Los autores desean agradecer a Maize Genetics Cooperation, Maize Cell Genomics Project, Dave Jackson (Cold Spring Harbor Laboratory, NY), Anne W. Sylvester (Marine Biological Laboratory, University of Chicago, IL), Andrea Gallavotti (Rutgers University, NJ) y Carolyn G. Rasmussen (University of California, Riverside) por proporcionar las existencias mutantes y transgénicas, así como a Robert F. Baker y Alexander Jurkevich del Advanced Light Microscopy Core de la Universidad de Missouri-Columbia por su asistencia con la microscopía confocal. JMR fue apoyado por la Beca J. William Fulbright, el Fondo Diane P. y Robert E. Sharp, y el Programa de Investigación del Genoma Vegetal de la Fundación Nacional de Ciencias (IOS-1546873) a PM. CDTC, CMRV, EDCDP y RJRR son apoyados por el Programa de Becas Ateneo College. CDTC, EDCDP y RJRR cuentan con el apoyo de la beca de pregrado DOST-SEI S&T. DODL es apoyado por la Beca Académica Fr. Thomas Steinbugler SJ. RJRR cuenta con el apoyo de Aiducation International–Pathways to Higher Education Scholarship. Este trabajo fue apoyado por la Escuela de Ciencias e Ingeniería y la Biblioteca Rizal de la Universidad Ateneo de Manila.

Métodos mejorados para la obtención de imágenes de Primordia de hoja de maíz

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.

Presentamos dos métodos para preparar primordios de hojas de maíz para imágenes celulares. El primer método (sección 2 del protocolo) permite la medición del primordio para el análisis de la sección transversal, mientras que el segundo método (sección 3 del protocolo) permite desenrollar y aplanar el primordio para el análisis de montaje completo. Estos métodos facilitan la obtención de imágenes celulares de PF en primordios24 de hojas de maíz (como se muestra en la Figura 4 y la Figura 5) y proporcionan soluciones simples a los desafíos de obtener imágenes de hojas de maíz en desarrollo. La sección 2 del protocolo reduce el tiempo de disección y mejora la precisión del muestreo al medir los primordios antes de la sección en lugar de depender únicamente de los parámetros de estadificación 9,16. Con la nanocinta disponible comercialmente, la sección 3 del protocolo resuelve el problema de larga data de obtener imágenes de primordios de hoja entera en el maíz. Este protocolo mejora el método anterior, que utilizaba tubos de diálisis 31, y es una alternativa mucho más barata a la TC y RM11,32,33. Sin embargo, cuando se trata de visualizar los rasgos anatómicos de las hojas y producir resultados óptimos, ambos protocolos tienen algunas limitaciones, que se describen en la Tabla 2 y se discuten con más detalle a continuación.
En la sección 2 del protocolo, encontramos dificultad para visualizar los contornos celulares en secciones transversales gruesas de los primordios de la hoja, y la contratinción con colorantes fluorescentes de unión a la pared celular o a la membrana plasmática no proporcionó resultados satisfactorios. Por ejemplo, FM 4-64 produjo resultados subóptimos en comparación con el marcador FP de membrana plasmática, p Zm PIP2-1::ZmPIP2-1:CFP39 (PIP2-1-CFP; Figura 3A-D). Para superar esta limitación, recomendamos usar un vibratomo para producir secciones de tejido más delgadas (~0.1 mm)58 que permitirán una imagen vívida de campo brillante de los contornos celulares u optimizando el protocolo de contratinción47,59.
En la sección 3 del protocolo, la principal limitación es la dificultad de montar la hoja sin desgarros, daños o burbujas de aire, como se detalla en los pasos del protocolo 3.2.5-3.2.6 (Figura 3E-K). Debido a que la hoja de maíz es bilateralmente simétrica, un montaje de media hoja en lugar de un montaje de hoja entera puede ser suficiente para la visualización9. Para hacer esto, el primordio se puede cortar con una cuchilla de afeitar a lo largo del eje longitudinal después de desenrollarlo hasta la nervadura central, permitiendo montar solo la mitad de la hoja. Otra limitación de la sección 3 del protocolo es que el grosor de la hoja puede limitar la resolución óptica de la señal del fluoróforo durante la obtención de imágenes profundas. Para abordar este problema, es posible emplear una técnica de limpieza de tejidos60. Sin embargo, encontramos que ClearSee61, un reactivo de limpieza comúnmente utilizado para obtener imágenes de tejidos vegetales, no es compatible con el protocolo porque hace que la muestra y el cubreobjetos se desprendan de la nanocinta. Una posible solución a este problema podría ser aplicar una membrana semipermeable31 sobre la muestra de hoja, permitiendo que sea tratada con la solución de limpieza mientras se mantiene en su lugar por la nano cinta. Este método que permite aplicar soluciones líquidas a la hoja desenrollada también podría utilizarse para técnicas de hibridación e inmunolocalización in situ de ARN de montaje completo, que previamente se han optimizado para desarrollar inflorescencias de maíz, pero no para primordios de hoja entera62,63.
Describimos protocolos para el maíz, que tiene primordios de hoja grande incluso en la etapa de plántula. Otras especies de gramíneas con primordios de hojas mucho más pequeñas, como el arroz, la cebada, el trigo, Setaria y Brachypodium 16,23,64,65,66, pueden requerir el uso de herramientas de precisión adicionales para aplicar eficazmente estos protocolos. Además, estos protocolos no estaban destinados a imágenes de células vivas, que capturan procesos dinámicos en tiempo real de formación de tejidos y respuestas celulares. Sin embargo, a medida que las sondas fluorescentes, las tecnologías de imagen y las capacidades informáticas continúan avanzando en las imágenes de células vivas para plantas67, la investigación futura podría basarse en estos protocolos para desarrollar estrategias de imágenes de células vivas adaptadas a las características únicas de los primordios de hojas de hierba.

Los cultivos de gramíneas son una fuente importante de alimentos y biocombustibles para la población mundial1, y mejorar la anatomía de las hojas tiene el potencial de aumentar su productividad 2,3. Sin embargo, nuestra comprensión actual de cómo se regula la anatomía de la hoja en las gramíneas es limitada4 y requiere el análisis de los primordios de la hoja, ya que muchos rasgos anatómicos y fisiológicos de la hoja están predeterminados temprano en el desarrollo 5,6,7. Las técnicas de imagen celular, como la fluorescencia y las imágenes confocales, son indispensables para estudiar la anatomía de la hoja de hierba y los rasgos celulares, pero estas técnicas son difíciles de aplicar a los primordios de la hoja de hierba porque están profundamente enfundadas y enrolladas dentro de la espiral de la hoja. Abordamos este tema desarrollando métodos para preparar secciones transversales y montajes de hojas enteras desenrolladas para el análisis de fluorescencia y confocal de primordios de hojas de maíz, un sistema modelo para estudiar la anatomía y el desarrollo de la hoja de gramínea 2,8.
La hoja de maíz, como todas las hojas de hierba, consiste en una hoja en forma de correa con una vaina que se envuelve alrededor del tallo y el brote en desarrollo 9,10,11,12,13. Las hojas se desarrollan a partir del meristemo apical del brote (SAM) en un patrón distichoso, donde cada nueva hoja se inicia en la posición opuesta a la hoja anterior, lo que resulta en dos filas de hojas a lo largo del eje vertical (Figura 1A)14 . La etapa de desarrollo de cada primordio foliar se identifica por su posición relativa al SAM, con el primordio más cercano designado como plastocrono1 (P1) y los siguientes primordios designados como P2, P3, y así sucesivamente (Figura 1B, C) 2. Durante el desarrollo (Figura 1D), el primordio de la hoja aparece primero como un contrafuerte en forma de media luna alrededor de la base del SAM (P1), y luego crece en un primordio en forma de capucha que se extiende sobre el meristemo (P2)9,10,11. Los márgenes basales de la capucha se expanden lateralmente y se superponen entre sí a medida que la punta crece hacia arriba, formando un primordio en forma de cono (P3-P5)10. El primordio crece rápidamente en longitud, y el límite de la lámina de la vaina en la base se vuelve más prominente con la formación de la lígula, la proyección en forma de franja en el lado adaxial de la hoja (P6 / P7). Finalmente, la hoja se desenrolla a medida que emerge del verticilo durante el crecimiento en estado estacionario, en el que las células en división están restringidas dentro de la pequeña región basal de la lámina, formando un gradiente con células en expansión y diferenciación a lo largo del eje proximal-distal (P7/P8)15. El ápice del brote de una plántula de maíz contiene múltiples primordios en diferentes etapas de desarrollo, lo que lo convierte en un excelente modelo para estudiar el desarrollo de las hojas8.
El análisis preciso del desarrollo temprano de las hojas requiere la estadificación o el uso de criterios estandarizados para definir distintas etapas del desarrollo del primordio en relación con otros parámetros morfológicos o de crecimiento. Debido a que los primordios de la hoja están ocultos dentro del brote de hierba, los investigadores suelen utilizar parámetros como la edad de la planta o el tamaño de las hojas emergentes como predictores de las etapas y tamaños de los primordios de la hoja 9,16. En el maíz, la edad cronológica de la planta está determinada por el número de días después de la siembra o la germinación (DAP/DAG)17,18. La etapa vegetativa (etapa V) está determinada por la hoja superior con un collar visible, una línea pálida en el lado abaxial entre la lámina y la vaina que corresponde a la posición de la lígula y las aurículas, un par de regiones en forma de cuña en la base de la lámina (Figura 1A,B)17,19 . Entre 20 y 25 DAG, el SAM pasa a un meristemo de inflorescencia y deja de producir nuevas hojas20. Las tasas de crecimiento de los primordios de la hoja de maíz pueden variar según el medio ambiente y el genotipo de la planta. Por esta razón, la edad de la planta y el tamaño de las hojas emergentes no pueden predecir con precisión los tamaños de los primordios de las hojas; Sin embargo, el uso de estos parámetros puede ayudar a predecir el rango de etapas y tamaños de primordia con fines experimentales.
El análisis de sección transversal es un método popular para examinar la anatomía y el desarrollo de las hojas en maíz y otras gramíneas, ya que permite el muestreo de múltiples plastochrones en una sola sección a través del brote21,22,23. Este método también es conveniente para la obtención de imágenes celulares de muestras frescas, ya que las hojas circundantes sirven como un andamio que mantiene los primordios de las hojas en su lugar durante la sección y el montaje24. Sin embargo, una desventaja de este método es que puede ser difícil localizar con precisión el plastocrón objetivo y la región dentro del primordio cuando se secciona desde un brote intacto. Además, debido a que el crecimiento de las hojas varía entre plastochrones y a lo largo del eje proximal-distal2,5, un muestreo impreciso podría dar lugar a una interpretación incorrecta de la etapa de desarrollo y la región del primordio en una sección dada. Por lo tanto, el desarrollo de un método para el muestreo preciso de la sección transversal es fundamental para garantizar la precisión y la reproducibilidad de los análisis anatómicos y de desarrollo de los primordios de hojas de gramíneas.
El análisis de montaje de hoja entera permite la investigación integral e integradora de los procesos tisulares y celulares que ocurren a escala de todo el órgano, como el crecimiento proliferativo25 y el patrón de venas26,27,28. El método proporciona una visión paradérmica de la hoja, permitiendo el descubrimiento de distintos procesos y patrones que de otro modo serían difíciles de detectar utilizando el análisis de sección transversal24,27. A diferencia de Arabidopsis, donde ya existen métodos establecidos para obtener imágenes de montajes de hojas enteras29,30, actualmente no existe un método estándar para obtener imágenes de montajes de hojas enteras desenrollados en gramíneas. Un protocolo previo para desenrollar primordios aislados de hojas de maíz involucraba materiales poco comunes y no era adecuado para imágenes celulares31. Las técnicas avanzadas de imagen, como la tomografía computarizada (TC) y la resonancia magnética (RM), pueden adquirir información anatómica 3D sin aislar y desenrollar los primordios 11,32,33, pero son costosas y requieren equipo especializado. El desarrollo de una técnica para superar las limitaciones impuestas por la morfología enrollada y cónica de los primordios foliares en el maíz y otras gramíneas avanzaría en las investigaciones sobre sus rasgos anatómicos y de desarrollo.
Aquí, presentamos métodos para preparar secciones transversales y montajes enteros desenrollados de primordios de hojas de maíz para imágenes fluorescentes y confocales. Utilizamos estos métodos para cuantificar el número de venas y mapear la distribución hormonal espacio-temporal en primordios de hojas de maíz con proteínas fluorescentes (PF)24. El primer método consiste en extraer la porción superior de las hojas más viejas de las plántulas de maíz con un decapante de alambre (Figura 1E). Al exponer la punta del primordio (P5-P7), es posible determinar su longitud sin tener que eliminar completamente las hojas circundantes más viejas, lo que permite un seccionamiento fácil y preciso. El segundo método consiste en desenrollar y montar primordios de hoja entera (P3-P7) con cinta nano transparente de doble cara (Figura 1F). Estos métodos son adecuados para visualizar varios FP24, pero necesitan optimización para usar tintes fluorescentes y reactivos de limpieza. Además, describimos algunos procedimientos para aplanar pilas z, unir imágenes y combinar canales en ImageJ/FIJI34, que se aplican a las imágenes producidas por los dos métodos. Estos métodos son útiles para la fluorescencia de rutina o las imágenes confocales de las hojas de maíz, pero también se pueden adaptar para otras especies de gramíneas modelo, como el arroz, Setaria y Brachypodium.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig01.jpg"> Figura 1: Organización y morfología de los primordios de la hoja de maíz y visión general de los métodos . (A) Representación esquemática de una plántula de maíz. El maíz tiene una filotaxia distichosa, con la nueva hoja iniciándose en la posición opuesta a la hoja anterior. El número de hoja indica el orden cronológico en el que las hojas emergieron de la germinación (es decir, primera hoja, L1; segunda hoja, L2; tercera hoja, L3; etc.). Cada hoja tiene una lámina distal y una vaina basal delineada por un collar que corresponde a la lígula y la aurícula. La hoja superior con el collar visible denota la etapa vegetativa. La plántula en este ejemplo está en la etapa V2, con el collar L2 (punta de flecha) visible. El icono de tijeras indica la ubicación en el mesocótilo (me) donde se debe cortar la plántula para ser recolectada. (B) Representación esquemática del brote disecado que muestra aislados de L1 a L4, con los primordios de la hoja L5 a L9 mostrados como una imagen ampliada en (C). El número de plastocrono indica la posición del primordio en relación con el SAM, con el primordio de la hoja más joven (P1) más cercano al SAM y los primordios de hojas más viejos (P2, P3, P4, etc.) sucesivamente más lejos2. (D) Representación esquemática de la morfología de los primordios de la hoja de maíz de P1 a P5. (E) Resumen esquemático del método para el análisis de secciones transversales de los primordios de la hoja de maíz. (1) Recorte las hojas más viejas con un decapante de alambre. (2) Mida el primadio y seccione el brote. (3) Monte la sección en una diapositiva para obtener imágenes y procesamiento (4, 5). (F) Resumen esquemático del método para el análisis de montaje completo de los primordios de la hoja de maíz. (1) Retire las hojas circundantes para extraer el primordio. (2) Corte y desenrolle el primordium plano en la cinta nano. (3) Monte la muestra para obtener imágenes y procesarla (4, 5). Abreviaturas: L = hoja; bl = cuchilla; sh = vaina; co = collar; me = mesocótilo; V = vegetativo; P = plastocrono; SAM = meristemo apical del brote. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylic Gel Clear Double Sided Nano Tape 16.5 ft x 1.2 in, 2 mm thick</td>
			<td>EZlifego Store (Amazon)</td>
			<td>B07YB1ZXG6</td>
			<td>1 roll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bellucci Pick Curved micro probe 16.8 cm, 6.6 in</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>N1692 9</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clayman guide microprobe Sinskey hook angled shaft, 11.6 cm, 4.6 in</td>
			<td>Storz Opthalmic Instruments</td>
			<td>E0542</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Probe, Bent Needle, 14 cm (5.5 in)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>13553</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWELL 10-22 AWG Wire Stripper</td>
			<td>Dowell Store (Amazon)</td>
			<td>10-22 AWG</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Double Edge Carbon Steel Blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-9</td>
			<td>pkg/10; for fine sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted End Glass Microscope Slides, 75 mm x 25 mm x 1-1.2 mm</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260442</td>
			<td>pkg/144</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEM Single Edge, Stainless Steel Uncoated Blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-1</td>
			<td>box/200; for general cutting/sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI17904</td>
			<td>1 liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/FIJI with EDF plugin (version 17.05.2021) and Grid/Collection Stitching plugin</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH) USA</td>
			<td>version 2.9.0/1.54s</td>
			<td>The EDF plugin was developed by Alex Prudencio, Jesse Berent, and Daniel Sage for the Biomedical Imaging Group, &#201;cole Polytechnique F&#233;d&#233;rale de Lausanne (EPFL; http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/). The grid/collection stitching software was developed by Stephan Preibisch for the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Ex-L Small 111.76 mm x 213.36 mm</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>34155</td>
			<td>box/280 ply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, 22 mm x 22 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260140</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PU Gel Clear Double Sided Nano Tape 29.5 ft x 1.18 in, 1 mm thick</td>
			<td>Yecaye Store (Amazon)</td>
			<td>L354 W1.18</td>
			<td>2 rolls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superslip Cover Glasses, 24 mm x 50 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260166</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superslip Cover Glasses, 24 mm x 60 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260168</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempered Glass Cutting Board</td>
			<td>Hacaroa (Amazon)</td>
			<td>B09XMXBT5S</td>
			<td>4 pc</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging

En el maíz (Zea mays) y otras gramíneas (Poaceae), los primordios de las hojas están profundamente enfundados y enrollados dentro del verticilo de la hoja, lo que dificulta el estudio del desarrollo temprano de las hojas. Aquí, describimos métodos para preparar secciones transversales y montajes enteros desenrollados de primordios de hojas de maíz para imágenes fluorescentes y confocales. El primer método utiliza un decapante de alambre para eliminar las porciones superiores de las hojas más viejas, exponiendo la punta del primordio de la hoja y permitiendo su medición para un muestreo de sección transversal más preciso. El segundo método utiliza cinta nano transparente de doble cara para desenrollar y montar primordios de hoja entera para obtener imágenes. Mostramos la utilidad de los dos métodos para visualizar y analizar reporteros de proteínas fluorescentes en maíz. Estos métodos proporcionan una solución a los desafíos presentados por la morfología distintiva de los primordios de la hoja de maíz y serán útiles para visualizar y cuantificar los rasgos anatómicos y de desarrollo de las hojas en el maíz y otras especies de gramíneas.

Grass crops are a major source of food and biofuel for the global population1, and improving leaf anatomy has the potential to increase their productivity2,3. However, our current understanding of how leaf anatomy is regulated in grasses is limited4 and requires the analysis of leaf primordia, as many anatomical and physiological traits of the leaf are predetermined early in development5,6,7. Cellular imaging techniques, such as fluorescence and confocal imaging, are indispensable for studying grass leaf anatomy and cellular traits, but these techniques are difficult to apply to grass leaf primordia because they are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl. We addressed this issue by developing methods for preparing transverse sections and unrolled whole-leaf mounts for fluorescence and confocal analysis of maize leaf primordia, a model system for studying grass leaf anatomy and development2,8.
The maize leaf, like all grass leaves, consists of a strap-like blade with a sheath that wraps around the stem and developing shoot9,10,11,12,13. The leaves develop from the shoot apical meristem (SAM) in a distichous pattern, where each new leaf initiates in the opposite position of the previous leaf, resulting in two ranks of leaves along the vertical axis&#160;(Figure 1A)14 . The developmental stage of each leaf primordium is identified by its position relative to the SAM, with the closest primordium designated as plastochron1 (P1) and the following primordia designated as P2, P3, and so on (Figure 1B,C)2. During development (Figure 1D), the leaf primordium first appears as a crescent-shaped buttress around the base of the SAM (P1), and then grows into a hood-shaped primordium that extends over the meristem (P2)9,10,11. The basal margins of the hood then expand laterally and overlap each other as the tip grows upward, forming a cone-shaped primordium (P3-P5)10. The primordium then rapidly grows in length, and the sheath-blade boundary at the base becomes more prominent with the formation of the ligule, the fringe-like projection on the adaxial side of the leaf (P6/P7). Finally, the leaf unrolls as it emerges from the whorl during steady-state growth, in which the dividing cells are restricted within the small basal region of the blade, forming a gradient with expanding and differentiating cells along the proximal-distal axis (P7/P8)15. The shoot apex of a maize seedling contains multiple primordia at different stages of development, making it an excellent model for studying leaf development8.
Accurate analysis of early leaf development requires staging or the use of standardized criteria to define distinct stages of primordium development in relation to other growth or morphological parameters. Because the leaf primordia are hidden within the grass shoot, investigators typically use parameters such as the age of the plant or the size of the emerging leaves as predictors for the stages and sizes of the leaf primordia9,16. In maize, the chronological age of the plant is determined either by the number of days after planting or germination (DAP/DAG)17,18. The vegetative stage (V stage) is determined by the uppermost leaf with a visible collar, a pale line on the abaxial side between the blade and the sheath that corresponds to the position of the ligule and auricles, a pair of wedge-shaped regions at the base of the blade&#160;(Figure 1A,B)17,19 . Between 20 and 25 DAG, the SAM transitions into an inflorescence meristem and ceases to produce new leaves20. The growth rates of maize leaf primordia can vary depending on the environment and the genotype of the plant. For this reason, plant age and the size of the emerging leaves cannot accurately predict the sizes of leaf primordia; however, using these parameters can help predict the range of primordia stages and sizes for experimental purposes.
Transverse section analysis is a popular method for examining leaf anatomy and development in maize and other grasses because it allows for the sampling of multiple plastochrons in a single section across the shoot21,22,23. This method is also convenient for cellular imaging of fresh samples, as the surrounding leaves serve as a scaffold&#160;that keeps the leaf primordia in place during sectioning and mounting24. However, a disadvantage of this method is that it can be challenging to precisely locate the target plastochron and region within the primordium when sectioning from an intact shoot. Furthermore, because leaf growth varies across plastochrons and along the proximal-distal axis2,5, imprecise sampling could result in an incorrect interpretation of the developmental stage and region of the primordium in a given section. Therefore, developing a method for precise transverse section sampling is critical for ensuring the accuracy and reproducibility of anatomical and developmental analyses of grass leaf primordia.
Whole-leaf mount analysis enables the comprehensive and integrative investigation of tissue and cellular processes that occur at the whole-organ scale, such as proliferative growth25 and vein patterning26,27,28. The method provides a paradermal overview of the leaf, allowing the discovery of distinct processes and patterns that would otherwise be difficult to detect using transverse section analysis24,27. Unlike in Arabidopsis, where there are already established methods for imaging whole-leaf mounts29,30, there is currently no standard method for imaging unrolled whole-leaf mounts in grasses. A previous protocol for unrolling isolated maize leaf primordia involved uncommon materials and was not suitable for cellular imaging31. Advanced imaging techniques, such as computed tomography (CT) and magnetic resonance imaging (MRI), can acquire 3D anatomical information without isolating and unrolling the primordia11,32,33, but they are expensive and require specialized equipment. Developing a technique to overcome the constraints imposed by the rolled and conical morphology of leaf primordia in maize and other grasses would advance investigations into their anatomical and developmental traits.
Here, we present methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging. We used these methods to quantify vein number and map the spatial-temporal hormone distribution in maize leaf primordia with fluorescent proteins (FPs)24. The first method involves removing the upper portion of older leaves from maize seedlings with a wire stripper (Figure 1E). By exposing the tip of the primordium (P5-P7), it becomes possible to determine its length without having to completely remove the older surrounding leaves, thus enabling easy and accurate sectioning. The second method involves unrolling and mounting whole-leaf primordia (P3-P7) with clear, double-sided nano tape (Figure 1F). These methods are suitable for visualizing various FPs24&#160;but need optimization for using fluorescent dyes and clearing reagents. In addition, we outline some procedures for flattening z-stacks, stitching images, and merging channels in ImageJ/FIJI34, which apply to the images produced by the two methods. These methods are useful for routine fluorescence or confocal imaging of maize leaves, but they can also be adapted for other model grass species, such as rice, Setaria, and Brachypodium.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig01.jpg" /> 
Figure 1: Organization and morphology of maize leaf primordia and overview of the methods. (A) Schematic representation of a maize seedling. Maize has a distichous phyllotaxy, with the new leaf initiating at the opposite position of the previous leaf. The leaf number indicates the chronological order in which the leaves emerged from germination (i.e., first leaf, L1; second leaf, L2; third leaf, L3; etc.). Each leaf has a distal blade and a basal sheath delineated by a collar that corresponds to the ligule and auricle. The uppermost leaf with the collar visible denotes the vegetative stage. The seedling in this example is at the V2 stage, with the L2 collar (arrowhead) visible. The scissors icon indicates the location at the mesocotyl (me) where the seedling must be cut in order to be collected. (B) Schematic representation of the dissected shoot showing isolated L1 to L4, with the leaf primordia L5 to L9 shown as an enlarged image in (C). The plastochron number indicates the position of the primordium relative to the SAM, with the youngest leaf primordium (P1) closest to the SAM and the older leaf primordia (P2, P3, P4, and so on) successively farther away2. (D) Schematic representation of the morphology of maize leaf primordia from P1 to P5. (E) Schematic overview of the method for transverse section analysis of the maize leaf primordia. (1) Trim the older leaves with a wire stripper. (2) Measure the primordium and section the shoot. (3) Mount the section on a slide for imaging and processing (4, 5). (F) Schematic overview of the method for whole-mount analysis of the maize leaf primordia. (1) Remove the surrounding leaves to extract the primordium. (2) Cut and unroll the primordium flat on the nano tape. (3) Mount the sample for imaging and processing (4, 5). Abbreviations: L = leaf; bl = blade; sh = sheath; co = collar; me = mesocotyl; V = vegetative; P = plastochron; SAM = shoot apical meristem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Autor destacado: Métodos mejorados para preparar secciones transversales y desenrollar montajes enteros de Primordia de hoja de maíz para imágenes de fluorescencia y confocales  

Métodos mejorados para preparar secciones transversales y montajes enteros desenrollados de primordios de hojas de maíz para imágenes de fluorescencia y confocales

Grasses like maize have leaf primordia grow within the shoot, making them difficult to study. We address this problem with improved protocols for preparing maize leaf transverse sections and whole mounts for fluorescence and confocal imaging. The first protocol uses a wire stripper to cut the older leaves, allowing the measurement of the primordium prior to sectioning.The second protocol uses clear, double-sided nano tape to unroll whole leaf primordium. These protocols improve the accuracy of transverse sectioning and enable unrolling of the leaf primordia, which have been very difficult to achieve due to their rolled, conical morphology. These methods will be useful for visualizing and quantifying leaf anatomical and developmental traits in maize and other grasses.Based on these methods, we plan to develop live cell imaging strategies to address questions in grass leaf development.

Análisis de sección transversal de primordios de hojas de maíz Se utilizó la sección 2 del protocolo para cuantificar el número de venas y caracterizar los patrones de respuesta hormonal en secciones transversales de primordios de hojas de maíz con PF (Figura 4)24. Para evaluar el papel de la hormona vegetal auxina en el crecimiento foliar y la formación de venas, cuantificamos el número de venas en los primordios foliares de un mutante de maíz deficiente en auxina, borla desapareciendo254. En los primeros plastochrones, las venas en desarrollo exhiben una celularización distinta en la capa celular mediana del primordio de la hoja de maíz21,22. Sin embargo, la identificación y el recuento de venas mediante técnicas histológicas convencionales22 pueden requerir mucha mano de obra y mucho tiempo. Así, para cuantificar las venas, se utilizó el marcador de proteína de eflujo de auxina de maíz p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP41 (PIN1a-YFP en adelante), que marca venas en desarrollo y hebras procambial (PCSs; Figura 4A). Usando la sección 2 del protocolo, pudimos estandarizar el muestreo de la sección transversal midiendo los primordios antes de la sección (Figura 4B, C). Descubrimos una tendencia en la que vt2 tiene un primordio más ancho y más venas de lo normal (Figura 4D,E)24, lo que es consistente con los datos de hojas completamente expandidas55, lo que indica que el defecto en vt2 comenzó temprano en el desarrollo de la hoja. Usando la sección 2 del protocolo, también pudimos examinar sistemáticamente los patrones de expresión de los reporteros de PF de respuesta hormonal en los primordios de la hoja (ver ejemplos de las imágenes en la Figura 4F-I). A través de un esquema estandarizado de muestreo de sección transversal, mapeamos la distribución de las respuestas de auxina, citoquinina (CK) y ácido giberélico (GA) en diferentes plastocrones y regiones de primordios foliares, y descubrimos nuevos patrones de respuesta que hipotetizamos que tienen implicaciones para el crecimiento de las hojas y la formación de venas24. Por lo tanto, estos resultados representativos demuestran la utilidad de la sección 2 del protocolo para el análisis de sección transversal de primordios de hojas de maíz.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig04.jpg"> Figura 4: Resultados representativos para el análisis de sección transversal de primordios de hojas de maíz. (A-E) Cuantificación del número de venas y el ancho del primordio en primordios foliares de borla normal y en fuga2 con el marcador de proteína de eflujo de auxina PIN1a-YFP. (A) Imágenes representativas de fluorescencia de secciones transversales de P5 a P7 que expresan PIN1a-YFP en venas en desarrollo y hebras procambial. Las secciones transversales fueron fotografiadas con un microscopio de epifluorescencia utilizando un filtro FITC (excitación 495-519 nm). El número de venas y el ancho del primordio se cuantificaron utilizando las herramientas de línea multipunto y a mano alzada en FIJI/ImageJ, respectivamente. (B) Una plántula de maíz con los verticilos de la hoja superior eliminados con un pelante de alambre para exponer la punta de la cuarta hoja (L4). El corchete abarca la longitud proyectada del primibido, con la línea discontinua que indica la longitud media. (C) Diagrama esquemático de diferentes formas de primordio de P5 a P7, que ilustra cómo el número de venas y el ancho del primordio en la longitud media (línea discontinua horizontal) pueden variar dependiendo de la etapa de desarrollo del primordio. (D,E) Medición de la anchura del primordio (D) y del número de venas (E) en la sección media de longitud de la L4 de normal y vt2. La línea de tendencia representa promedios móviles de 10 mm de mediciones ± error estándar de la media (SEM). (F-I) Imágenes confocales representativas de secciones transversales de primordios foliares que expresan combinaciones de PIN1a-YFP, reportero de respuesta de auxina, DR5-RFP, reportero de respuesta de citoquinina, TCS-Tomate, marcador giberélico sensible al ácido, GAR2-YFP y mDII-Venus, una versión mutada del reportero de entrada de señalización de auxina DII-Venus. Los canales FP se superponen en el canal de campo claro en cada imagen. Barra de escala = 200 μm (A); 10 mm (B); 100 μm (F-I). Esta figura ha sido modificada y reproducida con permiso de Robil y McSteen24. Abreviaturas: DAG = días después de la germinación; P = plastocrono; vt2 = borla que desaparece2; PCS = cadena procambial; YFP = proteína fluorescente amarilla; FITC = isotiocianato de fluoresceína; RFP = proteína fluorescente roja; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; TCS-Tomate = TCSv2::NLS-tdTomato; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; mDII-Venus = pZmUbi:mDII:YFP-NLS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Análisis de montaje completo de primordios de hojas de maíz Seguimos la sección 3 del protocolo para visualizar y analizar la expresión de PF en montajes de hojas enteras de primordios de hojas de maíz (Figura 5). Al visualizar patrones de venas con PIN1a-YFP, encontramos que la formación de venas ocurre en todo el primordio durante los plastocrones tempranos, pero este proceso se restringe en las regiones proximales más adelante en el desarrollo (Figura 5A)24. Complementario a los análisis de sección transversal, los análisis de montaje de hoja entera han revelado patrones específicos de respuesta hormonal en tejidos y estadios durante la formación de venas24. Un ejemplo es el patrón de expresión del reportero de respuesta CK TCSv2::NLS-tdTomato37 (TCS-Tomato), relativo a la expresión PIN1a-YFP (Figura 5B)24. Siguiendo la sección 3 del protocolo, pudimos realizar análisis cualitativos y cuantitativos de la expresión de PF en los primordios foliares (Figura 5D-F; datos no publicados). Examinamos los patrones de expresión de un reportero de respuesta de auxina, DR5rev::mRFPer41 (DR5-RFP), y un marcador sensible a GA, p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP39 (GAR2-YFP), en montajes de hoja entera de mutantes simples y dobles de vt2 y planta enana3 (d3), un mutante deficiente en GA56 (Figura 5D). También comparamos los niveles relativos de proliferación celular entre primordios foliares normales y vt2 usando p Zm Cyclin-D2B::ZmCyclin-D2B:YFP42 (Cyclin-D2B-YFP), que es un marcador de la transición G1/S en el ciclo celular57 (Figura 5E,F). Si bien no hubo diferencias significativas entre normal y vt2, la expresión de ciclina-D2B-YFP fue consistente con el perfil de proliferación celular conocido de plastochrons tempranos31. Concluimos que la sección 3 del protocolo es un método eficaz para analizar montos enteros de primordios de hojas de maíz, que son difíciles de visualizar debido a su morfología enrollada.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig05.jpg"> Figura 5: Resultados representativos para el análisis de montaje completo de primordios de hojas de maíz. (A) Imágenes representativas de fluorescencia de primordios de hojas de 7 plántulas de maíz DAG que muestran venas en desarrollo y hebras procambiales, marcadas por el marcador de proteína de eflujo de auxina PIN1a-YFP. Los primordios P3-P6 se extirparon de la base, se desenrollaron y se aplanaron con el lado adaxial hacia arriba. Los recuadros muestran primeros planos de P3 y P4. En P5 y P6, las líneas discontinuas demarcan el extremo distal de las zonas proliferativas, donde la mayoría de las hebras procambial todavía se están desarrollando y extendiendo. (B,C) Imágenes confocales representativas que muestran la expresión de PIN1a-YFP y el reportero de respuesta a citoquininas, TCS-Tomato, en la región marginal proximal de un primordio P5. (D) Imágenes representativas de fluorescencia de primordios P4 que muestran la expresión del reportero de respuesta de auxina, DR5-RFP, y el marcador giberélico sensible al ácido, GAR2-YFP en mutantes normales y simples y dobles de borla en fuga2 y planta enana3. (E) Imágenes confocales representativas de P3 y/o P4 que muestran la expresión de Cyclin-D2B-YFP, un reportero de la transición G1/S en el ciclo celular. (F) Cantidades relativas de proliferación celular en primordios foliares P3/P4 de normal y vt2, cuantificadas midiendo la densidad integrada de la señal Cyclin-D2B-YFP sobre el área del primordio utilizando ImageJ/FIJI. Las barras representan las medidas medias ± error estándar de la media. Barra de escala = 500 μm (A,D,E); 200 μm (B); 100 μm (C). La Figura 4A-C ha sido modificada y reproducida con permiso de Robil y McSteen24, mientras que la Figura 4D-F son datos no publicados de los autores. Abreviaturas: DAG = días después de la germinación; P = plastocrono; vt2 = borla que desaparece2; d3 = planta enana3; YFP = proteína fluorescente amarilla; RFP = proteína fluorescente roja; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; TCS-Tomate = TCSv2::NLS-tdTomato; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; Ciclina-D2B-YFP = p Zm ciclina-D2B::ZmCyclin-D2B:YFP; ns = ninguna diferencia significativa; au = unidad arbitraria. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Archivo Suplementario 1: Ejemplos de estadificación del desarrollo foliar en plántulas de maíz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239_S_File_1_Leaf_staging_maize_seedling_Fall2019%20(1).xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura suplementaria S1: Muestras de plantas y materiales utilizados en los protocolos. (A,B) Una plántula de maíz 7-8 DAG con el verticilo de la hoja superior eliminado usando un pelacable. (B) El recuadro muestra un primer plano del brote con el primordio P6 expuesto. (C-G) Brotes de plántulas de maíz con los verticilos superiores eliminados para el análisis de sección transversal (C, D) y las hojas circundantes completamente eliminadas para el análisis de montaje completo (E-G). (H) Un rollo de gel de poliuretano transparente nano cinta de doble cara. (I,J) Primordio de la hoja P6 (I) y región proximal de la hoja P8 (J) desenrollados y montados en portaobjetos de vidrio con la cinta nano. (K) Un portaobjetos de vidrio con un primordio de hoja desenrollado montado en el escenario de un microscopio de epifluorescencia. Abreviatura: DAG = días después de la germinación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/S_FIGURE_1.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Los primordios de hojas de maíz están profundamente enfundados y enrollados, lo que los hace difíciles de estudiar. Aquí, presentamos métodos para preparar secciones transversales y montajes enteros desenrollados de primordios de hojas de maíz para imágenes fluorescentes y confocales.

In maize (Zea mays) and other grasses (Poaceae), the leaf primordia are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl, making it difficult to study ...

Las gramíneas como el maíz tienen primordios de hojas que crecen dentro del brote, lo que las hace difíciles de estudiar. Abordamos este problema con protocolos mejorados para preparar secciones transversales de hojas de maíz y montajes completos para fluorescencia e imágenes confocales. El primer protocolo utiliza un pelacables para cortar las hojas más viejas, lo que permite la medición del primordio antes de la sección.El segundo protocolo utiliza cinta nano transparente de doble cara para desenrollar el primordio de toda la hoja. Estos protocolos mejoran la precisión de la sección transversal y permiten desenrollar los primordios de la hoja, que han sido muy difíciles de lograr debido a su morfología cónica enrollada. Estos métodos serán útiles para visualizar y cuantificar los rasgos anatómicos y de desarrollo de las hojas en el maíz y otras gramíneas.Con base en estos métodos, planeamos desarrollar estrategias de imágenes de células vivas para abordar preguntas en el desarrollo de hojas de gramíneas.

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Biology

Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging

1.8K vistas.  Ateneo de Manila University. Las gramíneas como el maíz tienen primordios de hojas que crecen dentro del brote, lo que las hace difíciles de estudiar. Abordamos este problema con protocolos mejorados para preparar secciones transversales de hojas de maíz y montajes completos para fluorescencia e imágenes confocales. El primer protocolo utiliza un pelacables para cortar las hojas más viejas, lo que permite la medición del primordio antes de la sección.El segundo protocolo utiliza cinta nano transparente de ...

Video: Autor destacado: Métodos mejorados para preparar secciones transversales y desenrollar montajes enteros de Primordia de hoja de maíz para imágenes de fluorescencia y confocales  

In maize (Zea mays) and other grasses (Poaceae), the leaf primordia are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl, making it difficult to study early leaf development. Here, we describe methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging. The first method uses a wire stripper to remove the upper portions of older leaves, exposing the tip of the leaf primordium and allowing its measurement for more accurate transverse section sampling. The second method uses clear, double-sided nano tape to unroll and mount whole-leaf primordia for imaging. We show the utility of the two methods in visualizing and analyzing fluorescent protein reporters in maize. These methods provide a solution to the challenges presented by the distinctive morphology of maize leaf primordia and will be useful for visualizing and quantifying leaf anatomical and developmental traits in maize and other grass species.

Maize leaf primordia are deeply ensheathed and rolled, making them difficult to study. Here, we present methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging.

Investigación

Biología

﻿Imaging Transverse Sections of Maize Leaf Primordia

Imaging Transverse Sections of Maize Leaf Primordia  

Begin by cutting the desired aged maize seedling at the mesocotyl tissue using a small knife or pair of scissors. Clean the seedling with a paintbrush. Then hold the wire stripper with its jaws facing the chute.Position the chute to the selected hole and squeeze the stripper handles together. Slide the stripper away from the chute to trim the upper portion of the leaves. Use a ruler to measure the length from the primordium's tip to the chute's base.To begin the leaf primordium imaging, hold the chute steady on a smooth surface under a stereo microscope at around 0.8x magnification. Using a razor blade or scalpel, make an initial cut slightly above the target region to discard the distal portion of the chute. Then obtain around 0.25 to 0.8 millimeter thin sections at the desired points along the length of the primordium.Once done, mount the leaf section on a clean glass slide. Apply a few drops of water directly to the section using a pipette. And place a cover slip on top.Apply a few more drops through the edges of the cover slip if needed. Place the slide on the epifluorescence microscope's stage and adjust the settings to visualize the fluorophore. Using this method, chance resection sampling was standardized by measuring the primordia prior to sectioning.A trend was discovered showing that the vanishing tassel two had a wider primordia and more veins than normal, indicating that the defect in the mutant began early in the leaf development. This method also enabled the systematic examination of the expression patterns of hormone response fluorescent protein reporters in the leaf primordia.

Imágenes de secciones transversales de primordia de hoja de maíz

Imaging Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia

Begin the preparation of the glass slide by cutting a rectangular piece of clear, double-sided nano tape and sticking it to the center of a clean glass slide without removing the protective plastic film on the top side of the tape. Next, dissect the chute by removing the upper portion of the older leaves with a wire stripper. Then hold the chute by the mesocaudal and carefully remove the surrounding leaves with a dental probe to extract the primordia of interest.For mounting the primordium, remove the protective film from the tape. Lay the exposed primordium on the tape. Cut the primordium at the base using a razor blade, discarding the basal stem and the hypocaudal.For smoother unrolling, lubricate the inner, or, adaxial leaf surface by dipping the needle tip into 100%glycerol. Unroll the primordium using a dental probe with a bent needle. Position the needle tip parallel to the surface and unfurl the outer basal margin by gently pressing it against the tape.With the outer margin adhering to the tape, align the needle tip parallel to the long axis of the leaf. Gently slide the needle sideways to unroll and flatten the leaf onto the tape. Apply a drop of water to the unrolled primordium.Immediately place a cover slip on the water drop and the primordium. Gently press down the edges of the cover slip so that they adhere to the tape. Once done, place the slide on the epifluorescence microscope stage to visualize the fluorophore.This method was followed to visualize and analyze the fluorescent protein expression in maize leaf primordia. Complementary to the transverse section analysis. The whole leaf mount analysis revealed tissue and stage-specific patterns of formal response during vein formation.Whole mount analysis method enabled qualitative and quantitative analyses of fluorescent protein expression in the maize leaf primordia, indicating the effectiveness of this method in examining the maize leaf primordia which are difficult to image due to their rolled morphology.