Recuperação de oócitos de camundongos

Resumo

Este protocolo ilustra a técnica para extrair óvulos ou embriões em estágio inicial fertilizado do oviduto de camundongos. A capacidade de identificar o infindibulum e inserir uma agulha na extremidade sem corte, é essencial a correta execução do procedimento.

Resumo

Até o momento, poucos estudos têm relatado manipulações sucesso da embriogênese Peromyscus ou biologia reprodutiva. Juntamente com o Peromyscus genética de Stock Center (http://stkctr.biol.sc.edu), estamos caracterizando as diferenças importantes necessários para desenvolver este sistema. A meta principal tem sido a de otimizar oócito / recuperação embrionária precoce.

Protocolo

Embrião / oócito de recuperação

1. Pelo menos duas horas antes da recuperação de embriões / óvulos, KSOM é colocado na 37 º C incubadora de CO ₂ e FHM devem ser descongeladas de -20 °. Um prato de vidro contendo três poços rasos côncava é usada para casa de gotas KSOM na incubadora. Para evitar a desidratação, o KSOM e prato são colocados em um recipiente com tampa que tem água no fundo. Este aparelho evita a evaporação, sem o uso de óleo mineral.
   
   
2. As tubas uterinas de uma fêmea a ovular são colocados na mídia FHM. Para garantir a orientação e um infindibulum intacto, uma pequena seção do ovário é cortado juntamente com a seção de oviduto e pequenas do útero. A agulha de calibre blunt 30 é utilizado para expulsar embriões / óvulos do oviduto, inserindo a agulha com no infindibulum. O infindibulum deve ser usado para recuperar os embriões já que a tubulação oviduto é pequena demais para uma agulha para passar. No caso em que o infindibulum é destruído, o oviduto deve ser cortado aberto ou embriões espremido.
   
   
3. Embriões / óvulos são encontrados na mídia FHM, concentrando-se o microscópio sobre a gotículas de gordura que têm afundado até o fundo da placa de Petri. Embrião / óvulo isolamento pode ser obtida em 20x, pois isso proporciona uma maior área de visualização de alta ampliação. Embrião / ovócitos parece rodada gotículas de gordura que tem um anel claro em torno dele. Pipetar à boca, usando um copo puxado capilar, é usado para mover os embriões / óvulos para KSOM para incubação e de manipulação posterior.

Procedimento para a recuperação de oócitos

Preparação

1. Descongelar FHM e preparar KSOM.
2. Poucas horas antes, KSOM colocados no recipiente de recuperação de ovo e coloque na caixa de ponta com água no fundo, coloque na incubadora de CO _2.
3. Traga gaiolas para o laboratório e matar as fêmeas colheita.
4. Cortar o oviduto tendo o cuidado de cortar algumas do ovário e alguns do útero para garantir que você não cortou parte do oviduto.
5. Lugar na mídia FHM em placa de Petri pequena.
6. Despeje mais um par de pratos FHM media Petri a ser utilizada para a descarga.

Flushing

1. Use uma agulha de lavagem (30 gauge blunt) conectada a uma agulha de 1ml, com fim em espiral.
2. Tome um oviduto em um tempo e usando agulha, inserir no infundíbulo encontrado perto da parte do ovário esquerdo anexado. Se o infundíbulo é destruído e não pode ser usado, em seguida, tomar duas pinças e segure uma extremidade do oviduto. Com a pinça outro, aperte delicadamente, como um tubo de creme dental, para ejetar qualquer do embrião.
   
   Nota: Isto irá criar uma grande quantidade de sujeira na placa de Petri, como um monte de tecido virá com ele, assim que você pode querer usar uma placa de Petri diferente depois.
   
   
3. Para ver os embriões, o foco do microscópio em pedaços de gordura e procure por "pedaço de gordura" círculo redondo com clara em torno dele.
   
   Nota: Os embriões têm a mesma aparência que a gordura, por isso pode ser difícil de encontrar. Os embriões vão para o fundo, assim que olhar lá.
   
   
4. Fazer esfregaços vaginais de fêmeas destinatário. Nesta fase, devem ser pseudopregnant.

Discussão

Neste artigo, demonstramos a recuperação de ovócitos de ovulação induzida (superovuladas) Peromyscus. O uso de superovulação (em oposição ao ciclo estral natural) é comum, devido ao número muito maior resultante. No entanto, o cuidado deve ser tomado na interpretação dos resultados utilizando oócitos tais / embriões, já que ambos os hormônios usados ​​para induzir a ovulação e cultura podem ter efeitos.

Quando estral foi confirmado, as fêmeas são euthenized e tubas uterinas recuperados, juntamente com uma pe...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flushing needle	Tool	Zephyrtronics	ZT5-130-L	30 G blunt
Forceps (2)	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5060
Peromyscus	Animal	Peromyscus Genetic Stock Center
Scissors	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5880
FHM HEPES Buffered Media	Reagent	Specialty Media	MR-025-d
KSOM Embryo Culture Medium (5x 10 mL)	Reagent	Specialty Media	MR-020P-5F
Mouth Pipette	Tool			Pulled from glass capillaries and attached to rubber tubing
Oocyte holding dish	Tool			Glass container with concave divets