Recuperación de los ovocitos de ratón

Resumen

Este protocolo se muestra la técnica para la extracción de los ovocitos o embriones en estadio temprano fertilizados del oviducto de los ratones. La capacidad de identificar la infindibulum e insertar una aguja de punta roma en que es esencial para la correcta realización del procedimiento.

Resumen

Hasta la fecha, sólo unos pocos estudios han informado de manipulaciones éxito de la embriogénesis Peromyscus o la biología reproductiva. Junto con el archivo Peromyscus Centro Genético (http://stkctr.biol.sc.edu), estamos caracterizando las diferencias relevantes necesarios para desarrollar este sistema. Un objetivo principal ha sido optimizar los ovocitos / recuperación temprana del embrión.

Protocolo

Los ovocitos / embriones de recuperación

1. Al menos dos horas antes de la recuperación de ovocitos / embriones, KSOM se coloca en el 37 º C incubadora de CO ₂ y FHM se deben descongelar a partir de -20 º. Un plato de vidrio que contiene tres pozos de poca profundidad cóncava se utiliza a las caídas de la casa de KSOM en la incubadora. Para prevenir la deshidratación, la KSOM y el plato se colocan en un recipiente con tapa que tiene el agua en la parte inferior. Este aparato evita la evaporación sin el uso de aceite mineral.
   
   
2. Los oviductos de una hembra ovula se colocan en los medios de FHM. Para garantizar una orientación y un infindibulum intacta, una pequeña sección del ovario se corta a lo largo de la sección del oviducto y pequeñas del útero. Un contundente 30 aguja se utiliza para expulsar a los ovocitos / embriones del oviducto mediante la inserción de la aguja de punta roma en el infindibulum. El infindibulum debe ser utilizado para recuperar los embriones desde el tubo de oviducto es demasiado pequeño para una aguja de pasar. En el caso de que el infindibulum se destruye, el oviducto debe ser tajo o embriones expulsados.
   
   
3. Ovocitos / embriones se encuentran en los medios de FHM, centrándose en el microscopio las gotas de grasa que se han hundido en la parte inferior de la placa de Petri. Los ovocitos / embriones aislamiento se puede lograr a 20x, ya que proporciona una mayor área de visualización de gran aumento. Embriones / ovocitos parecen ronda gotitas de grasa que tienen un claro anillo a su alrededor. Pipetear con la boca, con un vaso tirado capilar, se utiliza para mover ovocitos / embriones de KSOM para la incubación y su posterior manipulación.

Procedimiento para la recuperación de los ovocitos

Preparación

1. Descongele FHM y preparar KSOM.
2. Unas horas antes, KSOM colocarlo en un recipiente la extracción de óvulos y el lugar en el cuadro de la punta con agua en el fondo, lugar en incubadora de CO _2.
3. Traiga jaulas para el laboratorio y matar a las hembras de la cosecha.
4. Cortar el oviducto, teniendo cuidado de cortar algunos de los ovarios y algunos del útero para asegurarse de que no se cortó parte de oviducto.
5. Lugar en los medios de FHM en pequeña placa de Petri.
6. Vierta un par de placas de Petri FHM los medios de comunicación que se utilizarán para el lavado.

Flushing

1. Use una aguja de lavado (30 calibre romo) conectado a una aguja de 1 ml con final en espiral.
2. Tome un oviducto a la vez y con la aguja, insertar en infundíbulo encuentra cerca de la parte del ovario izquierdo adjunto. Si el infundíbulo se destruye y no se puede utilizar, luego tomar dos pinzas y sostener un extremo del oviducto. Con la pinza de otros, apriete suavemente, como un tubo de pasta de dientes, para expulsar el embrión.
   
   Nota: Esto creará una gran cantidad de desorden en la placa de Petri, ya que una gran cantidad de tejido se vienen con él, por lo que es posible que desee utilizar otra placa de Petri después.
   
   
3. Para ver los embriones, se centran en el microscopio de las piezas de grasa y buscar todo "pedazo de grasa" con el círculo claro que lo rodea.
   
   Nota: Los embriones tienen el mismo aspecto que la grasa, lo que puede ser difícil de encontrar. Los embriones se hunden hasta el fondo, a fin de buscar allí.
   
   
4. Hacer frotis vaginal de las hembras receptoras. En esta etapa, deben ser pseudopreñadas.

Discusión

En este artículo, se demuestra la recuperación de los ovocitos de la ovulación inducida (superovuladas) Peromyscus. El uso de superovulación (en comparación con el ciclo estral natural) es común debido a un número mucho mayor resultado. Sin embargo, se debe tener cuidado al interpretar los resultados de la utilización de ovocitos como / embriones, ya que tanto las hormonas utilizadas para inducir la ovulación y el cultivo puede tener efectos.

Cuando estro ha sido confirmado, las mujeres son euthenized y los oviductos se rec...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flushing needle	Tool	Zephyrtronics	ZT5-130-L	30 G blunt
Forceps (2)	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5060
Peromyscus	Animal	Peromyscus Genetic Stock Center
Scissors	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5880
FHM HEPES Buffered Media	Reagent	Specialty Media	MR-025-d
KSOM Embryo Culture Medium (5x 10 mL)	Reagent	Specialty Media	MR-020P-5F
Mouth Pipette	Tool			Pulled from glass capillaries and attached to rubber tubing
Oocyte holding dish	Tool			Glass container with concave divets