检索小鼠卵母细胞

摘要

该协议说明了从小鼠的输卵管中提取卵母细胞或早期胚胎受精技术。能够识别infindibulum和钝年底针插入正确执行的程序是必不可少的。

摘要

迄今为止，只有少数的研究报告Peromyscus胚胎发育或生殖生物学的成功操作。连同Peromyscus遗传联合中心（http://stkctr.biol.sc.edu），我们需要制定本系统的显着差异特征。一个主要目标，以优化的卵母细胞/早期胚胎的检索。

研究方案

胚胎/取卵

1. 必须从-20 °解冻胚胎/卵母细胞的检索至少两个小时前，KSOM放置在37 ° C _共 2孵化器和FHM的。一个玻璃盘，其中包含三个凹浅水井是用来房子KSOM滴在孵化器。为了防止脱水，KSOM和菜都放置在有盖的容器，在底部的水。该仪器可以防止不使用矿物油的蒸发。
   
   
2. 从排卵期女性输卵管被放置在FHM媒体。要确保的方向和一个完整的infindibulum，一个卵巢的一小部分被切断与子宫输卵管和一小部分。 30钝的针头是用来驱逐infindibulum钝针插入输卵管胚胎/卵母细胞。 infindibulum必须用于检索的胚胎，因为输卵管通过针管太小。 infindibulum是在破坏事件，输卵管必须切片打开或胚胎挤掉。
   
   
3. 在FHM的媒体集中在培养皿的底部有沉没的脂肪滴在显微镜，胚胎/卵母细胞。胚胎/卵母细胞隔离可以实现，因为这提供了更大的可视面积比高倍率在20倍。胚胎/卵母细胞看起来像一轮脂肪滴，它周围有一个明确的环。口移液，用一把拉住玻璃毛细管，用于移动胚胎/卵母细胞，孵化和进一步操纵KSOM。

取卵的程序

制备

1. 解冻FHM杂志和准备KSOM。
2. 几个小时前，放置在容器中，提示框放置在底部的水_，二氧化碳培养箱取卵KSOM 。
3. 笼实验室和杀死收获的女性。
4. 剪下输卵管被小心地削减一些卵巢和子宫，以确保你不切断输卵管的一部分。
5. 小培养皿放置在FHM的媒体。
6. 倒入一对夫妇更FHM杂志媒体的Petri用于冲厕的菜。

法拉盛

1. 使用螺旋年底到1毫升针连接冲洗针（规格30冲服）。
2. 的时间和使用针输卵管，左连接部分卵巢附近发现漏斗插入。如果漏斗被破坏，无法使用，然后采取两个钳，保持输卵管的一端。其他forcep，轻轻挤压，像牙膏，弹出任何胚胎的。
   
   注：这将创建一个在培养皿中的大量乱七八糟的，很多组织将用它来 ​​，所以你可能要使用不同的培养皿中，事后。
   
   
3. 看到胚胎，脂肪件重点放在显微镜和一轮的“一块肥肉”，围绕它的清晰的圆圈。
   
   注：胚胎有相同的外观为脂肪，因此它可能很难找到。胚胎沉底，所以在那里寻找。
   
   
4. 受援国女性阴道细胞涂片。在这个阶段，他们应该是假孕。

讨论

在这篇文章中，我们展示了从排卵诱导（超排）Peromyscus的卵母细胞的检索。利用超数排卵（相对于自然发情周期）是常见的，由于导致数字更大。然而，必须采取谨慎解释结果，利用这样的卵母细胞/胚胎，激素用于诱导排卵和培养可能有特效。

当发情已证实，女性euthenized和输卵管与卵巢的一小部分一起回收。卵巢小区域被用作infindibulum的位置的标记。 infindibulum坐在旁边卵巢，经常通过组织一层薄薄的预?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flushing needle	Tool	Zephyrtronics	ZT5-130-L	30 G blunt
Forceps (2)	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5060
Peromyscus	Animal	Peromyscus Genetic Stock Center
Scissors	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5880
FHM HEPES Buffered Media	Reagent	Specialty Media	MR-025-d
KSOM Embryo Culture Medium (5x 10 mL)	Reagent	Specialty Media	MR-020P-5F
Mouth Pipette	Tool			Pulled from glass capillaries and attached to rubber tubing
Oocyte holding dish	Tool			Glass container with concave divets