Récupération des ovocytes de souris

Résumé

Ce protocole illustre la technique d'extraction ou d'ovocytes à un stade précoce des embryons fertilisés de l'oviducte de la souris. La capacité à identifier les infindibulum et insérer une aiguille extrémité émoussée en elle est essentielle à l'exécution correcte de la procédure.

Résumé

À ce jour, seules quelques études ont rapporté des manipulations de succès de l'embryogenèse Peromyscus ou biologie reproductive. En collaboration avec le Centre de Peromyscus stock génétique (http://stkctr.biol.sc.edu), nous caractérisons les différences saillantes nécessaires pour développer ce système. Un premier objectif a été d'optimiser ovocyte / récupération précoce de l'embryon.

Protocole

Embryon / ovocytes de récupération

1. Au moins deux heures avant le prélèvement des ovocytes / embryons, KSOM est placé dans les 37 º C incubateur à CO ₂ et FHM doivent être décongelés à partir de -20 °. Un plat en verre contenant trois concaves puits peu profonds sont utilisés à des gouttes maison de KSOM dans l'incubateur. Pour prévenir la déshydratation, l'KSOM et le plat sont placés dans un conteneur à couvercle qui a l'eau au fond. Cet appareil empêche l'évaporation sans l'utilisation d'huile minérale.
   
   
2. Les oviductes d'une femelle ovulation sont placées dans les médias FHM. Pour assurer l'orientation et une infindibulum intacte, une petite section de l'ovaire est coupé avec la section oviducte et petits de l'utérus. Une aiguille de calibre 30 émoussée est utilisée pour expulser ovocytes / embryons de l'oviducte en insérant l'aiguille émoussée dans le infindibulum. Le infindibulum doit être utilisée pour récupérer les embryons depuis le tube oviducte est trop petit pour une aiguille à passer. Dans le cas où l'infindibulum est détruit, l'oviducte doit être soit éventrés ou des embryons évincés.
   
   
3. Ovocytes / embryons sont trouvés dans les médias FHM en concentrant le microscope sur les gouttelettes de graisse qui ont coulé au fond de la boîte de Pétri. Embryon / ovocyte isolement peut être réalisé à 20x car cela offre une plus grande surface de visionnement que fort grossissement. Embryon / ovocytes ressemblent rondes gouttelettes de graisse qui ont un anneau clair autour de lui. Pipetage à la bouche, en utilisant un verre tiré capillaire, est utilisé pour déplacer ovocytes / embryons d'KSOM d'incubation et de manipulations ultérieures.

Procédure de récupération d'ovocytes

Préparation

1. Dégel FHM et préparer kSOM.
2. Quelques heures plus tôt, kSOM placer dans un récipient de récupération d'œuf et placer dans la boîte de la pointe avec de l'eau dans le fond, placer en incubateur à CO _2.
3. Apportez des cages au laboratoire et de tuer les femelles récolte.
4. Découpez l'oviducte en prenant soin de couper une partie de l'ovaire et certains de l'utérus pour s'assurer que vous ne coupez pas partie de l'oviducte.
5. Placer dans les médias FHM en petite boîte de Petri.
6. Verser un couple plus FHM médias boîtes de Pétri à être utilisé pour le rinçage.

Flushing

1. Utiliser une aiguille de rinçage (30 émoussée jauge) connecté à une aiguille à bout 1ml spirale.
2. Prendre un oviducte à la fois et en utilisant l'aiguille, insérez-le dans infundibulum trouvé près de la partie de l'ovaire gauche ci-joint. Si l'infundibulum est détruit et ne peut pas être utilisé, puis prendre deux pinces et maintenez une extrémité de l'oviducte. Avec la pince autre, presser doucement, comme un tube de dentifrice, pour éjecter toute l'embryon.
   
   Note: Ceci créera une grande quantité de désordre dans la boîte de Pétri, comme beaucoup de tissu viendra avec elle, de sorte que vous pouvez utiliser un plat différent de Pétri par la suite.
   
   
3. Pour voir les embryons, l'accent sur les morceaux de gras de microscope et rechercher des rondes "morceau gras" avec cercle clair autour de lui.
   
   Remarque: Les embryons ont le même aspect que la graisse, donc il peut être difficile à trouver. Les embryons couler au fond, alors regardez là-bas.
   
   
4. Ne frottis vaginaux de femelles receveuses. A ce stade, ils devraient être pseudogravides.

Discussion

Dans cet article, nous démontrons la récupération d'ovocytes à partir de l'ovulation induite (superovulation) Peromyscus. L'utilisation de superovulation (par opposition à cycle œstral naturel) est commune en raison du nombre beaucoup plus important qui en résulte. Cependant, il faut être prudent dans l'interprétation des résultats en utilisant des ovocytes de telles / embryons, à la fois comme les hormones utilisées pour induire l'ovulation et la culture peuvent avoir des effets.

Lorsque œstral a é...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flushing needle	Tool	Zephyrtronics	ZT5-130-L	30 G blunt
Forceps (2)	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5060
Peromyscus	Animal	Peromyscus Genetic Stock Center
Scissors	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5880
FHM HEPES Buffered Media	Reagent	Specialty Media	MR-025-d
KSOM Embryo Culture Medium (5x 10 mL)	Reagent	Specialty Media	MR-020P-5F
Mouth Pipette	Tool			Pulled from glass capillaries and attached to rubber tubing
Oocyte holding dish	Tool			Glass container with concave divets