Name: paramagnetic relaxation enhancement for detecting and characterizing self-associations of intrinsically disordered proteins
Uploaded: 2021-09-23T15:00:00
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ジンファ・イン博士とクリスティン・カノ博士の有益な議論と技術支援に感謝します。DSLは聖バルドリック奨学生であり、聖バルドリック財団(634706)の支援を認めています。この研究の一部は、ウェルチ財団(AQ-2001-20190330)からDSL、Max and Minnie Tomerlin Voelcker Fund(Voelcker Foundation Young Investigator Grant to DSL)、UTHSA Startup Up FundsからDSL、Greehey Graduate Fellowship in Children's HealthからCNJに支援されました。この研究は、テキサス大学サンアントニオ校健康科学センターの機関研究コアの一部である構造生物学コア施設で実施された研究に基づいており、研究担当副学長室およびメイズがんセンターの創薬および構造生物学共有リソース(NIH P30 CA054174)。

プロトコルの一般的な要件:タンパク質精製施設、UV-Vis分光計、高磁場NMR分光計および操作ソフトウェア、以下を含む後処理分析ソフトウェア。NMRPipe32, Sparky33, (または CCPN Analysis 34, or NMRViewJ35).
1. PRE測定のためのタンパク質の組換え発現と精製
<ol><li>単一のシステイン残基が存在するように目的のタ...

PREを用いて、天然変性タンパク質と様々な結合パートナーとの間の低集団に存在する一過性相互作用を特徴付ける方法が提示されている。示されている例では、タンパク質は自己会合性であるため、PREは分子間相互作用と分子内相互作用の組み合わせから生じる可能性があります。この方法は、2つの異なるタンパク質間の相互作用を特徴付けることができる不均一なサンプルに容易に拡張で...

内因性障害(ID)は、安定した二次構造または三次構造に自発的に折りたたまれないが生物学的に活性であるタンパク質(IDP)またはタンパク質内の領域(IDR)を表します。一般に、IDP/IDRの機能は、生理学的条件1で生体分子との特異的でありながら可逆的な相互作用を促進することです。したがって、IDPおよびIDRは、多タンパク質複合体の動員、組織化、および安定化、例えば、スプライソソーム2の組み立ておよび活性、DNA損傷部位における成分の動員および組織化3、転写複合体4、またはクロマチンリモデリングBAF5の組織化および安定化を含む、様々な細胞機能に関与している.さらに、IDPはシグナル伝達ネクサスに見られ、異なる結合パートナーとの乱交により、細胞タンパク質ネットワークを介した情報伝達を媒介することができます6。最近の研究では、IDR領域が液-液相分離のプロセスを通じて生体分子凝縮物を自己会合形成する傾向も明らかになりました7。IDを含む前述の機能の多くは、現在、凝縮物形成8のいくつかの側面を含むと考えられています。生体分子複合体の組み立て、安定化、足場、およびシグナル伝達にとってIDは重要であるにもかかわらず、IDPおよびIDRは通常、X線結晶構造解析または極低温電子顕微鏡を使用した構造調査に適していないため、それらの特異的相互作用の原子の詳細を特定することは困難です。
核磁気共鳴(NMR)は、剛直または均質な構造アンサンブルの存在に依存せず、個々の原子核の直接の局所環境を報告するため、IDを調べるための理想的な手法です。所与の分子内の原子核の共鳴周波数または化学シフトは、局所的な電子分布によって誘発される弱い磁場の影響を受け、結合長、角度、他の原子核の近さ、結合パートナーとの相互作用、およびその他の要因に依存します9。したがって、各核は、その局所的な化学環境の変化に敏感な独自の部位特異的構造プローブとして機能します。これらの利点にもかかわらず、NMRはバルク技術であり、観測された化学シフトは特定の核によってサンプリングされたすべての環境の平均です。この号で取り上げるNMR技術の多くは、平均化された化学シフトに含まれる高エネルギーで人口の少ない生体分子立体構造に関する構造的、動的、および速度論的情報を回復するために開発されました10,11。一過性に人口が存在しますが、これらの状態の同定と定量化は、機能メカニズムの詳細を決定するために重要です12。例えば、IDPおよびIDRの場合、立体配座アンサンブルは、生理学的結合パートナーとの遭遇複合体の形成に生産的である立体配座を優先的にサンプリングするように偏っている可能性がある。これらの状態の検出、ならびに残基特異的な分子間および分子内相互作用およびダイナミクスの同定は、タンパク質機能と複合体形成の根底にある構造メカニズムを決定するために重要です。
常磁性緩和増強(PRE)NMRを使用して、IDP/IDRを介した生体分子複合体の形成に重要な過渡的で人口の少ない状態を調べるためのプロトコルについて説明します13。このアプローチは、α-シヌクレイン14,15からのアミロイド線維の集合やFUS 16の自己会合を促進するような一過性のタンパク質間相互作用の研究や、シグナル伝達タンパク質間などの特定のタンパク質間相互作用を特徴付けるのに役立ちます17。自己会合性IDPの例が提示され、特定の分子間および分子内相互作用が優先的に圧縮された状態をもたらし、自己会合を促進する部位特異的相互作用をもたらします。
PREは、原子核から常磁性中心への磁気双極子相互作用から等方性gテンソルで生じ、一般にニトロキシド基上の不対電子の形で、または常磁性金属原子として供給されます18(図1)。異方性のgテンソルを持つ原子もPRE効果を生じますが、これらの系の解析は、擬似接触シフト(PCS)または残留双極子結合(RDC)によって引き起こされる交絡効果のためにより困難です13,19。原子核と常磁性中心との間の相互作用の強さは、両者の間の<r-6>距離に依存する。この相互作用は核緩和率の増加をもたらし、不対電子の磁気モーメントが非常に強いため、長距離相互作用(~10-35 Å)でも検出可能な線の広がりを引き起こします20,21。PREによる過渡状態の検出は、次の2つの条件が満たされている場合に可能です。(1)過渡的相互作用はNMRタイムスケールで高速交換中である(観察された化学シフトは交換状態の集団加重平均である)。(2)原子核から常磁性中心までの距離は、過渡的な人口状態の方が主状態11よりも短い。横PREはΓ2と表され、実用的な目的のために、常磁性中心を含むサンプルと反磁性コントロールとの間の1H横緩和率の差から計算されます。PREの理論と、高速交換レジームと低速交換レジームにおける関連する疑似接触シフトの詳細な扱いについては、読者はCloreと同僚による包括的なレビューを参照します13,22。ここでは、1H N-Γ2が高速交換レジームにある状況のみが考慮され、PREのr-6依存性のために、観測された緩和率は、常磁性中心が核に近づく距離とそのコンフォメーションに費やす時間の両方に関連しています。したがって、近接アプローチを伴わない過渡配座は小さなPREを生成し、より近い相互作用は、たとえ短命であっても、より大きなPREを生成します。
IDPの場合、PREは、単一分子内(分子内)および別々の分子間(分子間)で発生する相互作用を測定および区別するために使用されます。NMR可視(例えば、15N標識)またはNMR不可視(例えば、天然存在比14N)タンパク質に常磁性中心を結合させることにより、PREの供給源(分子間または分子内)を決定することができます(図2)。システイン残基を導入する部位特異的突然変異誘発は、常磁性中心(スピン標識)をタンパク質23に結合させるための便利なアプローチである。スピン標識として使用するために、金属キレート化(EDTAベース)およびフリーラジカル(ニトロキシドベース)を含むいくつかのタイプの分子が提案されています24。さまざまなニトロキシドスピン標識が記載されており、メタンチオスルホン酸塩、マレイミド、ヨードアセトアミドなどのさまざまなシステイン反応性化学物質で利用できます25,26(図1)。タグまたはリンカーの固有の柔軟性は、特定の分析にとって問題となる可能性があり、このような状況では、かさばる化学基を追加したり、タグをタンパク質に固定するための第2のリンカーの使用(2部位の結合)など、タグの動きを制限するためのさまざまな戦略が提案されています27。28。さらに、市販のタグはジアステレオマータンパク質を含み得るが、一般にこれは観察されたPRE29に寄与しないであろう。マレイミド化学を介して遊離システインに結合した3-マレイミド-PROXYLの使用は、容易に入手可能で、費用効果が高く、非可逆的であり、還元剤トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)が標識反応全体を通して溶液中に維持できるため、説明されています。3-Maleimido-PROXYLは等方性のgテンソルを有するため、PCSまたはRDCは誘導されず、常磁性および反磁性サンプルの両方に同じ化学シフト割り当てを使用することができる13。
1HN−T 2は、8〜12の時点30からなる完全な進化系列を収集するのと同じくらい正確であることが以前に示されている2つの時点戦略(Ta、Tb)を使用して測定される。第1の時点(Ta)は、実用可能な限りゼロに近く設定され、第2の時点の最適な長さは、所与の試料について予想される最大PREの大きさに依存し、Tb ~ 1.15/(R2,dia + Γ2)から推定することができ、ここでR2,diaは反磁性試料13のR2を表す。最大のPREの大きさが不明な場合は、Tbをタンパク質の1H T2の~1倍に設定することが適切な初期推定値であり、T2を調整してS/N比を改善することによってさらに最適化されます。この2点測定戦略は、PRESの測定に必要な実験時間を大幅に短縮し、特に分子間の非特異的接触の影響を最小限に抑えるために比較的希薄なサンプルが使用されるため、より多くのシグナル平均化のための時間を可能にします。HSQCベースのパルスシーケンスは、1HN−T2を測定するために使用され、他の場所で詳細に説明されている30。感度を向上させるために、順方向および後方のINEPT転送のハードパルスを成形パルスに置き換えることができます。あるいは、配列は、TROSYベースの読み出し31に容易に変換される。IDPは通常、横方向の緩和速度がはるかに長いため、同様のサイズの球状タンパク質よりも(固有の障害のために)線幅が狭くなるため、間接次元での長い取得時間を使用して、スペクトル分解能を向上させ、IDPに固有の化学シフト分散の制限を緩和できます。
PREは、タンパク質間およびタンパク質間相互作用、特に一過性または人口の少ない相互作用を研究するための有用なツールです。タンパク質精製、部位特異的スピン標識、パルスプログラムの設定とキャリブレーション、NMRデータの処理と解釈の手順など、PREの測定に適したNMRサンプルを調製するための詳細なプロトコルが提供されています。サンプル濃度、スピン標識の選択、常磁性成分の除去など、データ品質と実験結果に影響を与える可能性のある重要な実験上の考慮事項が全体を通して注目されています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m and 0.22 &#181;m syringe filters</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLHVM33RS 
			SLGVR33RS</td>
			<td>Filter lysate before first purification step and before size exclusion chromatography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri Dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>Agar plates for bacterial transformation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14N Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>576794</td>
			<td>Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>299251</td>
			<td>Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 L Fernbach baffled flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431523</td>
			<td>Bacterial expression culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Maleimido-Proxyl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>253375</td>
			<td>Nitroxide spin label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Solution/protein storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon centrifugal filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC900308</td>
			<td>Protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillan</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5354</td>
			<td>Antibiotic for a selective marker, exact choice depends on the expression construct plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Oahus</td>
			<td>30061978</td>
			<td>Explorer Pro, for weighing reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>AX1775</td>
			<td>Reduces nitroxide spin label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterilize glassware and culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>010-1459</td>
			<td>Harvest E. coli cells after recombinant protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, hand-crank</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>0241C68</td>
			<td>Boekel hand-driven, low-speed centrifuge with 15 mL buckets that can accommodate NMR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelex 100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7901</td>
			<td>Remove contaminating paramagnetic compounds from buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer workstation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Linux or Mac OS compatable with NMR data processing and analysis software packages such as NMRPipe and Sparky</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td>Needed for NMR lock signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9434</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ellman&#39;s reagent (5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22582</td>
			<td>Quantification of free cystiene residues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3114-0050</td>
			<td>Used to clear bacterial lysate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-field NMR instrument (600 - 800 MHz)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Equiped with a multichannel cryogenic probe and temperature control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAC column, HisTrap FF</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>17528601</td>
			<td>Initial fractionation of crude bacterial lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl B-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td>Induces protein expression for genes under control of lac operator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22700025</td>
			<td>Items are used for transforming E. coli to express protein of interest, substitions for any of these items with like products is acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12780052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-pressure chromatography system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7318300</td>
			<td>BioRad BioLogic is used for low-pressure chomatograph such as running IMAC columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium pressure chromatography system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7880007</td>
			<td>BioRad NGC equipped with a multi-wavelength detector, pH and conductivity monitors, and automatic fraction collector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM vitamin solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6895</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidizer</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td>Provides rapid and efficient bacterial cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated set of micropippetters with properly fitting disposable tips (available from multiple manufacturers e.g. Eppendorf)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monobasic potassium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1551139</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR pipettes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>255688</td>
			<td>To remove sample from NMR tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR sample tube</td>
			<td>NewEra</td>
			<td>NE-SL5</td>
			<td>Suitable for high-field NMR spectrometers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparative Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Avanti J-HC</td>
			<td>Harvest E. coli cells after recombinant protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom polystyrene centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td>Clear bacterial lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>S44I200005</td>
			<td>Temperature controlled growth of E. coli starter and expression cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicating water bath and vacuum source</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Used to degas buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>FB505110</td>
			<td>Used for bacterial cell lysis or shearing bacterial DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>OD600 Diluphotometer</td>
			<td>Monitor growth of E.coli protein expression cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 16/600 size exculsion colum</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>28989333</td>
			<td>Final protein purification step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topspin software, version 3.2 or later</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Operating software for the NMR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transformation competent E. coli cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C600003</td>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3) chemically competent E. coli, other strains may be compatable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20490</td>
			<td>Reducing agent compatable with some sulfhydryl-reactive conjugations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>NP80</td>
			<td>Measure protein concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, temperature controlled</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>FSGPD25</td>
			<td>For heat shock step of bacterial transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y1625</td>
			<td>For supplementing M9 media if required</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paramagnetic relaxation enhancement for detecting and characterizing self-associations of intrinsically disordered proteins

天然変性タンパク質およびタンパク質内の天然変性領域は、ヒトプロテオームの大きく機能的に重要な部分を構成しています。これらの配列の柔軟性が高いため、多様な生体分子パートナーと弱く、長距離で、一過性の相互作用を形成することができます。特異的でありながら親和性の低い相互作用は、無差別結合を促進し、単一の天然変性セグメントが多数の標的部位と相互作用することを可能にします。これらの相互作用は一過性であるため、タンパク質に依存して単一の優勢な立体配座を形成する構造生物学的手法では、それらを特徴付けるのが難しい場合があります。常磁性緩和増強NMRは、弱い相互作用や過渡的相互作用の構造的基盤を同定し、定義するための有用なツールです。常磁性緩和増強を使用して、天然変性タンパク質とそのタンパク質、核酸、または他の生体分子パートナーとの間に形成される低人口エンカウンター複合体を特徴付けるための詳細なプロトコルが記載されている。

RNA結合タンパク質EWSR142の低複雑性ドメインに由来する自己会合性天然変性フラグメント(残基171-264)に分子内1H N-Γ2 PREを記録しました(図3)。スピン標識付着点に連続して近接する残基(例えば、図3の残基178または260)は、有意に広がることが予想され、スペクトルでは検出できません。付着点から連続...

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Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins

天然変性タンパク質の弱く一過性の分子間および分子内相互作用を検出するための常磁性緩和増強NMR分光法の適用のためのプロトコルが提示されています。

天然的に無秩序なタンパク質の自己会合の検出と特性評価のための常磁性緩和増強

Intrinsically disordered proteins and intrinsically disordered regions within proteins make up a large and functionally significant part of the human ...

常磁性緩和増強技術は、分子間距離を特徴付けて測定し、一過性および/または人口の少ない生体分子相互作用を定量化するために利用できます。ここでは、この手法を適用して、タンパク質の凝縮に先行する相互作用をキャプチャしました。PREの感度により、他のNMR技術では目に見えず、アクセスできない動的状態の原子分解能の同定、検出、定量が可能になります。このプロトコルの重要なステップには、非共役ニトロキシドスピン標識の除去と、ピーク高さを正確に測定するためのスペクトルの慎重な分析が含まれます。さらに、NMR実験のセットアップとパルスキャリブレーションの際には注意が必要です。まず、ストック溶液から目的の15N同位体標識タンパク質の20倍モル過剰で3-マレイミド-PROXYLを加えます。室温または摂氏4度で、光と酸素から保護し、穏やかな揺り動かしまたは栄養補給しながら一晩インキュベートします。翌日、タンパク質サンプルの広範な透析またはゲルろ過を使用して、非特異的溶媒PREを防ぐために、非反応フリースピン標識を除去します。次に、Ellman試薬を使用して、溶液中の遊離スルフヒドリル基を定量します。マイクロプレートリーダーで吸光度を測定し、検量線を作成します。分子内PREを測定するには、NMRに適したバッファー中で、15N同位体濃縮スピン標識タンパク質を100マイクロモル以上300マイクロモル以下の濃度に調製します。次に、ロングステムガラスピペットまたはマイクロピペットを使用して、NMRサンプルを高磁場磁石での使用に適した5ミリメートルNMRチューブに移します。サンプルを磁石に入れます。lockコマンドを使用して重水素信号をロックし、施設のプロトコルに従ってプロトンチャネルを調整して一致させます。次に、トップシムサブルーチンを使用してシムを調整し、溶媒シグナル抑制を最適化します。次に、P-OPTプログラムを使用してプロトンパルスを校正します。次に、標準サンプルに対して15Nパルスを校正します。シェーピングパルスの正しい減衰を決定するには、シェイプツールサブルーチンを使用します。次に、フォルダアイコンをクリックして、適切なパルス形状ファイルを開きます。成形パルスは、取得パラメータのパルスパラメータセクションにあります。パルス定義ファイルをロードしたら、「波形の解析」、「形状の統合」の順にクリックします。校正済みのプロトン90度ハードパルス、希望形状パルス長、および回転を入力します。次に、校正された90度パルスの減衰に電力レベルの変化を加えて、成形パルスの電力レベルを計算します。標準プロトン15N HSQCを記録して、掃引幅、キャリア周波数を最適化し、水抑制を確認します。最後に、SW[SW]コマンドと[TD]コマンドを使用して、または適切なダイアログ ボックスで直接、スイープ幅と間接寸法増分数を調整します。前に示したように、成形パルスを校正します。次に、[集録パラメータ]タブの[パルスパラメータ]セクションに校正済みのパルス長を入力します。2時間遅延点アプローチを使用してアミドプロトンT2を測定するには、VDリストファイルを編集して時間遅延を設定します。最初の遅延は 0.01 ミリ秒に設定されます。予想される最大PREとの関係を使用して、2番目の遅延を選択します。次に、第1および第2の遅延スペクトルの第1の増分を比較し、信号がその初期値の40〜50%の間に減衰するように第2の遅延を調整することによって、適切な値を決定する。十分な信号平均化のために、記録する複素点の数とスキャンの数を決定します。次に、コマンドEXPTを使用して実験時間を計算し、コマンドZGで実験を開始します。アスコルビン酸ナトリウムをNMRバッファーに溶解した後、元のNMRバッファーと一致するようにpHを調整します。次に、チューブの縁の下に液滴を置いて、スピン標識の濃度の10倍を超える過剰モルでアスコルビン酸をNMRチューブに加えます。チューブに蓋をし、慎重に反転させて混ぜます。ハンドクランク遠心分離機で200〜400 Gで10〜20秒間回転させ、チューブの底にサンプルを沈降させます。チューブをホイルで包んだ後、反応を少なくとも3時間進行させます。次に、常磁性サンプルに使用したのと同じパラメーターを使用して、反磁性サンプルにアミドプロトンT2を記録します。分子内アミドプロトンガンマPREは、RNA結合タンパク質EWSR1の低複雑性ドメインに由来する自己会合性の天然変性断片上に記録されました。スピンラベル付着点に連続して近接する残基は、大幅に広がることが予想され、スペクトルでは検出できません。付着点から順次間隔を空けているが増強ガンマを示した残基は、スピン標識に空間的に近かった。天然変性タンパク質の場合、ピューレを記録および分析すると、分子内接触および一過性相互作用表面に関する情報が得られます。PRE測定を動的光散乱、サイズ排除クロマトグラフィー、分析超遠心分離、計算方法などの他の生物物理学的方法と組み合わせることで、より深い洞察を得ることができます。PRE測定は、過渡的な人口の少ない状態を特徴付けるのに役立ちます。このアプローチは、分子認識、アロステリック立体配座選択、相分離による膜のないオルガネラの組み立てを含むアセンブリプロセスなど、無数の生物学的プロセスに重要な相互作用を特徴付けるために拡張できます。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

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15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

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