איחזור של ביציות עכבר

Summary

פרוטוקול זה ממחיש את הטכניקה עבור ביציות לחילוץ או בשלב מוקדם, עוברים מן oviduct מופרית של עכברים. היכולת לזהות את infindibulum והכנס מחט סוף בוטה לתוך זה הכרחי נכון לבצע את ההליך.

Abstract

נכון להיום, רק מעט מחקרים דיווחו על מניפולציות מוצלחת של העובר Peromyscus או לביולוגיה של הרבייה. יחד עם מאגר גנטי Peromyscus מרכז (http://stkctr.biol.sc.edu), אנחנו המאפיינת את ההבדלים הבולטים צורך לפתח את המערכת. המטרה העיקרית הייתה לייעל את הביצית / אחזור העובר המוקדם.

Protocol

העובר / הביצית אחזור

1. לפחות שעתיים לפני שליפה של עוברים / ביציות, KSOM ממוקם 37 º C-CO ₂ החממה FHM חייב להיות מופשר מ -20 °. צלחת זכוכית המכיל שלוש בארות רדודות קעור משמש טיפות הבית של KSOM בחממה. כדי למנוע התייבשות, KSOM ואת צלחת ממוקמים במכולה עפעפיים כי יש מים בתחתית. מנגנון זה מונע אידוי ללא שימוש של שמן מינרלי.
   
   
2. Oviducts מן הנקבה מבייצת ממוקמים התקשורת FHM. כדי להבטיח התמצאות infindibulum שלם, קטע קטן של השחלה הוא חתך יחד עם הסעיף oviduct קטן של הרחם. מחט קהה 30 מד משמש לגרש עוברים / ביציות מן oviduct על ידי החדרת מחט לתוך infindibulum בוטה. Infindibulum יש להשתמש כדי לאחזר את העוברים מאז צינורות oviduct קטן מדי עבור מחט לעבור. במקרה infindibulum נהרס, oviduct חייב להיות פרוס או פתוח או עוברים סחט.
   
   
3. עוברים / ביציות נמצאים בתקשורת FHM ידי התמקדות מיקרוסקופ על טיפות שומן אשר שקעו לתחתית צלחת פטרי. העובר / בידוד הביצית יכולה להיות מושגת על 20x כמו זה מספק שטח צפייה גדול יותר בהגדלה גבוהה. העובר / ביציות נראים כמו טיפות שומן עגול, כי יש טבעת ברור סביבו. Pipetting הפה, בעזרת כוס משך נימי, משמש להעברת עוברים / ביציות כדי KSOM עבור הדגירה ומניפולציה נוספת.

נוהל אחזור הביצית

הכנה

1. הפשירי FHM ולהכין kSOM.
2. כמה שעות קודם לכן, kSOM מקום בתוך מכולה ביצה אחזור ומקום בתיבת טיפ עם מים בתחתית, מקום CO ₂ באינקובטור.
3. מביאים כלובים למעבדה להרוג את הנקבות קציר.
4. חותכים את oviduct נזהר לחתוך חלק השחלה וחלק של הרחם כדי לוודא שאתה לא כורתים חלק oviduct.
5. מקום בתקשורת FHM בצלחת פטרי קטנות.
6. יוצקים כמה FHM יותר בתקשורת צלחות פטרי לשמש שטיפה.

הסמקה

1. שימוש במחט שטיפה (30 מד בוטה) מחובר מחט 1ml עם סוף ספירלה.
2. קח אחד oviduct בכל פעם, באמצעות מחט, להכניס לתוך משפך נמצא ליד החלק של השחלה השמאלית מחוברת. אם משפך הוא נהרס ולא ניתן להשתמש בו, ואז לקחת שני מלקחיים והחזק קצה אחד של oviduct. עם המלקחיים השני, ללחוץ בעדינות, כמו שפופרת משחת שיניים, כדי להוציא כל העובר של.
   
   הערה: פעולה זו תיצור כמות גדולה של בלגן בצלחת פטרי, כמו הרבה רקמות יבוא עם זה, ולכן מומלץ להשתמש בצלחת פטרי שונה לאחר מכן.
   
   
3. כדי לראות את העוברים, להתמקד מיקרוסקופ על פיסות שומן לחפש "חתיכת שומן" עגול עם עיגול מסביב זה ברור.
   
   הערה: יש העוברים את המראה כמו השומן, כך שהוא עשוי להיות קשה למצוא. עוברים לשקוע לתחתית, כך נראה שם.
   
   
4. האם מריחות הנרתיק של נקבות הנמען. בשלב זה, הם צריכים להיות pseudopregnant.

Discussion

במאמר זה, אנחנו מדגימים שליפה של ביציות מן הביוץ המושרה (superovulated) Peromyscus. השימוש superovulation (לעומת מחזור הייחום טבעי) נפוץ בשל המספרים וכתוצאה מכך הרבה יותר. עם זאת, זהירות יש לנקוט בפרשנות התוצאות ניצול כזה ביציות / עוברים, כמו גם בשימוש בהורמונים כדי לגרום הביוץ culturing עשויה להיות השפ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flushing needle	Tool	Zephyrtronics	ZT5-130-L	30 G blunt
Forceps (2)	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5060
Peromyscus	Animal	Peromyscus Genetic Stock Center
Scissors	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5880
FHM HEPES Buffered Media	Reagent	Specialty Media	MR-025-d
KSOM Embryo Culture Medium (5x 10 mL)	Reagent	Specialty Media	MR-020P-5F
Mouth Pipette	Tool			Pulled from glass capillaries and attached to rubber tubing
Oocyte holding dish	Tool			Glass container with concave divets