Las bacterias intestinales pueden afectar múltiples procesos fisiológicos de los insectos huéspedes. Preparar y mantener larvas axénicas es una herramienta poderosa para estudiar las funciones de las bacterias intestinales. Las principales ventajas de este protocolo son que el cultivo de tejido vegetal se utiliza para obtener hojas libres de gérmenes para criar insectos comedores de hojas axénicas derivadas de huevos esterilizados en superficie, y que este método no está restringido por dietas artificiales.
Este método es conveniente y aumenta la visibilidad del mantenimiento de insectos axénicos para futuros estudios de bacterias intestinales, especialmente para insectos no modelo sin dietas artificiales bien desarrolladas. Mantener la población de P.versicolora en una cámara de crecimiento a 27 grados centígrados y 70% de humedad relativa, con un fotoperiodo de luz de 16 horas y ocho horas de oscuridad. Coloque los insectos en cajas de plástico perforadas con papel absorbente húmedo inclinado y aliméntelos con ramas de álamo frescas.
Rocíe agua limpia sobre el papel absorbente para mantener la humedad y cambie las ramas cada dos días. Aísle a los adultos para la oviposición después de la pupación y aliméntelos con hojas tiernas para obtener más huevos. Dentro de las 24 horas, recoja los huevos recién puestos y colóquelos en papel absorbente húmedo durante 60 horas para preparar las larvas axénicas.
Prepare el medio MS en un miligramo por mililitro de ácido acético alfa-naftaleno o soluciones madre naA. En una campana de bioseguridad, agregue 50 microlitros de la solución madre naA a 500 mililitros de medio MS y agite para mezclar bien. Luego vierta aproximadamente 50 mililitros por recipiente de cultivo de tejidos y espere la solidificación.
Esteriliza bisturíes y fórceps en una lámpara de alcohol en llamas en la campana de bioseguridad. Cortar segmentos de tallo de tres a cuatro centímetros con yemas apicales o yemas laterales de plántulas de álamo aproximadamente al mes de crecimiento, e insertarlos en el medio de cultivo, uno o dos segmentos de tallo por contenedor. Incubar estos segmentos del tallo en una cámara de crecimiento durante aproximadamente 30 días.
Y use estas hojas libres de gérmenes para alimentar a las larvas axénicas. Placas de Petri en autoclave, pinceles, papel de filtro, agua destilada en una placa de Petri que contenga medio de agar LB. Coloque las hojas con huevos adherentes en una placa de Petri.
Luego retire cuidadosamente los huevos de las hojas usando fórceps y transfiéralos a otra placa de Petri. Lave estos huevos con etanol al 75% durante ocho minutos. Luego repita el lavado cuatro veces con agua estéril.
Transfiera los huevos al medio de agar LB para preservar la humedad para la eclosión. Coloque la placa de Petri en una cámara de crecimiento y espere a que los huevos eclosionen dentro de las 24 horas. En una campana de bioseguridad, azulee tres trozos de papel de filtro húmedo en una placa de Petri y coloque hojas de álamo libres de gérmenes en el papel.
Recoge las larvas y colócalas sobre las hojas. Selle la placa de Petri con Parafilm e incube en una cámara de crecimiento. Cambie las hojas cada dos días.
Para los grupos criados convencionalmente, transfiera los huevos de las hojas a una placa de Petri que contenga papel de filtro húmedo y alimente a estas larvas con hojas de álamo libres de gérmenes. Seleccione al azar tres larvas de primer, segundo y tercer instar de los grupos libres de gérmenes y criados convencionalmente. Diseccionar las larvas del tercer instar con tijeras y fórceps estériles bajo un microscopio estereoscópico, y recoger sus tripas en tubos de microcentrífuga.
Recolectar larvas intactas de primer y segundo instar en tubos. Agregue 100 microlitros de PBS y tres bolas de acero a los tubos de 1,5 mililitros, y muela los tejidos en homogeneizados utilizando un homogeneizador de perlas. Agregue 100 microlitros del homogeneizado al medio de agar LB y a la placa usando una varilla de vidrio estéril.
Incubar las placas a 37 grados centígrados durante 24 horas. Luego observe las colonias bacterianas. Extraiga el ADN total de los tejidos obtenidos previamente utilizando un kit de extracción de ADN y mida la concentración de ADN con un espectrofotómetro.
Amplificar el gen bacteriano 16S rRNA utilizando cebadores universales de ARNr 16S con PCR, configurando la reacción como se describe en el manuscrito de texto. Guarde los productos de PCR a cuatro grados centígrados hasta un análisis adicional. Mezcle los productos de PCR con colorante de ácido nucleico y analícelos mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1% en tampón 1X TAE.
Utilice 10 microlitros de un marcador de ADN como referencia. Observe el gel con un transiluminador UV y busque el fragmento objetivo alrededor de 1, 500 pares de bases. Aunque no se observaron colonias bacterianas en ningún grupo libre de gérmenes, se observaron en todos los grupos criados convencionalmente, lo que indica que las larvas de huevos esterilizados que fueron alimentados con hojas de álamo cultivadas en tejidos no contenían bacterias.
Las bandas PCR de 1.500 pares de bases aparecieron en todos los grupos criados convencionalmente. En contraste, no se observó ninguna banda en los grupos libres de gérmenes o el control negativo, lo que implica que no existían bacterias intestinales en las larvas axénicas. Para las especies de insectos con huevos pequeños, los tipos de desinfectantes y la duración de la esterilización debían optimizarse.
Además, los endófitos en plantas cultivadas en tejidos deben ser notables. Este protocolo proporciona un nuevo método para mantener insectos libres de gérmenes, que es una herramienta útil para facilitar los estudios de interacción insecto-bacteria intestinal, especialmente para insectos no modelo sin dietas artificiales bien desarrolladas.
