Nuestro protocolo ayuda a responder las preguntas de cómo el ejercicio físico apoya la homeostasis del organismo. Los sistemas nos permitieron diseccionar los efectos mecánicos directos en el cerebro de las consecuencias complejas de actividades físicas como caminar y trotar. Para comenzar, fije el acelerómetro en la parte superior de la cabeza de una rata con cinta quirúrgica.
Después de la recuperación completa de la anestesia, coloque la rata en la máquina de correr. Ajuste la cinta de correr a una velocidad moderada a 20 metros por minuto. Utilice el software de aplicación para medir la magnitud de las aceleraciones verticales a lo largo de los ejes X, Y y Z cuando la rata está ejecutando la cinta de correr.
Hacer coincidir los valores obtenidos del software con la magnitud en frecuencia de aceleración vertical en el sistema PHM. Preajuste la amplitud de oscilación de la plataforma y la velocidad de rotación de la leva en forma de hélice. Luego coloque el mouse en una posición prona con la cabeza ubicada en el oscilable y el resto del cuerpo en las plataformas estáticas.
Encienda el motor para oscilar la plataforma verticalmente y aplique PHM al ratón. En la caja de plástico transparente, configure la cámara de video a una velocidad de fotogramas de 24 FPS para grabar todo el espacio. A continuación, administre por vía intraperitoneal cinco hidroxitriptófano a un ratón.
Coloque el ratón en el armazón transparente y comience a grabar durante 30 minutos. Revise el video grabado a una velocidad de 0.5x y cuente las contracciones de la cabeza manualmente. Recupere las criosecciones del cerebro del ratón de la caja de diapositivas.
Deje los portaobjetos en toallitas limpias a temperatura ambiente hasta que las muestras se deshidraten por completo. Use una pluma bloqueadora de líquidos para dibujar un círculo alrededor del tejido crioseccionado. Luego agregue la solución TBS-T.
En la parte inferior de una bandeja, coloque toallitas húmedas para crear un ambiente húmedo para los portaobjetos. Después de una permeablización con TBS-T, agregue suero de burro al 4% para bloquear e incubar a temperatura ambiente durante una hora. Enjuague las diapositivas una vez por inmersión en TBS-T durante cinco minutos.
Luego aplique 100 microlitros de anticuerpo primario adecuadamente diluido y una mezcla de dappy en cada portaobjetos. Cubra la bandeja e incube a temperatura ambiente durante la noche. Después de la incubación, enjuague con TBS-T tres veces durante cinco minutos cada una.
Aplicar 100 microlitros de especies adecuadamente diluidas de anticuerpos secundarios fluorescentes e incubar a temperatura ambiente durante una hora. Enjuague después con TBS-T tres veces durante cinco minutos cada una, monte las diapositivas con medio de montaje y cubra las diapositivas con cubreobjetos. Después del montaje, vea la muestra bajo un microscopio de fluorescencia.
El sistema PHM se ajustó para producir picos de aceleración vertical a aproximadamente 1.0 veces G, que era equivalente a los de las cabezas de las ratas durante la carrera en la cinta rodante. La aplicación de PHM a ratones atenuó significativamente su respuesta de contracción de la cabeza en comparación con los ratones de control que representan un efecto supresor de PHM en la señalización del receptor 5-HT2A en las neuronas de la corteza prefrontal. La cinta de correr que se ejecuta en PHM mejoró significativamente la internalización del receptor 5-HT2A y las neuronas de la corteza prefrontal del ratón.
La cuantificación de las áreas positivas del receptor 5-HT2A internalizadas y asociadas a la membrana en relación con el área nueva y positiva confirmó esta observación. La inmunotinción y la cuantificación de la expresión de c-Fos en neuronas positivas para el receptor 5-HT2A mostraron que la cinta rodante que funciona en PHM regula a la baja la expresión de 5-HTP indujo la expresión de c-Fos. Este es el evento celular descendente de la activación del receptor 5-HT2A y las neuronas PFC de ratón.
La intervención mecánica se puede aplicar a las partes del cuerpo que no sean la cabeza para investigar los aspectos mecánicos de los efectos del ejercicio.
