Fare Oosit alımı

Özet

Bu protokol, farelerde yumurtalık açılan oosit ve erken evre döllenmiş embriyolar tekniği göstermektedir. Infindibulum belirlemek ve künt bir sonu iğne içine girmek için doğru işlemi gerçekleştirmeden yeteneği esastır.

Özet

Bugüne kadar, sadece birkaç çalışma Peromyscus embriyogenez veya üreme biyolojisi başarılı manipülasyonlar bildirdin. Peromyscus Genetik Stock Merkezi (http://stkctr.biol.sc.edu) ile birlikte, biz bu sistemi geliştirmek için gerekli belirgin farklılıklar karakterize edilir. Oosit / erken embriyo alma optimize etmek için öncelikli bir hedef olmuştur.

Protokol

Embriyo / Oosit alımı

1. Embriyolar / oosit alımı öncesinde en az iki saat, 37 º C CO ₂ kuvöz ve FHM KSOM yerleştirilir -20 ° çözülmüş olmalıdır. Üç içbükey sığ kuyulardan içeren bir cam tabak inkübatör KSOM ev damla kullanılır. Dehidratasyonu önlemek için, KSOM ve çanak alt kısmında su kapaklı bir kap konur. Bu cihaz, madeni yağ kullanılmadan buharlaşmasını önler.
   
   
2. Yumurtladığımı kadın siyon hatası FHM medya yerleştirilir. Yönelim ve sağlam bir infindibulum sağlamak için, bir yumurtalık, rahim, yumurtalık ve küçük bir bölümü ile birlikte küçük bir bölümü kesilir. Künt 30 iğne künt iğne infindibulum içine sokarak yumurtalık embriyolar / oosit dışarı atmak için kullanılır. Yumurtalık boru geçirmek için bir iğne için çok küçük olduğundan infindibulum embriyolar almak için kullanılması gerekir. Infindibulum tahrip olması halinde, yumurtalık ya da açık dilimlenmiş veya embriyolar sıkılmış olmalıdır.
   
   
3. Embriyolar / oosit Mikroskop Petri kabı dibine batırdı yağ damlacıkları üzerine odaklanarak FHM medya bulundu. Bu, yüksek büyütme daha geniş bir görüş alanı sağlar olarak embriyo / oosit izolasyonu 20x elde edilebilir. Embriyo / oosit çevresinde açık bir halka var yuvarlak yağ damlacıkları gibi görünüyorsun. Çekilmiş bir cam kapiller kullanarak Ağız pipetleme, kuluçka ve daha fazla manipülasyon için KSOM embriyo / oosit taşımak için kullanılır.

Oosit Alma Usulü

Hazırlık

1. FHM çözülme ve kSOM hazırlamak.
2. Birkaç saat önce, yer altındaki su ile ucu kutusu, CO ₂ kuvöz yerine yumurta kabı ve yeri kSOM.
3. Laboratuara kafesleri getirin ve hasat kadın öldürmek.
4. Yumurtalık yumurtalık parçası kesilmiş olmadığını sağlamak için bazı yumurtalık ve rahim kesmek için dikkatli olmak Kes.
5. Küçük Petri kabındaki FHM medya yerleştirin.
6. Ateş basması için kullanılan bir çift daha FHM medya Petri kutularına dökün.

Flushing

1. Spiral ucu ile bir 1ml iğne bağlanan bir kızarma iğne (30 ölçer künt) kullanın.
2. Yumurtalık parçası takılı kalmış yanında bulundu infundibulum takın, bir yumurtalık, bir zaman ve iğne kullanarak çekin. Infundibulum yok ve olamaz, daha sonra iki forseps almak ve Boruların bir ucundan tutun. Diğer forsepsle ile hafifçe herhangi bir embriyonun çıkarmak için, bir diş macunu tüpü gibi sıkmak.
   
   Not: Bu, bir çok doku ile gelecek büyük miktarda Petri kabındaki karışıklık yaratacak, böylece daha sonra farklı bir Petri kabı kullanmak isteyebilirsiniz .
   
   
3. , Embriyoların mikroskop yağ parçaları üzerinde odak ve net bir daire ile etrafında yuvarlak "yağ parçası" aramak için.
   
   Not: embriyolar yağ olarak aynı görünüme sahip, bu yüzden bulmak zor olabilir. Embriyolar dibine çöker, bu nedenle orada bak.
   
   
4. Alıcı kadın vajinal smear yapın. Bu aşamada, pseudopregnant olmalıdır.

Tartışmalar

Bu makalede, yumurtlama indüklenen (süperovulasyon) Peromyscus oosit alma göstermektedir. Süperovulasyon (doğal östrus döngüsü karşı) kullanımı nedeniyle çok daha fazla çıkan numaraları yaygındır. Ancak, yumurtlama ve kültür ikna etmek için kullanılan hormonlar etkileri olabilir, bu oosit / embriyoların kullanarak sonuçları yorumlanırken dikkatli alınmalıdır.

Östrus onaylandığı zaman, kadınlarda euthenized ve siyon hatası yumurtalık küçük bir bölümünü birlikte kurtarıldı. Over küçük b...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flushing needle	Tool	Zephyrtronics	ZT5-130-L	30 G blunt
Forceps (2)	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5060
Peromyscus	Animal	Peromyscus Genetic Stock Center
Scissors	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5880
FHM HEPES Buffered Media	Reagent	Specialty Media	MR-025-d
KSOM Embryo Culture Medium (5x 10 mL)	Reagent	Specialty Media	MR-020P-5F
Mouth Pipette	Tool			Pulled from glass capillaries and attached to rubber tubing
Oocyte holding dish	Tool			Glass container with concave divets