ראשוניים לאינסולין. רמות החלבון Phosphoenolpyruvate carboxykinase עלו באופן משמעותי לאחר טיפול בגלוקגון. מה שמרמז על כך שמסלול ייצור הגלוקוז הופעל.
הפעלה זו אושרה עוד יותר על ידי ייצור מוגבר של גלוקוז. ועם ממריצים אחרים לייצור גלוקוז כמו פורסקולין+IBMX. פרוטוקול זה יכול לחסוך גם זמן וגם אנרגיה למחקרים באמצעות הפטוציטים ראשוניים של עכברים.
בעקבות פרוטוקול זה, ניתן לבצע ניסויים קשורים כגון חילוף החומרים ההיפותטי של הגלוקוז ובדיקות סמנים ביולוגיים פרמצבטיים.
