استرجاع البويضات ماوس

Summary

هذا البروتوكول يوضح تقنية لاستخراج البويضات أو الأجنة في مرحلة مبكرة من قناة البيض المخصب من الفئران. القدرة على تحديد infindibulum وادخال ابرة في نهاية حادة من الضروري القيام بشكل صحيح الإجراء.

Abstract

حتى الآن ، وأفادت دراسات قليلة فقط التلاعب الناجح للمرحلة التطور الجنيني Peromyscus أو البيولوجيا الإنجابية. جنبا إلى جنب مع الأسهم Peromyscus مركز الوراثية (http://stkctr.biol.sc.edu) ، ونحن تميز الاختلافات البارزة اللازمة لتطوير هذا النظام. وكان أحد الأهداف الرئيسية لتحسين البويضة / أوائل استرجاع الجنين.

Protocol

جنين / سيت استرجاعها

1. يجب إذابة مدة ساعتين على الأقل قبل استرجاع الأجنة / البويضات ، يتم وضع KSOM في 37 درجة مئوية حاضنة ₂ أكسيد الكربون وFHM من ° -20. ويستخدم الزجاج صحن يحتوي على ثلاثة آبار ضحلة مقعرة لقطرات منزل KSOM في الحاضنة. لمنع الجفاف ، وتوضع في طبق وKSOM حاوية بغطاء الماء الذي في الأسفل. هذا الجهاز يمنع التبخر من دون استخدام الزيوت المعدنية.
   
   
2. توضع ناقلة البيضات من الإناث البيض في وسائل الإعلام FHM. لضمان التوجه infindibulum وسليمة ، ويتم قطع جزء صغير من المبيض مع قسم صغير من قناة البيض والرحم. يتم استخدام إبرة حادة قياس 30 لطرد الأجنة / البويضات من قناة البيض وذلك بإضافة إبرة حادة في infindibulum. يجب استخدام infindibulum لاسترداد الأجنة منذ أنابيب قناة البيض صغير جدا عن إبرة لتمرير. في حال تم إتلاف infindibulum ، يجب أن تكون قناة البيض شرائح إما فتح أو ضغط من الأجنة.
   
   
3. تم العثور على الأجنة / البويضات في وسائل الإعلام من خلال التركيز FHM المجهر على قطرات الدهون التي غرقت في قاع الطبق بيتري. لا يمكن أن يتحقق جنين / البويضة في عزلة 20X لأن هذا يوفر مساحة أكبر من عرض التكبير عالية. جنين / البويضات تبدو وكأنها قطرات الدهون الجولة التي لها رنين واضحة حولها. يستخدم pipetting الفم ، وذلك باستخدام الزجاج وسحبت الشعرية ، لنقل الأجنة / البويضات لKSOM للحضانة والتلاعب أخرى.

الداخلي لاسترجاع سيت

إعداد

1. ذوبان الجليد وإعداد FHM kSOM.
2. وقبل ساعات قليلة ، kSOM مكان في حاوية استرجاع البيض ووضعه في خانة الطرف مع الماء في القاع ، في مكان CO ₂ الحاضنة.
3. تجلب أقفاص للمختبر وقتل الإناث الحصاد.
4. قطع قناة البيض والحرص على خفض بعض من المبيض والرحم بعض لضمان أن لا قطع جزء من قناة البيض.
5. المكان في وسائل الإعلام في طبق بتري FHM الصغيرة.
6. صب أكثر زوجين FHM أطباق بتري وسائل الإعلام لاستخدامها في التنظيف.

بيغ

1. استخدام إبرة بيغ (30 فظة قياس) متصلة مع نهاية الإبرة 1ml دوامة.
2. تأخذ واحدة قناة البيض في وقت وباستخدام إبرة ، تضاف إلى قمع عثر عليها بالقرب من جزء من المبيض الأيسر المرفقة. إذا تم تدمير وقمع لا يمكن استخدامها ، ثم اثنين ملقط اتخاذ اجراء واحدة من نهاية قناة البيض. مع forcep أخرى ، الضغط بلطف ، مثل أنبوب معجون الأسنان ، لإخراج أي من الجنين.
   
   ملاحظة : هذا سيخلق كمية كبيرة من الطعام في صحن بيتري ، والكثير من الأنسجة سيأتي معه ، لذا قد تحتاج إلى استخدام طبق بتري مختلفة بعد ذلك.
   
   
3. انظر إلى الأجنة ، والتركيز على قطع المجهر الدهون والبحث عن "قطعة من الدهون" دائرة مستديرة مع واضحة حولها.
   
   ملاحظة : قد تبدو الأجنة نفس الدهون ، لذلك قد يكون من الصعب العثور عليها. الأجنة تنزل الى القاع ، حتى ننظر هناك.
   
   
4. لا المسحات المهبلية للإناث المتلقية. في هذه المرحلة ، ينبغي أن تكون pseudopregnant.

Discussion

في هذه المقالة ، ونحن لشرح استرجاع البويضات من الاباضة بفعل Peromyscus (superovulated). استخدام فرط الإباضة (على العكس من دورة دقي الطبيعي) هو شائع نظرا لأعداد أكبر بكثير الناتجة عن ذلك. ومع ذلك ، يجب اتخاذ الحذر في تفسير نتائج استخدام هذه البويضات / الأجنة ، كما كل من الهرمونات المستخدمة للح?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flushing needle	Tool	Zephyrtronics	ZT5-130-L	30 G blunt
Forceps (2)	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5060
Peromyscus	Animal	Peromyscus Genetic Stock Center
Scissors	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5880
FHM HEPES Buffered Media	Reagent	Specialty Media	MR-025-d
KSOM Embryo Culture Medium (5x 10 mL)	Reagent	Specialty Media	MR-020P-5F
Mouth Pipette	Tool			Pulled from glass capillaries and attached to rubber tubing
Oocyte holding dish	Tool			Glass container with concave divets