Det overordnede målet med denne protokollen er uttrykksscreening av flere konstruksjoner av protein arginin metyltransferaser i storskala produksjon for å oppnå milligrammengden av proteinet for biokjemisk, biofysisk og strukturelle studier i middels støttet, kostnadseffektiv modus i dekningen av uttrykksplattform S, baculovirusuttrykksvektorsystem. Dr.Alma Seitova vil presentere følgende trinn. Fortynn de eksponentielt voksende SF9-cellene til den endelige celletettheten på 0,4 millioner per mil i det serumfrie insektmediet, og hell i det sterile reagensreservoaret.
Bruk en programmerbar flerkanals pipette til å frø 0,5 mil av de fortynnede SF9-cellene til hver brønn av 24-brønnsplaten. Dette volumet er nok til å sikre jevn dekning av brønnens arbeidsflate. Samtidig fortynner det ikke transfeksjonsblandingen for mye, noe som muliggjør transfeksjonseffektivitet.
Merk en brønn av platen som bare celle, og bruk den som en kontroll for sammenligning av den transfekterte og ikke-transfekterte cellen for å vurdere for potensielle tegn på infeksjon. Inkuber platene ved 27 grader til det trengs, omtrent en time, for å la cellene feste seg til cellekulturplatene. Fortynn godt blandet transfeksjonsreagens i det unsupplementerte insektmediet og et sterilt reagensreservoar, og bland forsiktig i 10 sekunder.
Bruk en 12-kanals pipette og overfør 102 mikroliter av det fortynnede transaksjonsreagenset til en steril 96 MicroWell-plate. Overfør 10 mikroliter 0,2 mikrogram per mikroliter rekombinant bacmid DNA til den tilsvarende brønnen til den 96-brønns MicroWell-platen og bland ved å riste forsiktig og banke platen fra sidene. Inkuber transfeksjonsblandingen i 15 til 20 minutter for en kompleks formasjon.
Bruk en justerbar sekskanals pipette designet for overføring mellom en 96- og 24-brønnsplate, overlegg transfeksjonsblandingen på cellene drop-wise i tilsvarende brønner på transfeksjonsplatene, og inkuber i fire timer ved 27 grader. For å sikre jevn fordeling av transfeksjonsblandingen over cellenes monolayer, rock platene forsiktig frem og tilbake flere ganger i inkubasjonstiden. Fire til fem timer etter transfeksjonstid, legg til 1,5 mil serumfrie insektmedier.
Suppler det med 10% endelig av varmeinaktivert foster bovint serum og 1% antibiotika og antimykotisk. Inkuber celler i en 27-graders inkubator i 72 til 96 timer. Gyng transfekksjonsplatene forsiktig en gang om dagen når det er mulig.
Se etter tegn på infeksjon tydelig i transfekterte celler ved 72 til 96 timer etter transfeksjonstid. Fire til fem dager etter transfeksjon bør tegn på infeksjon være tydelig i de transfekterte cellene i forhold til kontrollcellene under et invertert mikroskop, og de første rekombinante baculovirusene som utskilles i cellekulturmediet, bør være klare til å samle seg. Bruk en programmerbar elektronisk flerkanals for å tillate samtidig innsamling av P1-virus, infeksjon av nyseedede SF9-celler i infeksjon av suspensjonsceller i sine 24 brønnblokker med 150 mikroliter P1-virus.
Spinn ned resten av de kollektive P1-viruslagrene i 15 minutter, dekk de 24 brønnblokkene med suspensjonskulturen til de infiserte SF9-cellene med et AirPore-ark. Inkuber 24 brønnblokken ved 27 grader med risting ved 245 RPMer i 72 til 96 timer. Fire dager før planlagt produksjonstid, splitt eksponentielt voksende SF9 celler, på en endelig celle tetthet på 2 millioner per mil i Erlenmeyer glass shake floss med baffles i serumfrie insektmedier som inneholder 1% endelig antibiotika og antimykotisk.
Dette trinnet vil generere suspensjonskultur av infiserte insektceller og P2-virus i supernatanten for infeksjon av nye celler i produksjonspartiet. Legg til de tilsvarende P2-virusene og inkuber infiserte celler ved lavere temperatur på 25 grader for å bremse celleveksten, rist på 165 RPMer på en orbital shaker med ett tomme slag. Fire dager før planlagt produksjonstid, Frø to liter eksponentielt voksende SF9 celler i insektsserumfrie medier til celletettheten på 1 million per mil, i 2,8 liter Fernbach shake kolbe.
Rist kolben på 27 grader med risting ved 150 RPMer. Forsker Ashley Hutchinson vil demonstrere følgende protokoll. Del fire liter eksponentielt voksende SF9-celler og insektsserumfrie medier til den endelige celletettheten på 4 millioner per mil i de store fem liter reagensflaskene.
Tilsett 10 til 12 mil av suspensjonskulturen til de baculovirus infiserte insektcellene. Inkuber den infiserte kulturen til SF9-cellene i en shaker som rister ut 145 RPM ved en lavere temperatur på 25 grader Celsius i 72 til 96 timer. Milligram mengder av flere rekombinante proteiner fra PRMT-familien uttrykker i baculovirus umiddelbar produksjon i SF9 celler brukes til biokjemiske biofysiske instruksjonsstudier, som det fremgår av figur fem.
Ved SGC ble krystallstrukturer løst i deponert i proteindatabanken for full lengde eller avkortede former for proteinene PRMT4, 6, 7 og 9 med ulike kjemiske sonder og hemmere. Uttrykksplasmider for disse PRMT-ene ble deponert for å legge til gensamling av SGC og er tilgjengelige for forskningsmiljøet. I denne videoen har vi lagt vekt på viktige elementer for vellykket ekspedisjonsscreening av deres multippel konstruksjon av proteinet arginin metyltransferaser i storskalaproduksjonen i baculovirusuttrykkssystemet.
Bruk av de vanlige justerbare og programmerbare flerkanals pipettene gjorde hele prosessen raskere enn effektiv. Bruk av høy ytelse og mindre celletoksisk for cellene, transfeksjonsreagens for generering av rekombinante virus førte til mer kostnadseffektiv og denne cellehåndteringstransfeksjonsprotokollen. Infeksjon av storskala batch for proteinproduksjon med suspensjonskultur av baculovirus smittet i seks celler reduserte arbeidet betydelig i tidkrevende trinn i vital startforsterkning.
Er for eksempel sentrifugering dette med spesiell kultur av infiserte celler. Det er selvfølgelig i utelukket ekstra håndtering av de infiserte cellene i unngå i deres strammere i virusforringelse. Suspensjon kultur kultur celle vedlikehold i denne skalaen opp produksjonen i kulturfartøyet var høyt feltvolum hjelpe oss å overvinne begrensning av produksjonsvolumet og vedta en storskala plattform.
Dette er svært nyttig for laboratoriene uten tilgang til bioreaktorer eller begrenset plass i produksjonsrørledningen. Selv om vår protokoll er beskrevet for proteinene i proteinet arginin metyltransferaser familien, kan den samme tilnærmingen brukes på andre proteiner familie som krever uttrykk plattform for å oppnå en tilstrekkelig mengde av deres protein for biokjemiske biofysiske instruksjonsstudier.
