Bu protokol, model türü Arabidopsisthaliana'nın fonksiyonel genomiklerinde temel bir adım olan tohum yüzey sterilizasyonunu geliştirir. Bu tekniğin ana avantajları, günde yüzlerce numunenin işlenmesine izin vererek kolaylık ve yüksek verimdir. Bazı basit değişikliklerle, bu yöntem diğer birçok model ve model olmayan bitki türüne uygulanabilir.
İlk kez kullananlar için, her ikisi de tohum hayatta kalmak için kritik olduğu için lütfen ortamın sıcaklığına ve santrifüj hızına dikkat edin. Başlamak için, damıtılmış suya% 95 teknik etanol ekleyerek ve iyice karıştırarak% 70 etanol hazırlayın. Daha sonra, 95 mililitre steril damıtılmış suya beş mililitre ev tipi çamaşır suyu ekleyerek% 5 çamaşır suyu çözeltisi hazırlayın.
Ardından, çamaşır suyu çözeltisine birkaç damla noyonik deterjan ekleyin ve iyice karıştırın. Daha sonra, 800 mililitre damıtılmış suya vitaminler ve 10 gram sakkaroz dahil olmak üzere 2,2 gram MS orta tozu ekleyerek yarı mukavemetli Murashige ve Skoog ortamını hazırlayın. Bir azı dişi potasyum hidroksit kullanarak ortamın pH'ını 5,7'ye ayarlayın, ardından damıtılmış su kullanarak hacmi bir litreye kadar getirin.
Aliquot 500 mililitrelik ortamı bir litrelik bir şişeye ekleyin ve katı bir ortam hazırlamak için dört gram agar ekleyin. Otoklavlamadan sonra, ortamın bir su banyosunda 50 ila 53 santigrat dereceye kadar soğumasını bekleyin. Daha sonra laminar akış başlığının altındaki Petri tabaklarına dökün.
Seçici ortam hazırlamak için, ortama kanamycin ekleyin ve daha önce gösterildiği gibi Petri tabaklarına dökün. Aspiratörü kurmak için vakum pompası girişini uygun boyutta bir polietilen tüpün bir ucuna bağlayın. Daha sonra tüpün diğer ucunu kaynatma şişesinin iki yönlü kapağının çıkışına bağlayın.
Hava geçirmez bağlantı sağlamak için borunun kavşağını bir sızdırmazlık filmi ile sıkıca sarın. Daha sonra, kaynatma şişeslerindeki vida kapağının girişine ikinci bir polietilen tüp bağlayın. Daha sonra tüpün diğer tarafını ince bir polietilen tüple donatılmış bir akvaryum valfinin çıkışına bağlayın.
Gerekirse, hava kaçağını ortadan kaldırmak için kavşağı sızdırmazlık filmi ile sarın. progresif sayılara sahip 48 adet 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpünden oluşan iki partiyi etiketledikten sonra, 96 steril mikrosantrifüj tüpünün her birine, tüpün konik ucunun dibinden yaklaşık bir ila iki milimetre yukarıda 100 ila 200 Arabidopsis tohumu ekleyin. Daha sonra, 10 mililitrelik steril serolojik pipet kullanarak, her tüpe yaklaşık bir mililitre% 70 etanol ekleyin ve kapakları dikkatlice kapatın.
Tüpleri sekiz hertz salınım frekansında üç dakika çalkala. Ardından adaptörleri çalkalayıcıdan çıkarın ve darbe işlevini kullanarak tohumları döndürmek için bir tezgah üstü mikrosantrifüj sepetine aktarın. Tüpleri bir rafa aktardıktan sonra, laminer akış başlığının altındaki tüm tüpleri açın.
Kirlenmeyi önlemek için kapakların borulara sığan kısmına dokunmayın. Daha sonra, laminar akış başlığının altına, ev yapımı aspiratörün akvaryum valf girişine steril 200 mikroliter sarı bir uç takın ve pompayı kapatın. Sıvıyı emerken tohumlara dokunmamak için ucu tohumların seviyesinin hemen üzerine yerleştirin.
Daha sonra, 10 mililitre steril serolojik pipet kullanarak, her tüpe bir mililitre% 5 çamaşır suyu çözeltisi. Tüpleri çalkalayıcı adaptörlere geri yerleştirmeden önce kapakları kapatın, ardından tüpleri daha önce gösterildiği gibi çalkalayın. Bir tezgah üstü santrifüjün darbe işlevini kullanarak tohumları aşağı döndürdükten sonra, akvaryum valfine yeni bir steril 200 mikroliter sarı uç takın ve pompayı kapatın.
Çamaşır suyu çözeltisini emerken tohumlara dokunmamak için ucu tohumların seviyesinin üzerine yerleştirin. Daha sonra, 10 mililitre steril serolojik pipet kullanarak, her tüpe bir mililitre sterilize su aliquot. Akvaryum vanasına yeni bir steril 200 mikroliter sarı uç sığdırduktan sonra pompayı kapatın.
Suyu emerken tohumlara dokunmamak için ucu tohumların seviyesinin hemen üzerine yerleştirin. Son olarak, her tüpe 500 mikrolitre sterilize su aliquot ve laminer akış davlumbazındaki tüm kapakları kapatın. Tohumlar ekilmeye hazır.
Gerekirse, tüpleri birkaç saate kadar veya gece boyunca dört santigrat dereceye kadar oda sıcaklığında tutun. Bir mililitre pipet kullanarak, tohumları 300 ila 400 mikrolitre steril su ile bir Petri kabına aktarın. 10 tüp aktardıktan sonra, her tabağa antibiyotiksiz 1,5 ila iki mililitre erimiş yarı mukavemetli Murashige ve Skoog ortamı dökün.
Tohumları dağıtmak için tabağı hızla döndürün ve plakaları karşı taraflara bantlayın. Plakaları plastik veya alüminyum folyoya sarın ve düzgün çimlenme elde etmek için karanlıkta üç gün boyunca bir buzdolabına yerleştirin. İkinci, üçüncü, dördüncü ve yedi günlerinde yapılan çimlenme analizleri% 70 etanol ile 10 ila 40 dakikalık sterilizasyon süresi arasında önemli bir fark olmadığını gösterdi.
Ancak sterilizasyon süresi 40 dakikayı aştığında çimlenme oranları düştü. Buna bağlı olarak yeşil cotyledon ortaya çıkış oranları da azaldı. Çalışmaya dayanarak, tohumları sterilize etmek için minimum süre olarak% 70 etanol için üç dakika ve% 5 çamaşır suyu için üç dakika seçildi.
Başlangıçta kullanılan tohumların mikroorganizmalarla kontamine olduğunu göstermek için, steril olmayan tohumlar doğrudan plakalara ekildi. Steril tohumlara kıyasla, steril olmayan tohumlar iki gün sonra yedi günlük çimlenmeden sonra plakaların her yerine yayılan bir mantar görünümü gösterdi. Farklı tohum örneklerini işlemek için tek bir steril pipet ucu kullanılarak gerçekleştirilen çapraz kontaminasyon tahlilinde, kanamycinli plakalara ekilen Columbia-0 genotip tohumlarında yeşil kartyledon görülmediğini göstermiştir.
Buna paralel olarak, kanamycin içermeyen plakalarda ekilen Columbia-0 tohumlarında, çimlenmeden sonra tüm cotyledons yeşil göründü. Bu sonuçlar, steril çözeltiyi çıkarmak için tek bir pipet ucu kullanmasına rağmen numuneler arasında kontaminasyon taşımadığını göstermektedir. Bu prosedür, gen aşırı ekspresyonu, genom düzenleme, hücre altı lokalizasyon, promotör aktivitesi ve protein-protein ve protein-DNA etkileşimleri gibi diğer birçok fonksiyonel genomik yöntemin temelidir.
